植物转基因-植物表达载体构建共74页
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体 PCR 置换法适用于构建小分子 RNA 表达载体；重组融合 PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用 In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法 (Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体 PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合 PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年 Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
载体构建
水稻中cdc2超表达载体的构建生物技术专业 吴娇娇指导教师： 傅体华教授 寿惠霞教授摘要：每个细胞都是一个细胞周期的产物。
细胞增殖是由一系列细胞分裂调控机制精确控制的，在此过程中细胞周期蛋白依赖性激酶起着关键作用。
由p34cdc2和细胞周期蛋白组成的复合物在真核生物中被称为有丝分裂启动子（MPF），控制从G1到S期的转变，而目前通过转基因的材料来研究水稻中cdc2的报道比较少。
为了了解细胞分裂调控基因cdc2在水稻中的作用，通过基因芯片我们得到了一个水稻的cdc2同源基因，期望通过对其超表达得到一些水稻中细胞周期调控的信息。
在此我们选择了包含玉米泛素ubi启动子的双元载体pCAMBIA1390-ubiquitin作为超表达载体，该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定表达。
之后我们将最终载体通过电击转化进入强毒力农杆菌强毒力菌株EHA105，保菌。
经典的构建载体的构成就是一系列是酶切和连接反应，因此如何能够高效的进行酶切和连接反应就成为提高构建效率的关键。
在实验中我们也积累了一些经验，同时也改进了一些方法以提高效率。
关键词：细胞分裂调控基因2；细胞周期蛋白；超表达；双元载体Construction of overexpressing vector for rice cdc2 geneBiotechnology Wu JiaojiaoAcademic advisor Shou HuixiaAbstract：Every cell in life is the production of cell division which is controlled by a serial precise reaction. Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) play an important role in regulating the eukaryotic cell cycle. A key element of cell cycle control in eukaryotes is the M-phase kinase, composed of p34cdc2 and cyclin A. To dissect the plant cell cycle, we have previously got a cdc2 (cell division control) gene which is homologous to Arabidopsis thaliana from Oryza sativa through DNA chips, We have cloned it into a overexpressing vector termed pCAMBIA1390-ubiqiutin using ubi as promoter which can express efficiently in E.coli and Agrobacterium, then it could be transformed into rice callus. So the target gene is tightly linked to a strong constitutive promoter from Maize, which can over express cdc2. In this study, it is found that digestion and ligation are the key steps in the construction of vector. Some questions in experiment were found and discussed in this paper.Key words:cdc2；cyclin；overexpression；binary Ti vector细胞周期的进程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的活性变化来控制的。
植物表达载体构建
Jellyfish Aequorea victoria: one of the oldest species on the earth
Green Fluorescent Protein (GFP)
This is a stereo view of GFP generated from the Brookhaven Database using R If you have the Chyou may follow the links to see GFP in action!
病毒衍生载体
比较小，易侵染植物并大量扩 增，可大量表达蛋白，但一般 难于整合到植物基因组中。
启动子
35S, Nos, others 蛋白质定位：GFP融合蛋白， GUS 融合蛋白 基因表达：启动子-GUS（蛋白）, 启 动子-GFP（蛋白）。
启动子的种类
组成型启动子 诱导型启动子 组织特异型启动子 在某些情况下，一种类型的启动子往往兼 有其它类型启动子的特性
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温， 在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物 质。 初始产物并不带有颜色，为无色的吲哚衍生物， 后经氧化二聚作用形成5，5‘-二溴-4，4’-二氯 靛蓝染料，使具有Gus活性的部位或位点呈现 蓝色。 注意：在测定时，由于植物体内的过氧化物酶 能促进氧化二聚作用，使颜色加深，所以染色 程度不能准确反映Gus活性，
Figure 1 a) Mature cold stored potato tubers, transformed and control, stained for GUS activity. b) In vitro-grown microtubers, transformed and control, stained for GUS activity
植物表达载体构建
（三）中间表达载体的构建：
中间载体从功能上看可分为两大类：克隆 载体和表达载体。
克隆载体的主要功能是复制和扩增基因； 表达载体是适于在受体细胞中表达外源基 因的载体。
中间表达载体含有植物特异启动子，因而 能在植物中表达外源基因。
（三）中间表达载体的构建
1．启动子及其它调控序列：
转录的调控对真核生物基因表达起着关键的作用。大多 数真核生物在转录起始点的 5’ 端上游区第 30 至 25bp 处具有 TATA盒，在70至 80bp处还有 CAAT盒；3’ 端具有AATAA序 列。Ti质粒的Nos、Ocs、Tmr等基因都具有与真核生物启动 子类似的 TATA 盒和 CAAT 盒，均能在植物细胞中表达，且 无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子， 其中以Nos启动子（pNos）最常用。后来发现，由CaMV35s 启动子、外源结构基因和Nos 3’端的非编码区域组成的嵌合 基因，能在植物细胞中高效表达。 CaMV35s 启动子既无组 织特异性，又不受发育时期的影响，是一个较理想的植物基 因工程启动子。 现在已发现很多诱导启动子和特异表达的启动子，被用 于各种不同的转化目的。
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
植物生物技术：第九章 植物遗传转化载体
农杆菌可分为根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciems（含Ti质粒 ）和发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes （含Ri质粒） ，在植
物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。
35
病毒载体感染植物细胞以后只是利用寄主细胞的功能在细胞质进 行复制和表达；同时又由于病毒具有高效自我复制能力，故在转 化植物中可得到高拷贝外源基因，从而十分有利于外源基因的表 达和功能的实现
10
Ti质粒结构
毒性区（vir区）：激活T－DNA的转移
T－DNA区： 侵染植物时，从Ti质粒上 被切割，转移到植物细胞中，带有与 肿瘤形成有关的基因
接合转移区：存在与细菌间进行接合有 关的基因
复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制
T-DNA 区
Cytokinin
Auxin
Opine
左边界
右边界
Ti 质粒
第九章 植物遗传转化载体
1
第9章 植物遗传转化载体
本章主要内容
• 第一节 植物遗传转化载体的种类及特点 • 第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建 • 第三节 植物病毒载体 • 第四节 叶绿体转化载体 • 第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择标记基因转化系统
2
第9章 植物遗传转化载体
本章教学目的与要求
含子、信号肽等）连接在一起构成基因。
22
启动子
Ti质粒
Nos（胭脂碱合成酶基因）、Ocs（章鱼碱合成酶基因）等
基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植 物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建 嵌合基因的启动子。
《植物转基因技术》PPT课件
T-DNA区：能够转移整合入植物受体基因组， 并能在植物细胞中表达，从而导致 冠瘿瘤发生。
Vir区：由多个毒性基因组成， 其编码蛋白对 T-DNA的转移和整合 必不可少。
1.Ti质粒上的T-DNA：
仅存在于被感染植物细胞的细胞核中，整 合到植物基因组中 ，T-DNA以单拷贝或多拷贝 形式插入植物基因组中,插入的位点也各不相同。
实例 小麦的基因枪转化
3、幼胚的高渗预培养： 4、微弹的制备与基因枪的轰击（无菌）： 5、抗PPT愈伤组织的选择：白色生长快的为
外源质粒转化的愈伤（见图）。 6、抗PPT再生植株的获得：（见图）
实例 小麦的基因枪转化
7、抗PPT转化植株的耐盐性：
含盐0.7％NaCl条件下转化植株表现较强的耐盐性。
转化后的gus的瞬间表达转化后3周产生的抗性愈伤组织抗性愈伤的gus反应再生的转化植株转化植株叶片的gus表达抗性植株后代的抗性检测自1983年人类首次获得转基因植物后已有大量的抗病抗逆及品质改良的转基因植物获得成功在农业生产上已经发挥了重要的作用
《植物转基因技术》PPT 课件
植物转基因技术： 又称基因重组技术或DNA重组，
二）、转化载体系统：
Ti质粒载体系统一般分为两类： 一类叫共整合载体系统； 一类叫双元载体系统。
（一）、共整合载体质粒：
1.pGV3850 系 统 :
这是第一个非致癌的 Ti质粒衍生载体,来自 胭脂碱型质粒 pTiC58Trac, 包 括 25bp末端序列和胭脂 碱合成酶基因,T-DNA 上的其它基因则为 pBR322 序 列 取 代 。
5. 植物叶绿体基因工程
进行叶绿体遗传转化研究，建立了烟草叶绿体遗传 转化体系。并将一些基因转入烟草叶绿体。
实验一附录 植物转基因载体的介绍
农杆菌感染植物的原理
农杆根瘤菌之所以会感染 植物根部是因为植物根部 损伤部位分泌出酚类物质 乙酰丁香酮和羟基乙酰丁 香酮，这些酚类物质可以 诱导Vir（Virulence region) 基因的启动表达，Vir基因 的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根 瘤染色体上的操纵子基因 产物则与单链T－DNA结合， 形成复合物，转化植物根 部细胞。
Ti质粒的结构 质粒的结构
1. T-DNA——transferred-DNA regions:是农杆菌浸染植物细胞 时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称 之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 2. Vir区—virulence region：该区段的基因能够激活T-DNA转移， 使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区和Vir区在 质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒的三分之一。 3. Con区——regions encoding conjugations：该区段上存在着 与细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌 之间的转移。冠瘿瘤碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因 此称之为结合转移编码区。 4. Ori区——origin of replication：该区段基因调控Ti质粒的自 我复制，故称之为复制起始区。
Ti质粒的结构 质粒的结构
Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在 Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-DNA的组成结构 的组成结构
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反 复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）生长素 tmr由一个基因组成iptz：分裂素 tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物（opines），即冠瘿碱。 opines有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 章鱼碱 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 胭脂碱 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 农杆碱 据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能 利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根 癌农杆菌使用作为氮源及碳源。
叶绿体表达载体--如何构建载体
如何构建载体1启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。
由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。
在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。
然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。
为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。
已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。
例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。
这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。
例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。
对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。
例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。
吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。
实验十五、、表达载体的构建
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验 的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域， 为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和 改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
感谢您的观看
表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并 在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化 等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和 表达外源基因的运载体，它能够将目 的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体 的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应 用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具， 它能够将外源基因在宿主细胞中进行 有效表达，产生所需的蛋白质或代谢 产物。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
第九章 园艺植物遗传转化载体的构建
• Ubiquitin启动子
第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体 的构建
• 二、Ti中间表达载体的构建 • (二)嵌合基因的构建
• 嵌合基因: 来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在
一起而构成的基因.
• 完整的嵌合基因: 完整,正确的可读框,能正确表达,3′端的终止信 号. “植物特异性启动子+目的基因+终止子”、 “植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和 “植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。
一个理想的载体应该具备以下几个 特点：
• 有一个或多个复制起点，可在一种生物体 中自主复制 • 至少有一个多克隆位点，以供外源DNA插入 • 至少有一个遗传标记基因，以指示重组DNA 分子是否进入宿主细胞 • 具有较小的分子质量和较高的拷贝数 • 无毒性
基因工程中所用载体的分类 • 按来源分类
• 细菌质粒 • 噬菌体类 • 酵母质粒 • 病毒DNA衍生物
Ti质粒介导基因转化的原理
• 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮等)。
• 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因 (vir)表达:当根癌农杆菌接触 到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经 VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。
（2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌 产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共 24个基因。
植物表达载体转化农杆菌操作步骤
植物表达载体转化农杆菌操作步骤来源:郭庆水的日志植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分:农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择:LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化:将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线(或加或不加抗生素,LBA4404:Rif 或Str;EHA105:Rif或Str;GV3103:庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失,导致农杆菌缺乏侵染性),抗生素浓度为:50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备:1)挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2)吸取1.5ml菌液于离心管中,冰浴10min;3)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;4)沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min;5)5000(13000)rpm离心30s,弃去上清液;6)每管用100μl 20mMCaCl2悬浮,用于转化;制备好的感受态细胞可马上使用,也可按每管200ul分装于无菌离心管中,于4℃保存48小时内使用,长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出,置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌:1)50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1~1μg(5-10ul),之后冰浴30 min;2)放入液氮中5min(或1min),然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min;3)取出离心管,加入0.5mlLB,28℃、220rpm振荡培养3~5hr;4)取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板,在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)5、重组农杆菌鉴定:1)挑取单菌落,接种于含相应抗生素的LB液体培养基中,28℃振荡培养过夜。
(pEmu载体:AMP+Rif/Str;pK载体:Kan+Rif/Str;pTCK载体:Kan+Rif/Str)2)小量提取质粒DNA,加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg "ml -1,贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml)。
植物基因工程载体
植物基因工程载体转查尔酮合酶矮牵牛花抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒植物基因工程载体分类l质粒转化载体l病毒转化载体Ti质粒转化载体是目前最主要的、最常用的植物基因工程载体。
根瘤农杆菌及Ti质粒的发现Ti质粒是在根瘤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。
根瘤农杆菌及Ti质粒的发现根瘤农杆菌感染植物细胞后，根瘤农杆菌的Ti质粒上的T-DNA被转移并整合到植物细胞染色体上，并引起植物形成冠瘿瘤。
冠瘿瘤根瘤农杆菌Ti质粒在结构上可分为四部分：l T-DNA又称转移DNA区：在农杆菌侵染植物体时，其从Ti质粒上被切割并转移到植物细胞中去，该序列与肿瘤形成有关l毒性区域即vir(virulence)区域：该区段的基因表达激活T-DNA的转移，使植物致瘤。
l接合转移区：存在与细菌接合转移有关的基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移l复制起始区：保证Ti质粒进行自我复制。
只有Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤生成相关。
T-DNA的结构和功能结构特点：左右两端（TL、TR）具有25个碱基对的顺向重复序列；去除TR，失去T-DNA转移和整合功能，不能致瘤；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。
T-DNA上编码的基因有两类：一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢的基因；另一类是诱发肿瘤的基因转移过程：农杆菌感染后，植物细胞接受刺激，释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。
植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒，并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。
受伤的植物细胞产生乙酰丁香酮乙酰丁香酮激活vir基因农杆菌T-DNA整合到植物基因组中合成植物生长素、细胞分裂素、冠瘿碱，冠瘿瘤形成野生型的Ti质粒作为载体的缺陷l Ti质粒分子质量过大，一般在160-240kb，操作麻烦。
l缺乏合适的克隆位点l T-DNA区导致植株产生冠瘿瘤，阻碍细胞的分化和植株的产生；l缺乏大肠杆菌的复制起始位点和筛选标记。