木瓜蛋白酶水解发酵豆粕优化工艺研究

（２）正 交 优 化 试 验 ：在 酶 解 发 酵 豆 粕 单 因 素 试 验 结 果 为 基 础 ，正 交 试 验 设 计 因 素 水 平 表 见 表 １。
表 １ 正 交 试 验 因 素 及 水 平 表
水平
１ ２பைடு நூலகம் ３
ｐＨ 值（Ａ）
６．０ ６．５ ７．０
酶 用 量 （Ｂ） ％
料 液 比 （Ｃ）
和水解度 随 着 ｐＨ 值 的 变 化 而 波 动。 蛋 白 质 随 着 ｐＨ 值 的增大，呈现先 增加后 趋于平 缓 的变 化 趋 势， 这可能是由于酶解过程中，随 ｐＨ 值增 大，蛋 白 质增 加量增大，而另一方 面 发 酵 豆 粕 中 蛋 白 质 的 肽 键 断
裂，随 着 反 应 的 进 行，基 团 增 多，改 变 了 溶 液 体 系
图 ２ 氨 基 酸 标 准 曲 线
水 解 度 （ＤＨ ）按 如 下 公 式 计 算 ： ＤＨ ＝７Ｃ．８··ＮＭ０－·ＣＮ０··ＮＮ０ ×１００％ ，
式中，Ｃ 为 酶 解 后 样 品 氨 基 酸 浓 度，μｇ／ｍｌ；Ｃ０ 为 酶 解前 样 品 氨 基 酸 浓 度，μｇ／ｍｌ；Ｍ 为 Ｌ－亮 氨 酸 相 对 分子质量，１３１．１８ｇ／ｍｏｌ；Ｎ 为酶解前样品中蛋白质 含 量，ｍｇ／ｍｌ；Ｎ０ 为 酶 解 后 样 品 中 蛋 白 质 含 量，
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邓梦琴等：木瓜蛋白酶水解发酵豆粕优化工艺研究／２０１５年第９期
力 ６０ ０００ Ｕ／ｇ）；Ｌ－亮 氨 酸 ，氯 化 亚 锡 ，磷 酸 二 氢 钾 ， 氯 化 钠 ，盐 酸 等 ，均 为 分 析 纯 。 １．２ 仪 器 与 设 备
恒温水浴 锅 （ＨＨ－４ 型）；座 式 自 动 电 热 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 （ＺＤＸ－３５Ｂ１ 型 ）；数 字 ｐＨ 计 （ＰＨＳ－２Ｆ 型）；紫 外 可 见 分 光 光 度 计 （７５２ 型 ）；生 化 培 养 箱 （ＬＲＨ－２５０型）；台 式 高 速 离 心 机 （Ｈ／Ｔ１６ＭＭ 型）； 磁 力 加 热 搅 拌 器 （７８－１ 型 ）。 １．３ 试 验 方 法 １．３．１ 工 艺 流 程
水解度 ％
０．０４６ ０．０４３ ０．０５０ ０．０２８ ０．０２７
由表２可见，当酶解初始 ｐＨ 值为７．０ 时，游 离 氨基酸含量和水解度达到最大值。这是因为酶活性
部位的基团对反 应 体 系 ｐＨ 值 的 变 化 比 较 敏 感，解 离状态随着 ｐＨ 值 的 变 化 而 变 化，这 些 变 化 会 影 响 酶分子的特殊构象；另外，底物豆粕 蛋白也 随 ｐＨ 值 的 变 化 表 现 出 不 同 的 解 离 状 态［８］，因 此 游 离 氨 基 酸
工 艺 流 程 图 见 图 １。
图 １ 工 艺 流 程
１．３．２ 操 作 要 点 （１）发酵 豆 粕 的 制 备：在 菌 液 体 积 分 数 ３．０％，
培养液 ｐＨ５．２，发酵温度３０℃，发酵时间２４ｈ，料液 比１∶０．７的实验条 件 下，对 大 豆 粕 进 行 发 酵，１０５℃ 干 燥 至 恒 重 ，粉 碎 过 筛 （１２０ 目 ），冷 藏 备 用 。
酶种类的 选 择 及 复 配 是 酶 解 豆 粕 的 进 一 步 研 究 方 向，而微生物发酵与 木 瓜 蛋 白 酶 酶 解 结 合 的 技 术 目 前尚未见报道。本试验在微生物固态发酵豆粕的基 础 上 ，利 用 木 瓜 蛋 白 酶 对 豆 粕 进 行 水 解 ，并 探 讨 酶 解 条件对豆粕中各营 养 组 分 的 改 变 程 度，为 酶 解 发 酵 豆粕的工业化生产提供参考。
收 稿 日 期 ：２０１５－０６－１６；修 回 日 期 ：２０１５－０８－１９ 基 金 项 目 ：广 东 省 教 育 部 产 学 研 结 合 项 目 （２０１２Ｂ０９１１００００５） 作 者 简 介 ：邓 梦 琴 （１９９１－），女 ，硕 士 ，研 究 方 向 为 食 品 加 工 。 通 讯 作 者 ：宋 贤 良 （１９６９－），男 ，博 士 ，副 教 授 ，主 要 从 事 食 品 加 工 新 技 术 的 研 究 。
１ 材 料 与 方 法 １．１ 试 验 材 料
大豆粕（粗蛋白质质 量 分 数 为 ４５．２１％；水 分 为 ８．２９％；蛋白质 增 加 量 ５．６１７ ｍｇ／ｇ；游 离 氨 基 酸 含 量４０９．４３μｇ／１００ｇ）；发 酵 菌 液：混 合 菌 液（主 要 菌 种为酵母菌、乳酸 菌、光 合 菌、丝 状 （菌、放 线 菌 等）， 有效菌含 量 ≥１０×１０９ ＣＦＵ／ｍｌ；木 瓜 蛋 白 酶 （酶 活
豆粕是以大豆 为 原 料 制 油 后 的 副 产 物，工 业 生 产中豆粕资源丰 富，价 格 低 廉，营 养 性 能 好，是 饲 料 及饲料添加剂的良 好 原 材 料，在 畜 禽 饲 料 中 应 用 广 泛 。 ［１］ 然而豆粕 中 存 在 一 些 抗 营 养 因 子 （大 豆 抗 原 蛋白、抗胰蛋白酶及 植 物 凝 集 素 等），在 很 大 程 度 上 限制了其应用程度及范围 。 ［２］ 酶解豆粕和发酵 豆 粕 能 有 效 地 消 除 大 豆 蛋 白 中 的 脲 酶 、抗 胰 蛋 白 酶 、凝 血 素 等 抗 营 养 因 子 ，有 效 地 降 低 蛋 白 质 的 分 子 量 ，提 供 小分子蛋白和小肽 的 无 抗 原 优 质 蛋 白 源，并 可 产 生 大量益生菌，具有 提 高 适 口 性、消 化 吸 收 率，以 及 促 进生长等功效［３－４］，大大地提高了豆粕产品的 应 用 范 围和经济效益。且动物蛋白源由于其安全性问题在 应用上逐渐受到限 制，这 也 给 豆 粕 产 品 带 来 空 前 的 机遇［５］。单酶水 解 法 是 目 前 酶 解 豆 粕 的 主 要 方 法，
２．０ ２．５ ３．０
１∶１０ １∶１２ １∶１４
酶 解 时 间 （Ｄ） ｈ
０．５ １．０ １．５
２ 结 果 与 分 析 ２．１ 单 因 素 实 验 结 果 ２．１．１ ｐＨ 值对酶解发酵豆粕品质的影响
改变混合溶 液 的 ｐＨ 值，考 察 不 同 ｐＨ 值 条 件 对酶解发酵 豆 粕 的 品 质 影 响，ｐＨ 值 对 酶 解 发 酵 豆 粕 指 标 的 影 响 见 表 ２。
中 图 分 类 号 ：Ｓ８１６．４ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００３－６２０２（２０１５）０９－００４５－０４
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｗｉｔｈ ｐａｐａｉｎ
Ｄｅｎｇ Ｍｅｎｇｑｉｎ，Ｘｕ Ｊｉａｙｉｎｇ，Ｘｉｅ Ｑｉａｎｙｉ，Ｓｏｎｇ Ｘｉａｎｌｉａｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｆｅｅｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ，ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｐａｐａｉｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｓ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘｅｓ．Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏ－ ｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌ－ ｌｏｗｓ：ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ６．５，ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３％ ，ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶１０ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｆ １ｈ． Ｉｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｆｒｅｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ７５．６３３ ｍｇ／ｇ，１２１．９３２μｇ／ｇ，ａｎｄ ０．０３３％ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｐａｐａｉｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ｐｒｏｃｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ｍｇ／ｍｌ；７．８ 为 每 克 大 豆 蛋 白 质 的 肽 键 毫 摩 尔 数， ｍｍｏｌ／ｇ。 １．３．３．２ 单 因 素 和 正 交 实 验
（１）单因素试验：在固定 ｐＨ７．０、酶 用 量 为２％、 料液比为１∶１０、水 解时间 １ｈ 的 条 件下，分 别考 察 ｐＨ 值 （６．０、６．５、７．０、７．５、８．０）、酶 用 量 （１．０％、 １．５％、２．０％、２．５％、３．０％），料 液 比 （１∶６、１∶８、 １∶１０、１∶１２、１∶１４）和 酶 解 时 间 （０．５、１．０、１．５、 ２．０、２．５ｈ）因 素 对 发 酵 豆 粕 蛋 白 质 含 量、游 离 氨 基 酸含量和水解度的影响。
２０１５，Ｎｏ．９ ｄｏｉ：１０．７６３３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－６２０２．２０１５．０９．０１３
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木瓜蛋白酶水解发酵豆粕优化工艺研究
邓 梦 琴 ，徐 嘉 颖 ，谢 茜 怡 ，宋 贤 良
（华南农业大学食品学院，广东 广州 ５１０６４２）
摘 要：豆粕是饲料工业中应用最为广泛的植物性 蛋 白 原 料，本 试 验 以 微 生 物 固 态 发 酵 豆 粕 粉 为 原 料，以 蛋 白 质 增加量、游离氨基酸增加量和水解度为品质指标，探讨了酶解 初 始 ｐＨ 值、料 液 比、酶 用 量 和 酶 解 时 间 对 木 瓜 蛋 白 酶酶解发酵豆粕的影响。在单因素实验基 础 上，采 用 Ｌ９（３４）正 交 试 验 进 行 优 化，结 果 表 明 酶 解 的 最 佳 工 艺 条 件 为：酶解初始 ｐＨ６．５，酶 用 量 ３％，料 液 比 １∶１０，酶 解 时 间 １ｈ。 在 该 条 件 下，酶 解 豆 粕 中 蛋 白 质 增 加 量 为 ７５．６３３ ｍｇ／ｇ，游 离 氨 基 酸 增 加 量 为 １２１．９３２μｇ／ｇ，水 解 度 为 ０．０３３％ 。 关 键 词 ：豆 粕 ；发 酵 ；木 瓜 蛋 白 酶 ；酶 解 ；工 艺 条 件
（２）混合液制 备：称 取 ５．００ｇ 发 酵 豆 粕 粉 于 锥 形瓶中，按 一 定 的 料 液 比 配 制 混 合 溶 液，调 节 体 系 ｐＨ 值，加 入 一 定 浓 度 木 瓜 蛋 白 酶，在 ５５℃ 下 进 行 酶解。 １．３．３ 试 验 方 法 １．３．３．１ 分 析 方 法
蛋 白 质 含 量 的 测 定 ：按 文 献 ［６］的 方 法 进 行 。 游离氨基 酸 质 量 的 测 定：按 文 献 ［７］的 方 法 进 行 ，绘 制 得 到 标 准 曲 线 见 图 ２。
表２ ｐＨ 值对酶解发酵豆粕指标的影响
ｐＨ 值
６．０ ６．５ ７．０ ７．５ ８．０
蛋白质增加量 ｍｇ·ｇ－１
３．３５４ １０．９０６ ３１．３１２ ４０．６７６ ４１．８９４
氨基酸增加量 μｇ·ｇ－１ ７６．７２７ ７４．９０９ ８２．０００ ６５．９０９ ６５．０９１