蛋白质工程重点
蛋白质工程重点
一、名词解释1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。
3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞(Unit cell)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。
7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。
8、化学势（位）移（）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。
9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。
蛋白质重点
蛋白质工程重点内容总结
实验四 含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制
【实验目的】：掌握菌种活化过程，熟悉无菌操作过程
【实验原理】：菌种活化就是逐级扩大培养，是为了得到纯而壮的培养
物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要
2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所
以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。
蛋白质工程试验项目
实验一 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备 实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳 实验三 豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察 实验四 含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制 实验五 BL21-ERAF17 目的蛋白基因的检测 实验六 目的蛋白ERAF17的诱导表达及蛋白处理 实验七 目的蛋白质电泳、染色、脱色及对比观察
溶液成分
总体积 5ml
总体积 10ml
总体积 15ml
总体积 20ml
总体 积 25ml
总体积 30ml
15%
水
1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml
30%丙烯酰 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 胺
1.5MTris(pH 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 8.8)
入胶板中赶走气泡，使其凝固。 4）在PCR产物中加入5ul loadingbuffer后混匀。 5）选择DNA2000 marker 为标准上样。 6）PCR产物上样。 7）在紫外凝胶成像系统中观察实验结果。
实验六 目的蛋白ERAF17的诱导表达
【实验目的】：熟悉细菌液体培养过程，掌握诱导原核生物表达外源蛋 白的原理及方法 【实验原理】：目的基因ERAF17 克隆在PET-28载体上，控制该基因的 启动子为诱导型启动子需要在培养基中加入乳糖类似物IPTG目的基因才 会表达，加入IPTG一定时间后目的蛋白在细胞中不断的积累，一定时间 后表达量最大。 【实验设备及药品】：37度恒温摇床、移液器、恒温水浴锅、IPTG。 【实验步骤】： 1．挑取含有目的基因ERAF17的单菌落，接种于5 ml LB培养液中（含 50 µg/ml，卡那霉素），37 ℃振荡培养过夜 2．取过夜培养液按1:100的比例扩大培养。 3．在OD600值0.6-0.7时取1 ml菌液收集菌体备用。取完菌液后，在培养 液中加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L进行诱导，经不同的诱导时间（1 h， 2 h，3 h，）后取1 ml培养物收集菌体。 4．将收集的所有菌体用1×蛋白上样缓冲液重悬，100 ℃ 8-10min后离 心，取上清备用。
蛋白质工程复习要点
1:蛋白质工程与基因工程的区别基因工程：把外源基因转入适当的生物体内，从而表达出蛋白质蛋白质工程：对蛋白质的基因进行改造，从而改造其编码的蛋白质2创造和改造蛋白质的方法改造1活性部位2结构顺序方法：物理化学法_通过变性复性，修饰蛋白质侧链基团，分割肽链，改变表面电荷分布。
生物化学法_利用蛋白酶选择性分割蛋白质;用转糖苷酶，酯酶，酰酶等改变化学集团；用转酰胺酶是蛋白质发生胶连。
基因重组法。
3：氨基酸分类，蛋白质结构分类①氨基酸分类依据一：R基结构，分为脂肪族氨基酸、芳香族、杂环族、杂环亚依据二：R基极性，分为非极性中性氨基酸（甘丙缬亮蛋色苯丙异亮）与极性氨基酸②1极性中性_R基不解离（丝苏酪半胱谷氨天门冬）2酸性3碱性（组赖精）蛋白质结构分类：按结构域分类1α型(α螺旋含量>60%)2β型(桶状或柱状)3α/β型(α包围β,αβα样式)4α+β,α与β空间分离,位于分子不同部位4：蛋白质折叠过程动力学有哪些障碍动力学途径指导折叠过程,避免大量无规则构象的筛取.但会对正确折叠产生障碍:1中间体通过外漏疏水集团结合2不正确的二硫键形成3脯氨酸残基的异构化（分子伴侣等消除此不利）5：蛋白质二级结构，结构域，超二级结构，疏水内核二级结构：多肽链借助氢键形成的局部结构，有α螺旋，β折叠等。
超二级结构：邻近的二级结构在空间折叠上靠近，形成的二级结构聚合体（αα，βββ，βαβ）。
结构域：蛋白质亚基中明显分开的紧密球状结构。
疏水内核：蛋白质结构共同特征，在分子内部，都有一个由疏水侧链堆积形成的结构。
有稳定结构的作用。
6：蛋白质结构测定方法，分子伴侣，增加蛋白质结构稳定性的途径①结构测定方法：X-ray，核磁共振，荧光转移法_纤维衍射法_理论建模法②帮助蛋白质和正确折叠然后离开的蛋白质分子③降低折叠态与非折叠态的熵差，以减少非折叠态的构象（引入二硫键；增加Pro，替换Ala）；稳定α螺旋（通过残基替换抵消电荷）；填充疏水内核7：蛋白质设计目标及怎样解决1热稳定性（引入二硫桥增加氢键数目与表面盐桥改善内部疏水堆积）2对氧化的稳定性（把Cys-Ala、Ser_Met-Val_Trp-Phe）3对重金属的稳定性（Cys-Ala、Ser_ Met-Val_替换表面羧基）4PH稳定性（替换表面电荷基团_内离子对置换_内His,Cys,Tyr的置换）5提高酶学的性质（增加逆转数_改变酸碱度）热氧化金属PH酶目的：为蛋白质工程提供指导性信息与探索蛋白质折叠机理。
蛋白质工程复习资料整理版
蛋白质工程复习资料整理版一．名词解释：1.自由界面扩散法：它是根据蛋白质在不同溶剂中的溶解度不同，选择两种溶解性差别大的溶剂，将溶有待结晶蛋白质的溶液小心地放在另一种溶液的上层，首先在界面区域达到瞬间的过饱和，随着两层溶液互相扩散，各自形成一个浓度梯度，当扩散趋向平衡时，蛋白质的溶液达到一定的过饱和度，便形成了晶核。
2.丝素蛋白：是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)和丝氨酸(ser)约占总组成的80％以上3.大豆分离蛋白(SPI)：是以大豆为原料经过加工制成的，大豆分离蛋白等电点4. 5～5 ,4.PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的区带电泳，它是在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质，属于非解离电泳。
5.角蛋白:是非水溶性蛋白质，存在于皮肤、毛发、羽毛、指甲、爪和蹄中。
角蛋白中含有大量胱氨酸，二硫键的形成是非水溶性的主要原因。
6.蛋白质纤维:是指基本组成物质为蛋白质一类的纤维,按来源分有天然的和人造的和再生的两种。
7.结构域：二级结构和结构模式以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。
8.胶原蛋白：是构成细胞外基质的主要成分之一, 广泛存在于哺乳动物体内。
其良好的生物相容性, 稳定的理化性质使其成为生物工程和生物制药中的重要载体。
9.蛋白质工程：按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。
包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。
为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。
10.热塑性挤出：指含水量低的粉状原料在剪切场中同时受压受热，形成塑块，迫使其通过成型模具。
11.固定化酶：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。
蛋白质工程重点
• 蛋白质结构具有的一个共同特征 • 疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力 • 疏水内核是天然蛋白质稳定的基本结构因素
β-折叠(β-sheet)
折叠的几种形式
1.平行型 2.反平行型 3.混合型
扭转的肽链twisted strand： ➢链都是沿其前进方向不断扭转，从而使实际蛋白质结构中 出现的层都不是平直的，而是一种扭转层。 ➢右手扭转
体外蛋白合成系统原核表达系统大肠杆菌芽孢杆菌体内酵母真核表达系统昆虫细胞动物细胞转基因动植物79寄主优点缺点细菌有许多参考资料和很多经验可用生物活性与免疫原性可能与天然蛋白不同载体选择范围广没有转录后修饰容易高产量地生长内毒素含量高产物能被指定分泌进培养基中酵母菌没有能检测到的内毒素基因表达较不易控制公认安全糖基化与动物细胞不同发酵相对便宜容易糖基化和形成二硫键分泌产物的分离简单非常确定的大规模生产和下游加工80寄主优点缺点昆虫细胞棒状病毒载体许多加工机制与真核细胞相似产物与天然蛋白间的功能特性和抗原特性区别较少安全棒状病毒合适寄主的节肢动物很少产物功能上未必总是完全相同已受到fda批准作临床试验糖基化机制上缺少信息产物高水平的表达哺乳动物细胞生物活性与天然蛋白相同生长细胞困难又昂贵能得到哺乳动物表达载体细胞生长慢能大规模生产培养转染的细胞可能遗传不稳定与微生物比较生产率低植物转化率低增代时间长812
• 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎 与轴平行，第一个氨基酸残基的酰 胺基团的-CO基与第四个氨基酸残 基酰胺基团的-NH基形成氢键。
• 蛋白质分子为右手-螺旋。
两亲性amphipathicity
• 螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧 主要集中疏水残基
• 可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测 • 对生物活性具有重要作用
蛋白质工程复习要点
1.定点突变技术：它以单链的克隆基因为模板在一段含有一个或几个错配碱基的寡核苷酸引物存在下合成双链闭环DNA分子。
用该双链闭环DNA分子转入宿主细胞,可解链成两条单链,各自可进行复制,合成自己的互补链,从而可得到野生型和突变型两种环状DNA,分离出突变型基因, 并引入到表达载体中就可经转化利用宿主细胞获得突变型的目的蛋白质。
2.杂合蛋白技术：原理：将不同来源的功能结构域经过组合,产生具有新的生物学功能的杂合多肽举例：鼠源scFv＋大肠杆菌β-半乳糖苷酶N-末端3.易错PCR(error prone PCR, EP PCR)：利用低保真度TaqDNA 聚合酶，或者改变PCR 反应体系的条件，在新链DNA 聚合过程中随机引入错配碱基，经多轮PCR 扩增，构建序列多种多样的突变库。
特点：不改变基因长度，突变频率控制在适度范围，能有效地获得有益突变体举例：厌氧菌N. patriciarum 中，木聚糖酶4.DNA 改组技术(DNA shuffling)：原理：先切割产生随机大小的DNA 片段，再用无引物PCR 将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子，最后进行扩增得全长基因举例：α-干扰素5.交错延伸( Stagger extension process)：原理：a.在PCR 反应中把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间(55 →5s)，从而只能合成出非常短的新生链，b.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。
c.此过程反复进行，产生间隔的含不同模板序列的新生DNA 分子。
酯酶KCTC1767稳定性和底物耐受性。
6.酶工程：是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学。
研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法。
7.蛋白质工程：通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系,并使蛋白质更好地造福于人类。
蛋白质工程考试复习资料
名解蛋白质工程：蛋白质工程是以蛋白质的结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。
结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。
结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。
分子伴侣：是一类相互之间有关系的蛋白分子，能识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽并与多肽的一定部位相结合，帮助这些多肽转运、折叠或组装，但其本身并不参与最终产物的形成。
定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。
这种策略只针对特定蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。
第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程统称为蛋白质的化学修饰。
基因突变的概念：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。
蛋白质组学：蛋白质组学定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为(如疾病过程和药物效应)，以及基因表达调控的机制的学科。
双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。
蛋白质工程的原理和应用重难点
蛋白质工程的原理和应用重难点一、蛋白质工程的原理蛋白质工程是一种通过改变蛋白质的结构和功能来设计和构建新的蛋白质的技术。
它是蛋白质科学领域的一项重要研究方向，可以用于改善或增强蛋白质的性能，开发新的药物或生物材料。
蛋白质工程的原理主要包括以下几个方面：1.1 蛋白质结构设计蛋白质的结构是其功能的基础，通过合理设计蛋白质的结构可以增强其稳定性和活性。
蛋白质结构设计会考虑到蛋白质的二级结构、三级结构和四级结构等方面，通过改变氨基酸序列、添加或删除结构域等手段来调节蛋白质的功能。
1.2 重组蛋白质技术重组蛋白质技术是蛋白质工程中常用的一种方法，通过利用基因工程技术，将目标蛋白质的基因导入到宿主细胞中，使其表达出目标蛋白质。
这样可以大量产生目标蛋白质，并帮助研究人员研究其功能。
1.3 蛋白质工程的模拟和计算蛋白质工程的原理还包括模拟和计算。
通过使用计算机模拟和计算方法，可以对蛋白质的结构进行预测和分析，为蛋白质工程的设计提供指导。
例如，可以通过分子动力学模拟来研究蛋白质的稳定性和折叠动力学。
二、蛋白质工程的应用重难点蛋白质工程的应用涵盖了多个领域，包括药物研发、生物技术和生物工程等。
然而，在实际应用中，常常会面临以下几个重难点：2.1 蛋白质的稳定性蛋白质在多种条件下都会发生失活或降解，而在许多应用中需要蛋白质具有较好的稳定性。
如何提高蛋白质的稳定性，防止其在储存、传输和应用过程中发生降解，是一个重要的难题。
常见的解决方法包括选择稳定性较高的蛋白质模板、引入稳定性突变、改变环境条件等。
2.2 蛋白质的活性蛋白质的活性是衡量其功能的重要指标，但在蛋白质工程中，常常会遇到如何增强或恢复蛋白质活性的问题。
这包括如何通过改变蛋白质结构来提高其催化效率、抑制剂结合性等。
解决蛋白质活性问题的方法包括结构设计、基因工程和蛋白质修饰等。
2.3 蛋白质的特异性蛋白质的特异性是指其与特定受体或底物的识别和结合能力。
在某些应用中，需要蛋白质具有较高的特异性，但在设计和构建蛋白质时往往会面临如何提高或调节蛋白质的特异性的问题。
蛋白质工程重点
一、名词解释1、蛋白质工程（Protein Engineering)—-以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体(supersecondary structure，motif)——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体,并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等.3、结构域(domain）-—是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding）-—从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone）—-一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞（Unit cel l)—-空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位.7、核磁共振现象(nuclear magnetic resonance ，NMR）-—指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂（Zeeman splitting），共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。
8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中,各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。
9、耦合常数(J)--由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。
高中生物蛋白质工程知识点
高中生物蛋白质工程知识点基因工程是生物工程技术的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
接下来店铺为你整理了高中生物蛋白质工程知识点，一起来看看吧。
高中生物蛋白质工程知识点：概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
高中生物蛋白质工程知识点：基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬¬DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
蛋白质工程-复习提纲
蛋白质工程第一章——绪论一、蛋白质工程的定义？狭义定义：蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质广义定义：蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质（简单来说：蛋白质工程就是一门改造设计蛋白质的学科）二、蛋白质工程的基本研究内容？研究内容总体可分为四大部分：（1）蛋白质的基础知识——结构、理化性质、生物功能、功能与结构的关系（2）蛋白质的物质准备——表达、纯化（3）蛋白质的研究方法——结构解析、分析鉴定、蛋白质组学研究（4）蛋白质的改造应用——设计改变、功能应用、蛋白质生物信息学或者可分为三大部分：（1）蛋白质结构分析——基础（关系学）（2）结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证（实验科学）（3）创造和/或改造蛋白质——新蛋白质——终目标（工程学）三、蛋白质工程的应用（1）蛋白质工程应用蛋白质多肽药物、新型疫苗、工业用酶……（2）蛋白质工程意义1）在医药、工业、农业、环保等方面应用前景广泛2）对揭示生命现象的本质和生命活动的规律具有重要意义3）是蛋白质结构形成和功能表达的关系研究中不可替代的手段（3）蛋白质工程的支持技术定点突变等遗传操作技术；蛋白质结构解析技术；生物信息学分析技术；蛋白质的设计、表达、生产技术第二章——蛋白质结构与功能一、蛋白质的生物学功能调节功能、防御/攻击、支架作用、信息传递、运动功能、转运功能、储存功能、催化功能、结构成分二、蛋白质基本化学组件（1）氨基酸（amino）1）氨基酸种类：二十种天然氨基酸、稀有氨基酸、非天然蛋白质氨基酸2）氨基酸的化学组成与结构：①均含有C 、H 、O 、N 、S，以一定比例存在。
有些含有微量的金属元素（如铁、锌、钼、镍等）②易被酸、碱和蛋白酶催化水解为胨、肽。
共同的化学结构（除脯氨酸）3）氨基酸的性质极性氨基酸：Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、His、Tyr——二硫键疏水氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Met、Trp——疏水内核荷电氨基酸：Arg、Lys、His（+）；Asp、Glu（-）——PI，蛋白分离谱特性、紫外线吸收特性——检测（3）肽单位、多肽链1）肽键定义：由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而形成的化学键。
蛋白质工程技术知识点总结
蛋白质工程技术知识点总结蛋白质是生物体内功能最多样化的大分子，具有多种生物学功能，在生物医学领域有着广泛的应用。
蛋白质工程技术是指利用基因重组、蛋白质工程和蛋白质设计等技术手段，对蛋白质进行人工改造和设计，以获得具有特定功能和性质的蛋白质。
本文将围绕蛋白质工程的基本原理、技术手段和应用领域进行介绍和总结。
一、蛋白质工程的基本原理1. 基因重组技术基因重组技术是蛋白质工程的基础技术，通过将感兴趣的基因分子导入到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达这些基因，从而产生感兴趣的蛋白质。
常用的基因重组技术包括质粒转染、病毒载体转染、基因枪转染等。
2. 蛋白质纯化技术蛋白质的产生过程中会伴随很多其他杂质，因此需要对蛋白质进行纯化。
目前常用的蛋白质纯化技术主要包括离子交换、凝胶过滤、亲和纯化、透析、超速离心等。
3. 蛋白质结构分析技术蛋白质工程需要对蛋白质的结构进行分析，以确定蛋白质的二、三维结构，常用的技术包括X射线晶体学、核磁共振、质谱、表面等离子共振等。
4. 蛋白质工程设计和改造技术蛋白质工程的设计和改造技术是指对蛋白质的氨基酸序列进行修改、融合、重组等，以获得更理想的蛋白质性质和功能。
常用的技术手段包括点突变、插入、删除、重组、融合以及改变翻译后修饰等。
二、蛋白质工程的技术手段1. 蛋白质工程中的点突变技术点突变技术是通过对蛋白质基因进行特定的DNA序列改变，使蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而改变蛋白质的性质和功能。
常用的点突变技术包括重叠PCR、引物设计、缺失突变和插入突变等。
2. 蛋白质工程中的插入和删除技术插入和删除技术是指在蛋白质的氨基酸序列中直接插入或删除特定的氨基酸残基，从而改变蛋白质的结构和功能。
常用的技术手段包括基因克隆、引物设计、限制性内切酶切割等。
3. 蛋白质工程中的重组和融合技术重组和融合技术是指将两种或多种不同的蛋白质基因进行重组组合，从而产生具有新功能和性质的蛋白质。
常用的重组和融合技术包括PCR扩增、质粒构建、引物设计等。
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1. 蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
2. 酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。
3. 酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4. 蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5. 蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6. 蛋白质晶体学：利用X 射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
8. 定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
10. 酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11. 酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度（NH4）2SO4 ）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
12. 微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。
《蛋白质工程是基因工程的延伸》 知识清单
《蛋白质工程是基因工程的延伸》知识清单一、基因工程的基本原理基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程的操作通常包括以下几个关键步骤：1、目的基因的获取：从生物细胞中提取出所需的基因片段，可以通过化学方法合成，也可以从基因文库中筛选获得。
2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体（如质粒、噬菌体等）连接，形成重组 DNA 分子。
3、将目的基因导入受体细胞：常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等，使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。
4、目的基因的检测与鉴定：通过分子水平和个体水平的检测，确定目的基因是否成功导入、转录和翻译。
基因工程的应用十分广泛，比如在农业领域，通过基因工程可以培育出抗虫、抗病、抗逆的农作物新品种；在医药领域，可以生产出胰岛素、生长激素等药物。
二、蛋白质工程的概念与特点蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
与基因工程不同，蛋白质工程不是直接对蛋白质进行改造，而是通过对基因的操作来实现对蛋白质的改造。
它的突出特点是能更有针对性地改造蛋白质的结构和功能。
三、蛋白质工程的基本步骤1、从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构，这需要对蛋白质的功能有深入的了解，以及对蛋白质结构与功能关系的清晰认识。
比如，如果要设计一种具有更高催化效率的酶，就需要先明确酶的催化机制和结构特点。
2、推测应有的氨基酸序列根据设计的蛋白质结构，推测出所需的氨基酸序列。
这需要对氨基酸的性质、相互作用以及蛋白质折叠的规律有充分的掌握。
3、找到相对应的脱氧核苷酸序列通过密码子表，将推测出的氨基酸序列转换为相应的脱氧核苷酸序列。
这是基因合成或基因修饰的基础。
《蛋白质工程是基因工程的延伸》 知识清单
《蛋白质工程是基因工程的延伸》知识清单一、蛋白质工程的定义与概念蛋白质工程，简单来说，就是在深入了解蛋白质的结构与功能关系的基础上，通过基因修饰或基因合成等手段，对现有蛋白质进行改造，或者设计制造出全新的蛋白质。
它是一门综合了分子生物学、结构生物学、生物化学和计算机科学等多学科知识的新兴领域。
二、基因工程的原理与应用基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的意愿，在体外将不同来源的 DNA 分子进行重组，然后导入受体细胞，使其在细胞中复制、转录和翻译，表达出人们所需要的产物。
基因工程的应用非常广泛。
在农业领域，通过基因工程可以培育出抗病虫害、抗逆境的作物品种，提高农作物的产量和质量。
在医药领域，基因工程可以用来生产胰岛素、生长激素等药物，为治疗疾病提供了有力的手段。
在工业领域，基因工程可以用于生产生物酶，提高工业生产的效率和降低成本。
三、蛋白质工程与基因工程的关系蛋白质工程是基因工程的延伸，这两者有着密切的联系。
基因工程为蛋白质工程提供了基础。
通过基因工程技术，我们能够获取特定的基因，并将其导入到合适的宿主细胞中进行表达，从而获得所需的蛋白质。
然而，基因工程所得到的蛋白质往往是自然界中已经存在的，其性质和功能可能并不能完全满足人们的需求。
而蛋白质工程则是在基因工程的基础上，进一步对蛋白质进行改造和优化。
它不仅仅是对基因进行简单的操作，而是根据对蛋白质结构和功能的深入理解，有针对性地对基因进行改造，从而实现对蛋白质性质和功能的精确调控。
例如，我们知道某种蛋白质具有一定的功能，但在某些特定条件下其活性不够高。
通过蛋白质工程，我们可以分析该蛋白质的结构，找出影响其活性的关键部位，然后通过基因改造来改变这些关键部位的氨基酸序列，从而提高蛋白质的活性。
四、蛋白质工程的操作步骤蛋白质工程的操作通常包括以下几个主要步骤：1、目标蛋白质的结构和功能分析首先，需要对目标蛋白质的结构和功能进行深入的研究。
这包括确定蛋白质的三维结构、活性位点、与其他分子的相互作用等。
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一、名词解释1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。
3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。
7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。
8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。
9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。
用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。
10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。
二、问答题1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法：随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖1）、Kunkel突变法双突变菌株转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧啶占据的位置。
而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中的尿嘧啶残基。
但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶的失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。
在dut-ung-F’菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养的M13噬菌体的DNA中会含有20-30个尿嘧啶残基。
用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因此产生一些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感的位点。
病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。
Kunkel 突变法正是利用上述机制，首先在dut-ung-的双突变菌株中培养适当的重组M13噬菌体，制备出带U的单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反应混合物转染ung+受体菌，模板链因由U碱基位点的存在而被破坏，野生型噬菌体的产生受到抑制。
大部分（＞80%）的后代噬菌体是由所转染的不带U的负链复制而来的。
由于该链是由突变引物延伸而来的，因此，后代噬菌体多带有突变的目标基因。
所以，Kunkel 突变法所产生的突变体不需要利用标记的寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体。
2）、DpnI法进行定点突变常规大肠杆菌中质粒含DpnⅠ位点添加一对正反向突变引物体外退火延伸模板质粒对DpnⅠ酶敏感，被切除体外合成的突变序列质粒成功转化原理：一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
2、重叠延伸PCR （4个引物）技术（反向引物）（第一轮PCR ，共有4种产物）（引物退火变性延伸）（用DNA 聚合酶扩增至完整链））原理：由于采用具有互补末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.3、蛋白质结构测定方法的优缺点1）、蛋白质结构测定方法：X 射线晶体结构测定、核磁共振波谱法（NMR ）、三维电镜重构。
2）、X 射线晶体结构测定：优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息； 缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）First PCR Remove primers Denature and anneal by DNA polymeraseDNA cloning③X射线晶体衍射的工作流程较长。
核磁共振波谱法（NMR）：优点：①同样具有高分辨率②可以在溶液中操作，接近生理状态③分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理缺点：①样品的分子量要比较小（50KD以下）②对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白）③实验周期长（>1年）三维电镜重构：优点：1.可以直接获得分子的形貌信息；2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）；3.适于捕捉动态结构变化信息；4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；5.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。
缺点：①最大的缺点是分辨率较低②对小分子蛋白效果不佳4、X射线晶体结构测定原理、步骤及优缺点1)、原理：1.光的衍射现象2.X射线的发现及应用3.晶体学基础知识4. X射线晶体衍射⏹光的衍射现象衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强不均匀分布的现象⏹X射线的发现及应用⏹本质的争论（波动说微粒说）⏹X射线衍射的发现⏹晶体学基础知识⏹X射线晶体衍射2）、X射线晶体结构测定基本过程：①蛋白质获取（提纯）②晶体生长并经冷冻技术处理③重原子衍生物制备④衍射数据收集⑤衍生数据分析和改进⑥结构模型的获取（包括修正）3）、优缺点：优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息；缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；③X射线晶体衍射的工作流程较长。
三、简答题（有些没听到）1、空间结构组件及其特点α螺旋（αhelix）、Β折叠（βsheet）、环肽链（loop）、转角（turn）1）.α-螺旋结构：•多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.•肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行(同一方向），具有极性，N(+)、C(-) 。
•中心无空腔，稳定•蛋白质分子为右手α-螺旋。
（选）•螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;•沿主链计算，一个氢键闭合的环包含13个原子，3.613•螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基•对生物活性具有重要作用•可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测两亲性2）、Β折叠：•伸展的构象，每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋•α-碳原子处于折叠的角上，R基团处于棱角上与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm•β折叠片也是一种重复性的结构，可以把它想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成。
肽主链沿纸条形成锯齿状。
•氢键是在片层间而不是片层内形成。
•折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上下二侧伸出。
3）、转角（turn）回折(reverse turn)β转折（转角）(β-turn)γ转折(γ-turn)β发夹β发夹(β－hairpin)无规则卷曲2、蛋白质的空间结构层次一级结构、二级结构、结构模体、结构域、三级结构/亚基、四级结构。
3、第二遗传密码的定义及其特点定义：无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密码。
特点：简并性氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。
•多意性相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。
•全局性在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。
4、表达系统宿主的选择：体内翻译系统体外翻译系统：原核生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌真核生物表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统5、大肠杆菌表达载体的组件复制起始点、选择性基因、多克隆位点（MCS）、启动子(Promoter)、终止子(Terminator)、核糖体结合位点(SD序列)四、其他一）、蛋白质工程绪论1、蛋白质工程化的顺序：工程化：理念－设计－制造－功能实现23•酶工程：酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。
•蛋白质工程：重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。
4、蛋白质工程产生的标志、研究内容、支撑技术1)、1983年，美国的Ulmer在《Science》上首先提出了“Protein Engineering“——蛋白质工程诞生(Science, 219: 666-671. )2）、1. 蛋白质结构分析——基础2. 结构、功能的设计和预测——基础的应用与验证3. 创造和/或改造蛋白质——新蛋白质——终目标3）、蛋白质结构解析技术、生物信息学分析技术、定点突变等遗传操作技术二）、蛋白质结构基础5、氨基酸的构型与构象及多肽链构象的表征参数•构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）–构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成–不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合–化学上可以分离，不可由单键旋转相互转换•构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布–构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成–化学上难以区分和分离表征参数：（1）多肽链的构象角(φ,ψ)（2）拉氏构象图（Ramachandra plot）及多肽链构象的允许区6、可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测两亲性7、β折叠的几种形式：平行型/反平行型、混合型（选）8、蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，二硫键的数目和排列方式9、维系蛋白质结构的作用力：肽键、二硫键、氢键、离子键、疏水键、范德华力维持蛋白质一级结构的作用力是：肽键、二硫键三）、蛋白质折叠10、20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。