染色质免疫沉淀及其测序课件
实验染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南
实验染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生。
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前最常用研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
实验准备实验材料：细胞样品试剂、试剂盒：甲醛、甘氨酸、PBS、SDS Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒仪器、耗材：离心管、超声仪、电泳仪、离心机ChIP的一般流程甲醛处理细胞→ 收集细胞，超声破碎→ 加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→ 加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→ 对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→ 洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→ 解交联，纯化富集的DNA-片断→ PCR分析。
请ChIp具体操作流程：第一天（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
免疫沉淀试验PPT课件
淀现象。
.
3
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
.
4
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验
免疫扩散试验
絮状沉淀试验
免疫电泳技术
免疫浊度测定
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5
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
第六章 免疫沉淀试验
.
1
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
.
2
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
.
46
电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝 固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。
.
47
蛋白质的两性解离性质：
--NH2 + H2O
--NH3+ + OH-
--COOH
--COO- +H+
.
75
.
57
（三）免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散
1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼
不可见的若干区带
2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，
加入相应抗血清进行双向扩散
《免疫共沉淀》课件
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析
染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。
这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。
早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。
甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。
非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。
有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。
该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。
使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。
提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。
甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。
甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。
甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。
这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。
这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。
这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。
图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。
此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。
染色质免疫共沉淀实验
一、染色质免疫共沉淀简介真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
二、ChIP的一般流程甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
三、PCR分析ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。
研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
染色质免疫共沉淀技术的应用领域
01
02
03
基因转录调控研究
通过染色质免疫共沉淀技 术可以研究转录因子与 DNA的相互作用，揭示基 因转录调控的机制。
表观遗传学研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究DNA甲基化、 组蛋白修饰等表观遗传学 标记与基因表达的关系。
疾病机制研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究与疾病相关的 基因表达调控，为疾病诊 断和治疗提供新的思路。
染色质免疫共沉淀技术的定义
染色质免疫共沉淀技术是一种用于研究DNA与蛋白质相互作用的实验技术，通过 将特定的蛋白质与DNA结合，再利用抗体的特异性结合将DNA与蛋白质复合物 沉淀下来，从而实现对DNA与蛋白质相互作用的研究。
该技术利用抗原-抗体反应的高度特异性，能够特异性的富集目的DNA-蛋白质复 合物，为深入研究基因转录调控、表观遗传学等领域提供了有力工具。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是 一种将荧光素酶标记技术与染色质免 疫共沉淀技术相结合的实验方法，通 过同时对两种不同的蛋白质进行荧光 素酶标记和染色质免疫共沉淀，实现 对两种蛋白质与DNA相互作用的检 测。
VS
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原 理具有高灵敏度、高特异性和高分辨 率等优点，可以用于研究基因表达调 控、表观遗传学和肿瘤发生发展等领 域。
数据分析与解读
数据标准化
生物信息学分析
将实验数据与对照组数据进行标准化 处理，消除实验误差，使数据具有可 比性。
结合生物信息学方法，对实验数据进 行深入挖掘，发现潜在的生物学意义 和功能。
差异分析
比较不同条件下的荧光素酶活性，分 析荧光素酶表达的差异，从而推断出 目标蛋白对基因转录的调控作用。
《免疫共沉淀》课件
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合
《染色质免疫沉淀》课件
染色质免疫沉淀的操作相对复杂，需要合适 的抗体选择和前期的校验步骤，而且成本较 高。
结论
染色质免疫沉淀是一种重要的分子生物学实验技术，通过研究蛋白质与DNA 的相互作用，有助于我们深入了解基因表达调控和疾病相关基因的发现。
它可以帮助我们理解基因表达调控、染色质 结构和功能等重要生物学过程。
工作原理
1 抗体-抗原相互作用原理
染色质免疫沉淀利用抗体特异性地结合目标蛋白质，从而将其与DNA结合的蛋白质-DNA 复合物进行沉淀分离。2 抗体选 Nhomakorabea和特异性检测
选择合适的抗体非常重要，以确保免疫沉淀的特异性和准确性。
实验步骤
1
细胞取材和交联
首先，需要获取待研究的细胞样本，并使用交联剂将细胞DNA与蛋白质交联在一起。
2
细胞裂解和染色质片段化
接下来，将细胞裂解，使染色质得以释放，并通过酶切等方法将染色质分成小片段。
3
蛋白质-DNA复合物的免疫沉淀
然后，使用特定的抗体将目标蛋白质与DNA复合物免疫沉淀下来。
4
DNA析出和PCR扩增
《染色质免疫沉淀》PPT 课件
染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种重要的分子 生物学实验技术，用于研究基因表达调控和疾病相关基因的发现。
介绍
1 什么是染色质免疫沉淀？
染色质免疫沉淀是一种实验技术，用于研究 蛋白质与DNA之间的相互作用。
2 染色质免疫沉淀的作用是什么？
最后，通过去除蛋白质并进行DNA析出，可以获得与目标蛋白质相结合的DNA片段，并进行 进一步的PCR扩增等分析。
应用
1 用于研究基因表达调控、染色质结构和功能等
免疫共沉淀原理和注意事项培训ppt课件
免疫共沉淀原理和注意事项
8
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子， PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液 (去除非特异性蛋白背景)
↓
离心去PA珠子，取上清
↓
测蛋白浓度 (BCA法)
↓
加一抗反应(4℃过夜)
↓
加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜)
↓
离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍
2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用 Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度
免疫共沉淀原理和注意事项
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裂解液成分
国内博士：
细胞裂解液： 50mM Tris-HC (lpH7.5)，
150 mM NaCl, 0.5%NP-40,
1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail (混合物)。
ECL 试剂 +
一抗
一抗
二 抗 ( 辣 根 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG)
一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
免疫共沉淀原理和注意事项
X光片曝光显影
ECL
12
CO-IP与质谱分析流程
免疫共沉淀原理和注意事项
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三 实验的关键
v 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 v 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
剂，低温下进行实验。
v 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不 能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多 则抗原被稀释。
染色质免疫沉淀及其测序课件
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3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物
4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA） 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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二、原理
染色质免疫沉淀技术 （chromatin
immunoprecipitation assay, ChIP）的基本原理是在活细 胞状态下把细胞内的蛋白质和 DNA交联，超声波将其随机 切断为一定长度范围内的染色 质小片段，然后用所研究的目 的蛋白质特异性抗体免疫沉淀 蛋白质-DNA复合体，从而特 异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段。
具 体 步 骤
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2、染色质超声断裂
▪ 1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。 每1min颠倒摇动一次离心管。
▪ 2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰 上。(不同样本都进行超声条件优化实验)
▪ 3.14000rpm离心10min(4℃)，转移上清于 1.5ml离心管。
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▪ 2、交联的条件
▪ 交联所用的甲醛终浓度约为 1%，而交联时 间需要预实验来确定。通常的交联条件为 室温10 min。甲醛的交联反应可被加入的 甘氨酸终止。交联时间如果过长，细胞染 色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果， 而且实验材料也容易在离心过程中丢失。 交联时间如果过短，则交联不完全，产生 假阴性。
染色质免疫沉淀法
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注意
2、蛋白样品： 材料：细胞—纯度高；组织—杂蛋白。 用专用核蛋白抽提试剂。 核蛋白的浓度：1μg/μl以上。 蛋白样品用量: 一般2-20μg。
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应用
最初用于研究DNA结合蛋白。 目前已用于研究RNA结合蛋白和特定
的RNA序列的相互作用。
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第二部分 凝胶电泳迁移率改变分析
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原理
凝胶电泳的电场作 用下，小分子DNA 片段比其结合了蛋 白质的DNA片段向 阳极移动的速度快。
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步骤
标记短的双链DNA片段，将其与蛋白质混合， 对混合物进行凝胶电泳，再放射性自显影，就 可找到DNA结合蛋白 。
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注意
1、探针：
32P同位素：放射性、半衰期14天。 地高辛标记：灵敏度弱，信号不行。 生物素标记：配合化学发光技术，
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应用
EMSA特异性好，是研究转录调 控蛋白和相应核苷酸序列结合的常用 方法，常用来鉴定其他方法筛选出的 结果。
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EMSA结果举例
1. DNA + no protein 2. DNA + non-interacting protein 3. DNA + interacting protein
57
第一步：固定
注意： 1、细胞状况好：75%-80%；106个/管。 2、甲醛终浓度为1%。 3、交联时间：5分钟-1个小时、
不过长不过短。
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第二步：染色质断裂
用化学（ 酶） 或 者机械（ 超声波） 的手段将其随机 切断为一定长度 范围内的染色质 小片段。
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第二步：染色质断裂
注意： 1、超声破碎冰上，时断时续超声程序。 2、探头要尽量深入管中，不触管底或侧壁。 3、总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 4、超声处理液: 蛋白酶抑制剂、浑浊—透明。 5、预实验摸索条件：10次/秒、3-4次。
染色质免疫沉淀_测序_全基因组范围研究蛋白质_DNA相互作用的新技术
摘要 染色质免疫沉淀 － 测序（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）是近年来新兴的将染色质免疫沉淀（ＣｈＩＰ）与深度测序技术相结合，在全基因组范围内 分析 ＤＮＡ 结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位和 ＤＮＡ 甲基化的高通量技术．在新一代测序（ＮＧＳ）技术的大力推动 下，ＣｈＩＰ－ｓｅｑ 提供了一种相对于 ＣｈＩＰ－ｃｈｉｐ 高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究方法．随着测序成本的降低，ＣｈＩＰ－ｓｅｑ 逐步 成为研究基因调控和表观遗传机制的一种常用手段．本文就该技术的最近研究进展进行综述，并着重介绍 ＣｈＩＰ－ｓｅｑ 数据分 析过程及该技术的实际应用情况．
Reviews and Monographs 综述与专论
生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics ２０１３， ４０（３）： ２１６￣２２７ ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎ
染色质免疫沉淀-测序：全基因组范围研究 蛋白质-DNA 相互作用的新技术 *
ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｔｉｌｉｎｇ ａｒｒａｙｓ），ＣｈＩＰ－ｓｅｑ 提供了 一种高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究蛋白质 － ＤＮＡ 相互作用的手段［１１］，可以应用到任何基因组 序列已知的物种，可以研究任何一种 ＤＮＡ 相关蛋 白与其靶定 ＤＮＡ 之间的相互作用，并能确切得到 每一个片段的序列信息．随着测序成本的降低， ＣｈＩＰ－ｓｅｑ 逐步成为研究基因调控和表观遗传机制的 一种常用手段．本文主要就这一新兴技术的基本原 理和实验设计、优点、数据分析、实际应用等方面 进行讨论．
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▪ 3、超声片段的大小
▪ 打断后的染色质片段的长度应主要集中在 200-1000bp 左右。
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六、测序
▪ ChIP-Seq的原理是：
首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特 异性地富集目的通量测序。研究人员通过将获得的数百万 条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基 因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区 段信息。
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二、原理
染色质免疫沉淀技术 （chromatin
immunoprecipitation assay, ChIP）的基本原理是在活细 胞状态下把细胞内的蛋白质和 DNA交联，超声波将其随机 切断为一定长度范围内的染色 质小片段，然后用所研究的目 的蛋白质特异性抗体免疫沉淀 蛋白质-DNA复合体，从而特 异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段。
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四、应用
▪ 1.组蛋白修饰研究 ▪ 2.转录调控分析 ▪ 3.药物开发研究 ▪ 4.有丝分裂研究 ▪ 5.DNA损伤与凋亡分析
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五、优缺点
优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用 的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合 蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因 表达调控的真实情况。
缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得； 为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞 内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的 基因获取可能需要限制在组织来源。
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注意事项
▪ 1、抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性
▪ ChIP所选择的目的蛋白的抗体是 ChIP实验成功 的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗 体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近， 不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免 疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是 所有的抗体都能做 ChIP实验的，只有经过 ChIP 实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。 如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉 淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先 做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉 淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。
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3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物
4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA） 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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▪ 1、酚-氯仿抽提 ▪ 2、硅胶柱纯化
8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 蛋白质在DNA上结合位点的鉴定
▪ 1.如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一 序列是目的的蛋白靶序列，则可选用定量 或者半定量PCR方法。
▪ 2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目 的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结 合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIPchip，和ChIP-seq方法
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简介 技术原理 技术流程
应用 优缺点
测序
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一、简介
▪ ChIP 是目前唯一研究体 内DNA与蛋白质相 互作用的方法。不 仅可以检测体内反 式因子与DNA的动 态作用，还可以用 来研究组蛋白的供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
应用领域
▪ （1）判断 DNA链的某一特定位置会出现 何种组蛋白修饰；
▪ （2）检测RNA polymerase II及其它反式 因子在基因组上结合位点的精确定位；
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▪ 2、交联的条件
▪ 交联所用的甲醛终浓度约为 1%，而交联时 间需要预实验来确定。通常的交联条件为 室温10 min。甲醛的交联反应可被加入的 甘氨酸终止。交联时间如果过长，细胞染 色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果， 而且实验材料也容易在离心过程中丢失。 交联时间如果过短，则交联不完全，产生 假阴性。
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技 术 示 意 图
三、技术流程 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
具 体 操 作 流 程
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1、甲醛交联细胞
5、洗脱免疫复合物
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6、去除甲醛交联
▪ 解交联：加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度 为0.2M).混匀, 65℃,解交联过夜。
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7、DNA纯化
具 体 步 骤
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2、染色质超声断裂
▪ 1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。 每1min颠倒摇动一次离心管。
▪ 2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰 上。(不同样本都进行超声条件优化实验)
▪ 3.14000rpm离心10min(4℃)，转移上清于 1.5ml离心管。