荧光显微镜
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荧光显微镜
基本知识
荧光的性质
• 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长 • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
荧光染色分类：
• 自发荧光 • 二次荧光 • 抗体荧光技术
自发荧光（不加染色）
有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧 光或原发荧光），但在医学和生物学领域 中，只有很少物质具有自发荧光。
•
由普通光学显微镜加上一些附件(如荧
光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断
滤片等)的基础上组成的。
•
特点
光源
• 荧光： 一般采用超高压汞灯(50-200W)， 它可发出各种波长的光，但每种荧光物质 都有一个产生最强荧光的激发光波长，所 以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的 激发光透过照射到标本上，而将其他光都 吸收掉。
察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标
本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。
• BV激发法是以404nm、434nm为中心 的由紫外至蓝光进行激发。
• 该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观 察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断 蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光 片。
• 用于荧光抗体法的荧光色素，对于激 发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波 长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片 必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光 作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较 高，可得到较明亮的图像。
染色
激发光
发射光
自发荧光
不染色
二次荧光
抗体荧光技术（用免疫染色）
利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这 一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体 和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样 两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。
荧光显微镜的种类
透射式
落射式
荧光的特性（1）
• 荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某 轴分布，形成镜象关系
不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即
用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。
光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45
度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，
样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片
表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束
分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被
阻断滤片吸收。
二次荧光（用化学染色）
非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用 荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二 次荧光），以便进行观察。对特定物体选 择合适的荧光色素，该物体就能和周围的 组织或细胞区别出来而可以观察到。
荧光的种类
自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光
滤光片
• 激发滤光片：紧靠光源
UV:340-380nm
有色玻璃
V:390-460nm
种类：
B:460-500nm
干涉滤色片
G:500-570nm
• 截止滤光片：物镜与目镜间
阻断(或压制)滤光片： • 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧
光和损伤眼睛。
• 选择并让特异的荧光透过，表现出专一的 荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜就其光路来分有两种：
• 1． 透射式荧光显微镜
•
激发光源是通过聚光镜穿过标本材料
来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可
用普通集光器，调节反光镜使激发光转射
和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显
微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点
是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观
察较大的标本材料较好。
透射荧光显微镜
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物 镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的 反差。
• 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于 观察。
• 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更源自文库。
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不 能获得明亮的荧光像。
• 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚 的载玻片。
• 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标 本荧光色衰褪。
• 厚的或不透明的标本不适用。
• 2．落射式荧光显微镜：
•
这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上
• 荧光发出时不像普通光那样会产生热效应， 它是冷光。
30----180nm
荧光的吸收及发射光谱
• 荧光发光方向与激发光的方向无关, 它呈球 体辐射 。
• 荧光具有偏振性。
一、荧光显微镜原理
• 原理：
• 荧光显微镜是利用一个高发光效率的
点光源，经过滤色系统发出一定波长的光 作为激发光、激发标本内的荧光物质发射 出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和 目镜的放大进行观察。
组成
• 光源：高压汞灯或卤素灯。 • 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需
要聚光镜。 • 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外
光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没 有限制。 • 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
荧光显微镜下的丝状细菌
反射荧光显微镜原理
• 缺点：
• 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须 用大数值孔径的物镜。
• 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧 光。
• 激发荧光的方式：
•
按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外
线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。
•
UV激发法是用短于400nm的近紫外光进
行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯 激发滤色镜
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。
• 物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可 以获得高分辨率的像。
• 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能 使用。
• 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相 差法和透射微分干涉差法相结合。
• 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
•
在强烈的对衬背景下，即使荧光很微
弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结
构和功能以及化学成分等的研究。
• 荧光显微镜的光源所起的作用不是直接 照明，而是作为一种激发标本的内荧光物 质的能源。我们之所以能观察标本，不是 由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸 收激发的光能后所呈现的荧光现象。
• 荧光显微镜的基本构造 ：
基本知识
荧光的性质
• 保持固有的荧光特性 • 荧光波长＞激发波长 • 荧光强度极小于激发光的强度 • 有不同程度的衰减 • 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
荧光染色分类：
• 自发荧光 • 二次荧光 • 抗体荧光技术
自发荧光（不加染色）
有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧 光或原发荧光），但在医学和生物学领域 中，只有很少物质具有自发荧光。
•
由普通光学显微镜加上一些附件(如荧
光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断
滤片等)的基础上组成的。
•
特点
光源
• 荧光： 一般采用超高压汞灯(50-200W)， 它可发出各种波长的光，但每种荧光物质 都有一个产生最强荧光的激发光波长，所 以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的 激发光透过照射到标本上，而将其他光都 吸收掉。
察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标
本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。
• BV激发法是以404nm、434nm为中心 的由紫外至蓝光进行激发。
• 该方法使用蓝光照射标本，所以荧光观 察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断 蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光 片。
• 用于荧光抗体法的荧光色素，对于激 发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波 长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片 必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光 作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较 高，可得到较明亮的图像。
染色
激发光
发射光
自发荧光
不染色
二次荧光
抗体荧光技术（用免疫染色）
利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这 一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体 和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样 两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。
荧光显微镜的种类
透射式
落射式
荧光的特性（1）
• 荧光的吸收光谱和发射光谱大致对称于某 轴分布，形成镜象关系
不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即
用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。
光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45
度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，
样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片
表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束
分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被
阻断滤片吸收。
二次荧光（用化学染色）
非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用 荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二 次荧光），以便进行观察。对特定物体选 择合适的荧光色素，该物体就能和周围的 组织或细胞区别出来而可以观察到。
荧光的种类
自发荧光：物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光：物质借荧光色素受光激发产生的荧光
滤光片
• 激发滤光片：紧靠光源
UV:340-380nm
有色玻璃
V:390-460nm
种类：
B:460-500nm
干涉滤色片
G:500-570nm
• 截止滤光片：物镜与目镜间
阻断(或压制)滤光片： • 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧
光和损伤眼睛。
• 选择并让特异的荧光透过，表现出专一的 荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
荧光显微镜就其光路来分有两种：
• 1． 透射式荧光显微镜
•
激发光源是通过聚光镜穿过标本材料
来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可
用普通集光器，调节反光镜使激发光转射
和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显
微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点
是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观
察较大的标本材料较好。
透射荧光显微镜
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
透射荧光显微镜原理
目镜
物镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
激发滤色镜
汞灯
透射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
优点：
• 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物 镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的 反差。
• 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于 观察。
• 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更源自文库。
缺点：
• 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不 能获得明亮的荧光像。
• 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚 的载玻片。
• 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标 本荧光色衰褪。
• 厚的或不透明的标本不适用。
• 2．落射式荧光显微镜：
•
这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上
• 荧光发出时不像普通光那样会产生热效应， 它是冷光。
30----180nm
荧光的吸收及发射光谱
• 荧光发光方向与激发光的方向无关, 它呈球 体辐射 。
• 荧光具有偏振性。
一、荧光显微镜原理
• 原理：
• 荧光显微镜是利用一个高发光效率的
点光源，经过滤色系统发出一定波长的光 作为激发光、激发标本内的荧光物质发射 出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和 目镜的放大进行观察。
组成
• 光源：高压汞灯或卤素灯。 • 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需
要聚光镜。 • 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外
光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没 有限制。 • 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。
• 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
荧光显微镜下的丝状细菌
反射荧光显微镜原理
• 缺点：
• 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须 用大数值孔径的物镜。
• 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧 光。
• 激发荧光的方式：
•
按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外
线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。
•
UV激发法是用短于400nm的近紫外光进
行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观
吸收滤色镜
分色镜 物镜 标本
汞灯 激发滤色镜
优点：
• 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。
• 物镜数值孔径不受限制，在高放大倍率时，也可 以获得高分辨率的像。
• 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能 使用。
• 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相 差法和透射微分干涉差法相结合。
• 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
•
在强烈的对衬背景下，即使荧光很微
弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结
构和功能以及化学成分等的研究。
• 荧光显微镜的光源所起的作用不是直接 照明，而是作为一种激发标本的内荧光物 质的能源。我们之所以能观察标本，不是 由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸 收激发的光能后所呈现的荧光现象。
• 荧光显微镜的基本构造 ：