蛋白质工程重点

一、名词解释

1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。

2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。

3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。

4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。

5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。

6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。

7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。

8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。

9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。

10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。

二、问答题

1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法：

随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物

定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖

1）、Kunkel突变法

双突变菌株

转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除

原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧

啶占据的位置。而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中的尿嘧啶残基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶的失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F’菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养的M13噬菌体的DNA中会含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因此产生一些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感的位点。病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。

Kunkel 突变法正是利用上述机制，首先在dut-ung-的双突变菌株中培养适当的重组M13噬菌体，制备出带U的单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反应混合物转染ung+受体菌，模板链因由U碱基位点的存在而被破坏，野生型噬菌体的产生受到抑制。大部分（＞80%）的后代噬菌体是由所转染的不带U的负链复制而来的。由于该链是由突变引物延伸而来的，因此，后代噬菌体多带有突变的目标基因。所以，Kunkel 突变法所产生的突变体不需要利用标记的寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体。

2）、DpnI法进行定点突变

常规大肠杆菌中质粒含DpnⅠ位点添加一对正反向突变引物体外退火延伸模板质粒对DpnⅠ酶敏感，被切除体外合成的突变序列质粒成功转化

原理：一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

2、重叠延伸PCR （4个引物）技术

（反向引物）

（第一轮PCR ，共有4种产物）

（引物退火变性延伸）

（用DNA 聚合酶扩增至完整链）

）

原理：由于采用具有互补末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.

3、蛋白质结构测定方法的优缺点

1）、蛋白质结构测定方法：X 射线晶体结构测定、核磁共振波谱法（NMR ）、三维电镜重构。

2）、X 射线晶体结构测定：

优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息； 缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；

②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）First PCR Remove primers Denature and anneal by DNA polymerase

DNA cloning