【生物工程】下游技术实验报告
生物工程下游技术
d. 对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应 加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋 白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目 标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫 键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。 e. 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或 EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以 防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
优点： ① 一定的选择性； ② 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一 步分离过程 缺点：（只能用于实验室） ① 产物抑制造成效率低下； ② 溶酶价格高； ③ 通用性差， 不易确定最佳条件；
6、微波加热法
• 机理：微波加热导致细胞内极
性物质，尤其是水分子吸收微波 能，产生大量热量，使胞内温度 迅速上升，液态水汽化产生的压 力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成 微小孔洞，进一步加热可导致细 胞内部和细胞壁水分减少，细胞 收缩，表面出现裂纹。
缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分
离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的
分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体； 超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。
2、高蛋白浓度下的复性方法：
（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍
能得到较高的复性率。）
①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到 复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或 加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。 因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠 的蛋白一起聚集。
团状、丝状真菌、 几乎所有的微生物 较小革兰阳性菌不 细胞，包括含有包 宜，包含体不宜 含体的基因工程菌 的破壁
X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却 至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上
生物工程下游技术精编版
生物工程下游技术精编版MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】动物生物反应器专业：生物技术班级：093姓名：贺霞霞一、概述1、生物反应器：生物反应器是利用生物体所具有的生物功能，在体外或体内通过生化反应或生物自身的代谢获得目标产物的装置系统、细胞、组织器官等等。
2、内容：生物反应器听起来有些陌生，基本原理却相当简单。
胃就是人体内部加工食物的一个复杂生物反应器。
食物在胃里经过各种酶的消化，变成我们能吸收的营养成分。
生物工程上的生物反应器是在体外模拟生物体的功能，设计出来用于生产或检测各种化学品的反应装置。
或者说，生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。
生物反应器（bioreactor）经历了三个发展阶段：细菌、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。
转基因动物生物反应器的出现之所以受到人们极大的关注，是因为它克服了前两者的缺陷，即细胞基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为的培养条件要求相当苛刻、成本太高而限制了规模生产。
另外，转基因动物生物反应器还具有产品质量高、容易提纯的特点。
一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫做动物生物反应器。
几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可以经过人为驯化为生物反应器。
从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要方便产物的获得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器、动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。
其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。
二、动物生物反应器的介绍1、转基因动物与生物反应器转基因动物是指经人的有意干涉,通过实验手段,将外源基因导入动物细胞中,稳定地整合到动物基因组中,并能遗传给子代的动物。
《生物工程下游技术实验》项目一
《生物工程下游技术实验》讲义实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)过程1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。
2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。
SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。
●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法溶液配制：1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。
共配500ml.2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..操作：25︒C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（∆Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（∆Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的∆Ａ’在0.035/min左右。
生物工程下游技术
生物工程下游技术生物工程下游技术生物工程下游技术的定义指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。
1.生化工程分离技术预处理结晶干燥离心法：离心过滤、离心沉降、超离心萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.生物物质常用的分离技术氨基酸：结晶和离子交换法蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析3. 生物分离方法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因子：分离因子又称分离系数。
产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。
6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
生物工程下游技术实验讲义
⽣物⼯程下游技术实验讲义⽣物⼯程下游技术实验讲义⽬录实验⼀层析柱装填及柱效测定实验⼆溶菌酶粗提取实验三溶菌酶分离纯化实验四酶活⼒及蛋⽩质浓度的测定实验五溶菌酶纯度鉴定与分⼦量测定实验⼀层析柱装填及柱效测定⼀、实验⽬的1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定⽅法；2. 熟悉凝胶层析的⼀般过程；⼆、实验原理凝胶过滤层析也称分⼦筛层析、排阻层析。
是利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛作⽤，根据被分离物质的分⼦⼤⼩不同来进⾏分离。
相对分⼦质量⼤的⽣物分⼦由于不能进⼊或不能完全进⼊凝胶内部的⽹孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或⼤的⽹状孔通过，⼤分⼦相对于⼩分⼦迁移的路径短，保留值⼩，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分⼦量⼩的⽣物分⼦保留值⼤，后从柱中流出。
凝胶层析常⽤于分离纯化蛋⽩质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗⽣素等⽣物⼤分⼦, 也可⽤于样品的浓缩和脱盐及测定⽣物⼤分⼦的分⼦质量等⽅⾯。
三、实验试剂与器材层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），⽔浴锅，蓝⾊葡聚糖四、实验内容与步骤（⼀）测量层析柱的内径、⾼度，计算所需凝胶量⼲胶⽤量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的⼲胶⽤量再增加10%-20%（⼆）Sephadex G-50凝胶预处理称取相应质量的⼲凝胶，加⼊适量的0.02 mol/L PBS 在100℃⽔浴中加热溶胀1⼩时以上，溶胀之后将极细的⼩颗粒倾泻出去。
⽤真空⼲燥器抽尽凝胶中空⽓，并将凝胶上⾯过多的溶液倾出。
（三）层析柱的装填1 清洗：每组取⼀⽀层析柱，⽤清⽔冲洗⼲净。
2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好⼲净。
安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。
对准出⼝处，放⼀只250mL烧杯。
生物工程下游技术
生物工程下游技术第五章1、目标产物分离基本的两个阶段：产物的初级分离和产物的纯化精制阶段。
（1）初级分离：位于生物反应之后，其任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂物等。
（2）纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择手段（主要是各种色谱层析）将目标产物和干扰杂物尽可能的分离开，达到产物的高纯度，最后储藏运输和使用产品。
（1）机械破碎（高压匀浆、高速研磨）—离心法提取包含体—加变性剂溶解—除变性剂复性特点：利用了包含体与细胞碎片的密度差，离心法可获得干净的包含体，再对其复性。
这样首先摆脱了大量的杂质，使后面的分离纯化简单了，缺点是需要经过几次离心，加工时间较长（2）机械破碎—膜分离除可溶性蛋白—变性剂溶解包含体—除变性剂复性特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片与包含体一起被膜挡住，难以分开，其次膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白的滞留，优点是封闭式操作，不污染环境也不受污染，能量也消耗少（3）化学破碎（加变性剂）—离心除细胞碎片—除变性剂复性特点：化学法破菌，试剂既可以破菌又可以溶解包含体，这样节约了时间和设备，缺点是所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后面的分离带来困难。
第六章1、膜分离技术：是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分从而达到分离目的技术。
优点：1）处理效率高，设备易于放大2)可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离浓缩3）化学与机械强度小，减少失活4）无相转变，省能5）有相当好选择性，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的6）选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率7）系统封闭循环，防止外来污染8）不外加化学物，减少了成本，也减少了对环境的污染2、膜的清洗：物理方法和化学方法。
物理方法一般是指用高速水冲洗，海绵球机械擦洗和反洗等，他们的特点是简单易行。
化学清洗通常是用化学清洗剂，如碱、酸、酶表面活性剂、络合剂和氧化剂等。
生物工程生产实习报告3篇
生物工程生产实习报告生物工程生产实习报告精选3篇（一）实习报告一、实习背景本次生物工程生产实习是在某生物制药公司进行的，该公司专注于生物药物的研发和生产。
实习期限为两个月，目的是让学生通过实际操作和参与，了解生物工程生产的流程和相关技术，提高实践能力。
二、实习目标1.了解生物工程生产的流程和设备。
2.掌握生物工程生产中的常用实验操作技术。
3.学习生物工程生产过程中的质量控制方法。
4.提升团队合作和沟通能力。
三、实习内容1.工厂参观：参观了生物制药工厂的各个车间和生产线，了解了生产设备的种类和工作原理，以及生产过程中的质量控制措施。
2.实践操作：参与了生物工程生产中的实验操作，如细胞培养、发酵过程控制、离心等。
学习了实验操作的基本技巧，如灭菌操作、稀释液体的配制等。
3.数据分析：学习了生物工程生产过程中的数据分析方法，如生长曲线分析、菌体密度的测定等。
4.质量控制：了解了生物工程生产中的质量控制方法，包括原料检验、成品检验和中间产品检验等。
参与了产品质量检验的过程，并学习了相关的质量控制标准和操作规程。
四、实习心得通过这次实习，我对生物工程生产有了更深入的了解。
我发现生物工程生产是一个复杂的过程，需要严格的操作和质量控制，以确保产品的质量和安全性。
在实践操作中，我遇到了一些困难，例如细胞培养的操作需要严格控制环境条件和参数的变化，我需要不断调整和优化实验步骤和条件，以获得高质量的细胞培养。
此外，团队合作也是一个重要的能力。
在实习过程中，我和其他实习生一起合作完成了一些实验任务，通过相互配合和交流，我们能够更有效地完成工作。
总的来说，这次实习对我个人的成长有着重要的意义。
我不仅学到了实际操作技能，还提高了团队合作和沟通能力。
这将对我以后在生物工程领域的从业生涯有着积极的影响。
生物工程生产实习报告精选3篇（二）实习报告摘要：通过参与生物工程生产实习项目，我对生物工程领域的生产工艺和操作流程有了更深入的了解。
生物工程下游技术 沉析
沉淀(沉析)
Precipitation
概述 3.2蛋白质的表面特性 3.34.1.1 沉淀(precipitation)概念 物理环境的变化引起目的物或杂质的溶解度降低 ，从而形成不定形固体凝聚物(aggregates)的过程。 多用于蛋白质及多糖类等物质的初级分离。
3.3.1 盐析沉淀(Salt induced precipitation) 1) 盐析原理 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，从而发 生沉淀的现象为Salting-out.
log S KsI 1 I 2
c Zi
i
2
Cohn
其中：S—蛋白质的溶解度，g/dm3 ；β —常 数；Ks—盐析常数；I—离子强度，mol/dm3；ci— 离子i的摩尔浓度(mol/dm3)；Zi—电荷数
3.1.4一般沉析操作的过程
在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂；
沉淀物的陈化，促进晶体生长；
离心或过滤，收集沉淀物；
3.2 蛋白质的表面特性
1)、蛋白质为两性高分子电解质 (amphoteric polymer)，其正负电 荷是由氨基和羧基的离子化形成 的。其包含疏水性和亲水性的氨 基酸基团，其亲水和疏水区域的 分布和程度决定蛋白质在水相环 境中的溶解程度。但大部分蛋白 质是可溶的，其亲水性氨基酸残 基分布在蛋白质立体结构的外表 面。蛋白质表面由不均匀分布的 荷电基团形成的荷电区、亲水区 和疏水区组成。
3）影响盐析的因素 ① 盐的种类和浓度：即Ks值不同，一般是多价阴离子
、单价阳离子的盐析作用强。即浓度愈大，共沉作用加强 ，分辨率降低，效果降低，一般2－3%。 3 2
PO4 SO4 CHCOO Cl NO3 ClO4 I SCN
生物下游技术
高价无机离子 当采用离子交换法提取产物时，影 响树脂对生化物质的交换容量 色素、毒性物质、热原质
2011-3-26
去 除 杂 蛋 白
降 低 发 酵 液 粘 度
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二、发酵液的预处理
采用理化方法设法增大悬浮液中固体粒子的大小、 或降低粘度，以利于过滤。
去除会影响后续提取的高价无机离子和杂蛋白质
等。
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3. 所需目的产物稳定性低
对热、酸、碱、有机试剂、酶以及机械剪切等均敏感，
易失活或分解。
4. 代价昂贵，产品回收率不高，损耗大
如：抗生素、乙醇、柠檬酸的纯化费用占整个工程费 用的60%；纯化蛋白质占总费用的80~90%
5. 生物安全问题：热原质、色素、毒性物质
2011-3-26
镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络 合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离 子的浓度。
Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na
黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀
3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+
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2 .杂蛋白质的去除方法
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2.过滤介质
使滤液通过，截留固体颗粒并支撑滤饼的材料。要 求其具有多孔性、耐腐蚀性及足够的机械强度。
无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等 成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘 结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。 非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维 滤布、短纤维滤布。 金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。 无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。
生物工程下游技术实习报告
离子交换树脂脱色
原理：离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂 的固态高分子材料。是一类带有官能团的网状结构的 高分子化合物，其结构有三部分组成：不溶性的三维 空间网状骨架，连接在骨架上的官能团和官能团所带 的相反电荷的可交换离子。 最适pH在2.5左右。
纳滤
与超滤或反渗透相比，纳滤过程对单价离子 和分子量低于200的有机物截留较差，而对二 价或多价离子及分子量介于200～500之间的 有机物有较高脱除率，基于这一特性，纳滤过 程主要应用于水的软化、净化以及相对分子质 量在百级的物质的分离、分级和浓缩（如染料、 抗生素、多肽、多醣等化工和生物工程产物的 分级和浓缩）、脱色和去异味等。 经过脱色的CPC，在纳滤膜的作用下进一步 浓缩、纯化。
发酵液的预处理和固液分离
酸化：加热、大幅度调节pH和添加絮凝剂， 使蛋白质变性，加入草酸、三聚磷酸钠等物质 除去Ca2+、Mg2+、Fe2+ 等无机离子。
微滤
• 预处理过后的发酵液 经膜过滤—微滤，除 去大部分的菌体、杂 蛋白等悬浮物质
超滤
• 在超滤过程中，水溶液 在压力推动下，流经膜 表面，小于膜孔的溶剂 （水）及小分子溶质透 水膜，成为净化液（滤 清液），比膜孔大的溶 质及溶质集团被截留， 随水流排出，成为浓缩 液。超滤过程为动态过 滤，分离是在流动状态 下完成的
结晶
结晶定义：凡是从匀相中形成固体颗粒者，统称为结 晶 结晶是制备纯品的有效方法，由于晶体外观好，易于 被消费者喜爱，一般生产中常以结晶作为最后一步的 精制操作。 比如在食品配料和添加剂都是通过结晶获得的。如葡 萄糖酸，蔗糖、谷氨酸钠等。 结晶方法有很多种，如：A. 改变温度结晶 B. 利用 等电点结晶 C. 加成盐剂结晶 D. 加入不同溶剂结 晶。 而溶析结晶是原料药最后纯化的方法。比如说对于头 孢类原料药。 如：头孢菌素C分子是利用溶析结晶法进行最后精制。
生物工程下游技术
生物工程下游技术课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。
本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术是关于由生物界自然产生的生物体或者由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称之下游工程或者下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。
目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”范畴。
要紧研究的是物质分离的方法原理及有关的仪器设备。
生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。
二、课程目标与基本要求通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握下列基本知识点：1.生物工程下游技术的研究对象与进展历程2.下游技术的理论基础3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法与设备4.溶剂萃取与浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等要紧分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习熟悉各类分离方法的原理，适用范围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中能够选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。
通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
三、与本专业其他课程的关系本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术对各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。
《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微生物学》，《生物化学》，《酶工程》，《发酵工程》，《生物工程与设备》等专业课的知识也会运用到这门课程中，其后继课程有《发酵工厂设计》等。
生物工程下游技术
优点:(1)对产物释放具有一定选择性.(2)细胞外形保持完整,碎片少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取.
优点:操作参数少,适合于大规模操作,
缺点:不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌.破碎率较低,往往需循环2-4次才能达到较高的破碎率,容易引起产物的失活的可能性,需配备换热器进行级间冷却.
3）超声破碎法:通常采用的超声破碎机在15—25kHz的频率下操作.
优点:操作简便,液量损失少,适合实验室规模.
缺点:易引起温度的剧烈上升,在大规模操作中,声能传递和散热困难,产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活.
4)酶溶法:利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键,从而达到破壁的目的.
优点:选择性释放产物,条件温和,核酸泄漏量少,细胞外形完整.
不足:价格高,限制了大规模应用,通用性差,不同菌种需选择不同的酶,不易确定最佳的溶解条件;产物抑制的存在.
倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣,所以也称为螺旋卸料沉降离心机.特别适用于含固形物较多的悬浮液的分离.优点:操作连续;适应性强;应用范围广;结构紧凑和维修方便缺点:分离有数较小,不适用于细菌;酵母等微生物悬浮液的分离,液相澄清度也较差.
过滤:使悬浮液通过过滤介质,让液体通过,而把固体颗粒截留,从而达到固液分离的目的.
管式离心机:分离效率很高.用于液液分离和固液分离.当用于液液分离时为连续操作,而用于固液分离时则为间歇操作.适于微生物细胞;细胞碎片;细胞器;病毒;蛋白质;核酸等生物大分子的分离.优点:设备简单,操作稳定,分离效率高.在生物工业中,特别适合于一般离心机难以分离而固形物含量＜1％的发酵液的分离.缺点:生产能力较小,转速相对较低的管式离心机最大处理量也就是10m3/h,且不适用于固形物含量较高的发酵液.
生物工程下游技术实验指导
生物工程下游技术实验指导何伟 编南京师范大学生命科学院2006-06南京师范大学生物学实验教学中心课程说明根据教学计划，对理科基地、生物技术、生物教育各专业方向的本科学生开设生物工程下游技术实验36学时。
现编列11个实验项目，供实验教学时选用。
生物工程下游技术实验单独设课，1个学分。
平时实验操作成绩占30％，主要考核学生的预习情况、实验态度、动手能力及操作的规范性、实验结果、实验报告、课堂纪律等情况。
期末实验理论考试成绩占70％。
南京师范大学生物学实验教学中心实验注意事项1．自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退。
2．实验前必须认真预习，熟悉每次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3．实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地接操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。
完成实验后经教员检查同意，方可离开实验室。
4．实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。
实验完毕．仪器须洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。
5．使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。
洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。
使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。
6．实验室内严禁吸烟！电炉应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭。
乙醇、丙酮、乙醇等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。
实验完毕，应立即关好仪器开关和水龙头，拉下电闸。
离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故。
7．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。
强酸、强碱溶液必须先用水稀释。
废纸、火柴头及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内，不能倒入水槽或到处乱扔。
8．仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表,然后补领。
生物工程下游技术2
等电点沉淀法：对于氨基酸和蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下净电荷为零，称为等电点，此时两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法。
化学渗透破壁法：某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或细胞膜的通透性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。
反渗透：在只有溶剂能通过的渗透膜的两侧，形成大于渗透压的压力差，就可以使溶剂发生倒流，使溶液达到浓缩的效果，这种操作成为反渗透。
离心分离因素：将离心加速度和自由落体加速度的比值称为离心分离因素或离心力与重力比，用公式表示为：K＝Rω2/g。
高压匀浆破壁法：将细胞悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，很快以高压泵将其以很高的流速喷出，这种高速喷出的浆液经过碰撞被迫改变方向而流出，细胞在这一系列过程中经历了高流速下的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，使细胞产生较大的形变，导致细胞壁的破坏。
超临界流体：超临界流体是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂与蛋白质水溶液互溶，在溶解于蛋白质水溶液的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低水溶液的介电常数，破坏蛋白质分子表面的水化膜，从而导致蛋白质分子相互聚集发生沉淀作用。
膜组件：由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元称为膜组件或膜装置。
膜的水通量：即膜通量，指单位时间内通过单位膜面积的水体积流量。
膜的孔隙率：孔总面积在单位膜上所占面积的比例，空隙率越大强度越差，膜透量越大。
膜的孔径分布：膜的截留分子量：膜壁上微孔的形状和大小并非完全一致，常使用截留率和截留分子量两个参数共同来衡量，当90%的溶质被膜截留时，在截留曲线上所对应该类溶质的最小分子量即为该膜的截留分子量，用MMCO表示。
树脂工作交换容量：是表示单位质量或单位体积的树脂所能交换的离子（相当于一价离子）的物质的量。
生物工程下游技术实验（整理版）
生物工程下游技术实验（整理版）生物工程下游技术实验实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA 具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。
遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。
所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。
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度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用 2～3mol/L 浓度的（NH4）2SO4 保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。
2、影响盐析的因素有那些
~
答：盐析的影响因素①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实 际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度 即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用， 除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更
{
华南师范大学实验报告
学生姓名： 黎嘉俊
学
号：008
专业：
生物工程
年级、班级：10 工程一班 课
程名称：生物工程下游技术实验 实验项目：盐析β-D 甘露聚糖
酶
>
活力测定
实验类型：□验证□设计□综合 实验时间：2013 年 9 月 24 日
实验指导老师：江学文
实验评分：
一．实验目的
1、掌握β-D 甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。 2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D 甘露聚糖活力的操作方法。
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突 出的优点：
1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～ 4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在 0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。
721 型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。的醋酸缓冲液
四、实验步骤
1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在 4000rpm，离心 10min。收集沉淀，加 约 20 毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。 （透析袋处理：剪成 15 ㎝长度，沸水浴中煮 10min，捞起、扯开，在一端 1 ㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏 为止。处理过程中需戴手套！） 2、酶液倒入透析袋后，另一端 1 ㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口， 浸于 4～5℃的蒸馏水中（250ml 烧杯），持续时间，并不时搅拌，期间每隔 20min 更换 1 次 4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约 150 毫升。 注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！ 2、透析同时可准备 2 支 50ml 的比色管，各加魔芋精粉，加的醋酸缓冲液溶解。
五．实验结果
（
0.1%标准甘露糖溶液体积/ml OD1 OD2 OD3 OD平均值 OD标准差
0
2
4
6
8
1
0
0.097 0.416 0.873 1.256 1.674
0
0.097 0.415 0.874 1.256 1.674
0
0.097 0.415333 0.873333 1.255333 1.674
0
0 0.000577 0.000577 0.001155
0
六．分析与讨论
（1）本次实验的第一步是标准曲线的制作，在使用分光光度计测定OD值时发现， 加入的%标准甘露糖溶液体积为10ml的比色管的试样测出的OD值略大，正常来 说OD值若大于时虽进行稀释否则误差较大。据分析多组的数据显示装有10ml的 试样测出的OD值多数超过，可能是试样浓度太大引起，但超出范围较小，在可 以接受的范围内，而且曲线的上升趋势仍然正常，没有出现较大程度的偏离，相
华南师范大学实验报告
学生姓名： 黎嘉俊
学
号：008
专业：
生物工程
年级、班级：10 工程一班 课
程名称：生物工程下游技术实验 糖
实验项目：黑曲霉β-D 甘露聚
酶的纯化
实验类型：□验证□设计□综合 实验时间：2013 年 9 月 17 日
实验指导老师：江学文
实验评分：
一．实验目的
<
1、粗酶的制备 2、硫酸铵分级沉淀 3、透析袋的处理方法和使用
∴酶活力（u/g 湿基）=
×
，
=16330×10×20×40/（2×27）×1/4
≈×108u/g
六、分析与讨论
(1)本次实验是基于第一次实验的标准曲线的基础上进行的，在测量 OD 值的时候 不需要用第一次实验的空白对照，因为测量出来的样本 OD 和样本空白 OD 相减 能消去空白 OD 的值，因而可以把样本空白 OD 作为对照，调零操作，直接能显 示样本 OD 减去样本空白 OD 的结果作为实验的结果。本次实验测量的结果偏大， 有第一台仪器测量能达到，另一台仪器的结果比较合适，为左右，但仍比正常的 数值偏大很多，数值不在实验第一步得出的标准曲线上，不在标准曲线的适用范 围内的数值的话，带入得出的公式误差会很大。通常测量的 OD 值取用范围在以 内，超过该数值误差比较大，若要再进行实验最好进行稀释，测量得出的 OD 值 再乘以稀释倍数。若直接取用本次的较大的测量数据也能带进公式求出，不过误 差较大。 (2)本次实验测量的 OD 值偏大，经过观察发现比色杯里面有絮状悬浮杂质，而且 液体的颜色明显偏深，进行实验之前其实最好进行过滤再进行 OD 值的测量。而 且实验的各组出现的情况也相同，都是 OD 值偏大，都能上到，可能实验用的酶 液的原料也不纯，有杂质等原因。 (3)实验的第二步，酶液倒入透析袋后，浸于 4～5℃的蒸馏水中（250ml 烧杯）， 持续时间，并不时搅拌，期间每隔 20min 更换 1 次 4～5℃的新鲜蒸馏水，以利
二．原理
1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质 分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集 并从溶液中析出。 2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为 39000 和 40000，选择 MWCO（切割分子量或截留分子量）14000 的透析袋，透过掉分子量小于 1000 的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
关系数为，而且图中个点的位置都在标准曲线的附近并没有偏离太多，均匀分布
在曲线的两端，结果比较理想，因而该曲线符合实验的要求。
（2）本实验的第二步为转速 135rpm，摇床摇 60 min 后，用￠15 ㎝滤纸过滤， 耗时较长而且效果不太好，可以采用高速离心，转速 8000rpm，10min，溶液分 层明显，然后直接用滤纸过滤仍然有较好效果，且耗时短，过滤时如遇到过滤较
③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物， 温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶 液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的 溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要 求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在 0℃～4℃下 操作，以避免活力丧失。
B
25 20 2 1.5
n
1 4
27
B 所测吸光度值在标准曲线上的葡萄糖 g / ml； 25 测吸光度时比色管定容体积，ml； 20 溶解沉淀的体积,ml； 2-水解消耗的酶液体积； n 反应液稀释倍数； 4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g（湿基）
…
OD1 OD2 OD3 OD平均值 OD标准差
样本OD值-样本空白OD值 2.523 2.519 2.524 2.522
0.002645751
∵Y=（样本 OD 值-样本空白 OD 值）=
∴Y=→x=Y/=≈
又∵%标准甘露糖溶液浓度为 1mg/ml
∴酶活力（u/g 湿基）=
×
又∵反应液的稀释倍数 n=20/(2/6×=40
B=×1mg/ml×103=16330
4、2 支溶有魔芋精粉的 50ml 比色管，1 支加透析好的酶液 2ml；另 1 支加 灭活的透析酶液 2ml（用做对照），55℃水浴下反应 10 min，取出，立 即进行下面操作：事先准备 2 支 50 ml 的比色管，1 支加 DNS 试剂，立即加
酶解反应液；另 1 支加 DNS 试剂，立即加对照管的酶解反应液，2 管同时沸水
难的情况，可以更换滤纸继续操作。
（3）实验的第三步是取滤液 40 毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO4 克， 待加入部分溶解后再加入剩余部分，否则不能沉淀出绝大多数的蛋白质，影响实
验的结果，造成误差。
七．思考题
1、（NH4）2SO4 沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些 答 ：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白 质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最 广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不 需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。
迅速达到平衡，因为酶液的处理条件比较温和，尽量在低温条件下处理，以免酶 失活。而且透析的过程中要不断搅拌，这样可以加快铵根离子的排除，减少后面 实验结果的误差，也能缩短实验时间。但是操作的时候要注意，要封好透析袋的 两个口，不能让外面的水进去，否则会引起较大的误差。
`
中性盐沉淀蛋白质的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH 都是亲水基团， 这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm～ 100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性 基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度 也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水 性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏 了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。
大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通 常认为比较适中的蛋白质浓度是％～％，相当 25mg/mL～30mg/mL。