质谱测序及第三代测序
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6、读长。三代测序读长很高，可以达到3000bp，测序速度约10bp/s；质谱测序只能针对小片段的多肽，在20个氨基酸左右。
7、修饰。都可以检测发生的修饰。三代测序通过核苷酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。
8、精度。三代测序单次准确度约85%，重复测序可是准确率达到99.9999%；质谱测序准确率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。
第三代测序
测序技术在近几年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
SMRT（single molecule Real-Time）测序技术
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到Biblioteka Baidu各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子.每种断裂类型分别生成互补的两种离子,如a-x,b-y,c-z。最常见的是a型离子、b型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
蛋白分离鉴定技术
基于色谱技术的二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术，基于质谱技术的质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。
另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单又便宜，理论上可以直接测序RNA。纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。
图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。
该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)的纳米结构中完成。这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理如图所示。
4、原理。三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷质比的差异进行区分。
5、检测方法。三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核苷酸对应不同信号，信号时间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。
蛋白分析新技术
超高分辨率显微技术
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
测序技术比较
1、目的。两种方法都是为了进行测序。
2、对象。都是生物细胞产物。三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需要PCR扩增，分析单一的核苷酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。
3、结果。获得目的片段的序列。三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。两者序列可以相互换算验证。
第三代测序技术与质谱测序技术的
介绍和比较
质谱蛋白测序
质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍，使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意义。
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。
7、修饰。都可以检测发生的修饰。三代测序通过核苷酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。
8、精度。三代测序单次准确度约85%，重复测序可是准确率达到99.9999%；质谱测序准确率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。
第三代测序
测序技术在近几年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
SMRT（single molecule Real-Time）测序技术
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到Biblioteka Baidu各肽段质量数差值推定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子.每种断裂类型分别生成互补的两种离子,如a-x,b-y,c-z。最常见的是a型离子、b型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
蛋白分离鉴定技术
基于色谱技术的二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术，基于质谱技术的质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。
另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单又便宜，理论上可以直接测序RNA。纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。
图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。
该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)的纳米结构中完成。这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测序原理如图所示。
4、原理。三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷质比的差异进行区分。
5、检测方法。三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核苷酸对应不同信号，信号时间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。
蛋白分析新技术
超高分辨率显微技术
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
测序技术比较
1、目的。两种方法都是为了进行测序。
2、对象。都是生物细胞产物。三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需要PCR扩增，分析单一的核苷酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。
3、结果。获得目的片段的序列。三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。两者序列可以相互换算验证。
第三代测序技术与质谱测序技术的
介绍和比较
质谱蛋白测序
质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍，使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意义。
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。