重组克隆筛选和鉴定优秀课件
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重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第七章 重组体克隆的筛选和鉴定
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
第一节 利用遗传标记的表型特征筛选
利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子
一、抗药性筛选法 1. 原理： 原理： 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性 基因。
质粒上有两个抗菌素性基因: 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因 质粒上有两个抗菌素性基因 Tetr和Ampr。
选择过程： 3. 选择过程： （1）四环素抗性插入失活 ） 如果在Tet 上插入外源DNA，导致四 如果在 r上插入外源 ， 环素抗性基因失活，可用四环素加环 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 平板培养基选择重组克隆 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 失活的菌生长被四环素抑制， 丝氨酸杀死，保留下来； 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。 反而被环丝氨酸杀死。
最好用单克隆抗体（ 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 ）。
blotting） 四、免疫印迹（western blotting）法 免疫印迹（ 在蛋白质凝胶电泳以后， 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。 法检测胶上的蛋白质泳带。 1.原理： 1.原理： 原理 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂， 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态， 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。 结合，使蛋白质带上负电荷。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx
此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜
先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制 嘧啶呈 现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含 有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平 为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择 转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是 由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄 主细胞新的抗性表型所致。
6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子
把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主 要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体 包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区； 二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75~105%的长度时，才能在培养平板上 形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不 会包装成பைடு நூலகம்的噬菌体颗粒的。
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探
针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。
基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定
记前体，通过缺口平移的方法，把天然DNA或 RNA片段标记上放射性同位素。
此外还可以化学合成DNA探针，只要已知 目的基因产物的部分氨基酸序列，就可以从这 个信息中，反推出基因编码区可能的核苷酸排 列 顺 序 。 选 择 一 小 段 含 有 独 特 密 码 子 （ Met 和 Try）或简并性最小的密码子（Cys、His、Phe 和Tyr等）的氨基酸序列，用化学法合成出相当 于这些密码子序列的寡核苷酸片段（10~20个碱 基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，将 32PdNTP 转 移 到 合 成 的 DNA 的 5’-OH 末 端 （称为末端标记 ），即成为标记好的探针。
2
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探 针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
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6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。
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此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜 色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。
此外还可以化学合成DNA探针，只要已知 目的基因产物的部分氨基酸序列，就可以从这 个信息中，反推出基因编码区可能的核苷酸排 列 顺 序 。 选 择 一 小 段 含 有 独 特 密 码 子 （ Met 和 Try）或简并性最小的密码子（Cys、His、Phe 和Tyr等）的氨基酸序列，用化学法合成出相当 于这些密码子序列的寡核苷酸片段（10~20个碱 基）混和物；然后利用多核苷酸激酶，将 32PdNTP 转 移 到 合 成 的 DNA 的 5’-OH 末 端 （称为末端标记 ），即成为标记好的探针。
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对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探 针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
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6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。
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此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜 色的改变与否，很容易鉴别出重组体菌落。
重组克隆的筛选与鉴定.ppt
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
18
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
6
图 pBR322的结构图
42
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
43
3. 分子杂交法
39
第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
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图 pBR322的结构图
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2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
39
第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
重组克隆的单元操作优秀课件
载体的功能
为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供在受体细胞中的复制、扩
增或整合能力（指DNA 拷贝数的增加） （所有载体必须具备的能力） 为外源基因提供在受体细胞中的表达能力 （指基因的表达，使外源基因通过mRNA 和蛋白质在受体细胞中发挥功能，进而可 发现基因在生物体内发挥的作用）。
Ropdimer
PRNAII
RNA II
a、在复制起点处， RNA II（长555个碱基）与质粒DNA形成 RNA-DNA复合物，RNA酶H可降解RNA II ，露出3’自由羟基， 质粒复制起始。在该区域还能反向转录形成RNA I，I和II为互 补的RNA。
B、 如果RNA I和RNA II形成双 链RNA螺旋，RNA酶H不能降 解RNA II，复制不能进行。
2、灭活一些质粒的基因（如可转移基因），保 证重组实验的安全；灭活质粒拷贝数的负控制基 因，提高质粒的拷贝数。
3、加入选择性标记，便于重组子的检测 4、加入多克隆位点，便于外源基因的插入 5、根据克隆的目的，加装特殊的表达元件或便
于蛋白纯化的元件（GST标签）
例: 第一个人工构建的遗传载体
Ropdimer
PRNAII
RNA II
c、 当质粒的浓度比较 高的时，Rop蛋白促 进RNA I和RNA II形 成双链RNA螺旋，使 质粒的复制不能起始。
d 、 当质粒的比较低时， RNA II与质粒DNA 形成RNA-DNA复合 物，RNA酶H降解 RNA II 质粒复制起 始。
e、突变RNA I或去除 Rop基因导致质粒的 拷贝数增加。
B、关键蛋白与重复区域结合进行调 控的机理（ pS101质粒）
a) 复制原点区域含有3～7拷贝的长度为17～22bp的 重复区域，R1、R2、R3等。
重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
基因工程重组子选择筛选与分析精品PPT课件
2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞 Bar基因是1987年从水链霉菌中分离出来的，它编码的PPT- 乙酰 转移酶(PAT)能够解除非选择性除草剂的毒性。PPT是L-谷氨酸 的类似物，能强烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺 合成酶一旦受到抑制，将会导致植物体内氨的迅速积累，并使植 株死亡。 Bar基因的表达产物PAT通过对PPT的乙酰化从而解除 PPT的毒性，可以使转化植物细胞产生对除草剂的抗性。
② 氯霉素 (chloramphenicol, Cm 或 Cmp): 含 cat基因的菌体能转译氯 霉素乙酰转酰酶 (chloramphenicol acetyltransferase)，使Cm乙酰化 而失效。
③ 卡那霉素 (kanamycin, Kn或 Kan): 含Kan抗性基因菌体转译一种能 修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。 四环素(tetracymic, Tc或 Tet): 含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变 细菌膜的蛋白，防止Tc 进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。 ⑥ 链霉素(strentomycin, Sm或 Str): 含Str 抗性基因的菌体转译一种能 修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。
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的原理 1. -半乳糖苷酶与Lac Z基因 由E.coli lac操纵子上的Lac Z基因编码。
分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。 2. Lac Z基因 突变的Lac Z基因，只编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（氨基端） 。
2. 培养基中IPTG、X-gal 的作用
+ 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
蓝色
图 LacZ 插入外源DNA
图 白色菌落与蓝色菌落的挑选
四、pBS重组质粒的筛选实验
使用的载体为pBS质粒。 转化受体菌为E. coli DH5α菌株。 由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因，故
重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互 补现象筛选相结合的方法。
重组克隆筛选和鉴定
内容提要
第一节 载体表型选择法 第二节 DNA电泳检测法 第三节 核酸杂交检测法
第四节 免疫化学检测法 第五节 转译筛选法 第六节 真核重组基因的选择方法
一般克隆与筛选策略
第一节 载体表型选择法
根据载体提供的表型进行选择的方法： 抗生素抗性基因的插入失活选择法 -半乳糖苷酶的显色反应选择法
重组克隆
无环丝氨酸
（2）氨苄青霉素抗性插入失活
氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺 酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青 霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪 色。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青 霉素指示液褪色---呈蓝灰色。据此选择 阳性克隆。
图 氨苄青霉素抗性插入失活
载体
α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如pUC、pGEM系列载体。
菌株
α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如DH5α(LacZ△M15)、 JM101~110(LacZ△M15)等。
1. 抗性筛选
因pBS质粒带有Ampr 基因，而外源 DNA片段上不带该基因，故转化受体菌 后，只有带有pBS DNA 的转化子，才 能在含有Amp 的LB 平板上存活下来； 而只带有自身环化的外源DNA片段的转 化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
5. 选择培养的原理
在含有X-gal 和IPTG 的选择培养基上， 载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌 落，而携带插入片段的重组质粒转化子 为白色菌落。
平板37℃培养后，放于冰箱3-4 小时， 可使显色反应充分，菌落为蓝色。
图 -半乳糖苷酶显色反应
*
乳糖 X-gal
-半乳 糖苷酶
+ 半乳糖
葡萄糖
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。
④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培 养基上去找那些原始的克隆。
⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就 是含有重组pBR322质粒的重组子。
图 pBR322的结构图
一、插入失活法的原理
一般原理
一种利用抗生素抗性基因或其他基因的 插入失活，来筛选重组子的方法。
通常外源DNA插入的位点设计在特定基 因上，一旦外源DNA插入，该基因就被 破坏而失去活性。由此来判断载体上是 否带有外源DNA。
二、利用抗生素抗性基因：pBR322
以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的 插入失活的原理。
4. 选择的过程
（1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环
素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨 酸的平板，选择重组克隆。
Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环 素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常 生长，但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
3. 抗菌素标记的选择
（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因 产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉
酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）褪色。 Ampr有Pst I、Sca I等多个插入位点。 （2）四环素 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （3）环丝氨酸 杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
3. -互补作用
-互补作用是pUC质粒载体的特性。 pUC载体：含有Lac Z基因，编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（ 片段，氨基端） 。 受体菌：基因组中带有突变的-半乳糖苷酶
基因（缺失片段），可被IPTG诱导表达 （只编码-半乳糖苷酶的-肽）。
载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸 收了带有LacZ基因的 pUC质粒，才能合成 完整的有活性的-半乳糖苷酶。
pUC18/19的结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因：编码-半乳糖苷酶的部分
肽段。 Lac Z上有插入外源DNA的MCS位点。
4. 筛选的方法：蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培 养基，能合成-半乳糖苷酶。
（1）IPTG作用 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导
lacZ 基因的表达-半乳糖苷酶。 （2）X-gal作用 5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作为-半乳
糖苷酶水解的底物。
（3）X-gal的显色反应 β-半乳糖苷酶 (四聚体)将X-gal水解成半乳糖
苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝) 。在4℃蓝色加 深。
1. 原理
在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如 BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及 四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组 pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性， 但对四环素的抗性消失（敏感）。
2. 筛选的方法
①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培 养基上，并培养至菌落出现。
分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。 2. Lac Z基因 突变的Lac Z基因，只编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（氨基端） 。
2. 培养基中IPTG、X-gal 的作用
+ 半乳糖
5-溴-4-氯靛蓝
蓝色
图 LacZ 插入外源DNA
图 白色菌落与蓝色菌落的挑选
四、pBS重组质粒的筛选实验
使用的载体为pBS质粒。 转化受体菌为E. coli DH5α菌株。 由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因，故
重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互 补现象筛选相结合的方法。
重组克隆筛选和鉴定
内容提要
第一节 载体表型选择法 第二节 DNA电泳检测法 第三节 核酸杂交检测法
第四节 免疫化学检测法 第五节 转译筛选法 第六节 真核重组基因的选择方法
一般克隆与筛选策略
第一节 载体表型选择法
根据载体提供的表型进行选择的方法： 抗生素抗性基因的插入失活选择法 -半乳糖苷酶的显色反应选择法
重组克隆
无环丝氨酸
（2）氨苄青霉素抗性插入失活
氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺 酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青 霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪 色。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青 霉素指示液褪色---呈蓝灰色。据此选择 阳性克隆。
图 氨苄青霉素抗性插入失活
载体
α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如pUC、pGEM系列载体。
菌株
α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。 如DH5α(LacZ△M15)、 JM101~110(LacZ△M15)等。
1. 抗性筛选
因pBS质粒带有Ampr 基因，而外源 DNA片段上不带该基因，故转化受体菌 后，只有带有pBS DNA 的转化子，才 能在含有Amp 的LB 平板上存活下来； 而只带有自身环化的外源DNA片段的转 化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
5. 选择培养的原理
在含有X-gal 和IPTG 的选择培养基上， 载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌 落，而携带插入片段的重组质粒转化子 为白色菌落。
平板37℃培养后，放于冰箱3-4 小时， 可使显色反应充分，菌落为蓝色。
图 -半乳糖苷酶显色反应
*
乳糖 X-gal
-半乳 糖苷酶
+ 半乳糖
葡萄糖
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。
④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培 养基上去找那些原始的克隆。
⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就 是含有重组pBR322质粒的重组子。
图 pBR322的结构图
一、插入失活法的原理
一般原理
一种利用抗生素抗性基因或其他基因的 插入失活，来筛选重组子的方法。
通常外源DNA插入的位点设计在特定基 因上，一旦外源DNA插入，该基因就被 破坏而失去活性。由此来判断载体上是 否带有外源DNA。
二、利用抗生素抗性基因：pBR322
以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的 插入失活的原理。
4. 选择的过程
（1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环
素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨 酸的平板，选择重组克隆。
Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环 素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常 生长，但可被环丝氨酸杀死。
图 四环素抗性插入失活
3. 抗菌素标记的选择
（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因 产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉
酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液 （I2-KI-Aampicillin）褪色。 Ampr有Pst I、Sca I等多个插入位点。 （2）四环素 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （3）环丝氨酸 杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
3. -互补作用
-互补作用是pUC质粒载体的特性。 pUC载体：含有Lac Z基因，编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（ 片段，氨基端） 。 受体菌：基因组中带有突变的-半乳糖苷酶
基因（缺失片段），可被IPTG诱导表达 （只编码-半乳糖苷酶的-肽）。
载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸 收了带有LacZ基因的 pUC质粒，才能合成 完整的有活性的-半乳糖苷酶。
pUC18/19的结构图
氨苄青霉素抗性基因 Lac Z基因：编码-半乳糖苷酶的部分
肽段。 Lac Z上有插入外源DNA的MCS位点。
4. 筛选的方法：蓝白斑法
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是 一种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培 养基，能合成-半乳糖苷酶。
（1）IPTG作用 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导
lacZ 基因的表达-半乳糖苷酶。 （2）X-gal作用 5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作为-半乳
糖苷酶水解的底物。
（3）X-gal的显色反应 β-半乳糖苷酶 (四聚体)将X-gal水解成半乳糖
苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝) 。在4℃蓝色加 深。
1. 原理
在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如 BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。 如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及 四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组 pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性， 但对四环素的抗性消失（敏感）。
2. 筛选的方法
①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培 养基上，并培养至菌落出现。