苦丁茶冬青及其近缘种的研究与种质资源评价

苦丁茶冬青及其近缘种的研究与种质资源评价“苦丁茶”是中国民间一大类代茶饮料植物的总称。

其中,有两类”苦丁茶”在国内外比较有影响：一类是以苦丁茶冬青Ilex kudingcha为代表的冬青科苦丁茶；另一类是以粗壮女贞Ligustrum robustum为代表的木犀科苦丁茶。

本研究仅限于研究冬青科苦丁茶。

冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青I. kudingcha、大叶冬青tifolia、五棱苦丁茶I.pentagona、枸骨I. cornuta、华中枸骨I. centrochinensis、霍山冬青I. huoshanensis等136种冬青属植物。

在6种植物当中,栽培面积、产量和经济价值等方面最具影响者系苦丁茶冬青。

影响冬青属苦丁茶植物产业发展和推广的因素较多,其中植物基源和种质资源品质是两大关键因素。

由于传统上冬青属植物归属于分类较为困难的群体之一,在植物系统学上表现为分类学者对是否应将苦丁茶冬青与扣树I.kaushue,以及霍山冬青与华中枸骨给予合并存在着争议。

此外,海南大学苦丁茶研究所还发现了存在系统位置不明的冬青属苦丁茶种质材料,其形态特征介于苦丁茶冬青和五棱苦丁茶之间。

这些系统学难题给冬青科苦丁茶的可持续发展带来了严重的负面影响。

本研究从植物形态学、解剖学、微形态学、核型特征、数量分类学、化学分类学、红外光谱分析、分子生物学等角度对苦丁茶冬青及其近缘种的系统学进行比较系统的和综合研究,以期为解决冬青属苦丁茶系统学的难题提供科学依据。

此外,作者还以绿原酸和芦丁为标准,利用反相高效液相色谱和超声提取等方法对苦丁茶冬青及其近缘种的种质资源进行科学评价,为其资源开发和利用提供理论支撑。

本研究取得的主要成果如下：1.对6种冬青属苦丁茶植物形态进行
了观察和比较,结果显示,本研究的物种茎的形态有五棱形和圆形两类。

苦丁茶冬青的花被基数、子房室数目、果实分核数目和花的性别特征均存在丰富的多样性。

上述特征对于冬青属苦丁茶植物的分类鉴定和遗传多样性的研究具有一定的辅助意义。

通过实地观测,结果表明,除五棱苦丁茶的植物茎为五棱形外,其余5种植物的茎均为圆形。

苦丁茶冬青的花被数、子房室数目、果实分核数目以4为主；在性别方面,以单性花为主,但也存在杂性的现象。

2.对6种冬青属苦丁茶植物茎和叶柄的解剖结构进行了观察和比较。

结果显示,本研究的物种之间其茎的结构大体相似,其差异体现在髓部形态、髓部与次生维管束宽度比例、木射线的宽度及密度方面。

该6种冬青属植物叶柄解剖结构也大体相似,其主要差异体现在维管束的形态方面,可分为两大类。

利用荧光显微镜观察了茎和叶柄的解剖结构。

结果表明,霍山冬青茎中髓部宽度所占比例最大；枸骨和华中枸骨茎的髓部形态呈四方形,其他四种茎的髓部形态呈圆形或近圆形；木射线最宽的是苦丁茶冬青,大叶冬青和五棱苦丁茶的木射线宽度次之；叶柄木质部束呈较规则半月形者为枸骨、华中枸骨、霍山冬青和大叶冬青,典型不规则半月形者为苦丁茶冬青和五棱苦丁茶。

3.6种冬青属苦丁茶植物的茎叶形态数量分类学研究结果与叶柄解剖分类结果相似,均可分为同样的两大类。

基于26个茎叶形态变量的数量聚类分析结果,可将6种冬青属苦丁茶植物分为两大类,第一类为苦丁茶冬青和五棱苦丁茶；第二类为大叶冬青、霍山冬青、枸骨和华中枸骨4种植物。

主成分分析结果表明第一主成分主要反映的是叶片对称性、叶柄长度、叶基到最宽处的距离与叶长的比值。

4.叶表皮微形态特征研究结果表明,冬青属苦丁茶叶片微形态特征具有种级水平上的分类学意义,可以为苦丁茶冬青及其近缘种的划分提供可靠的依据。

根据叶表皮微形态特征的研究结果,不支持霍山冬青与华中枸骨的合并。

结合分子生物学证据与叶表皮特征微形态特征的研究结果,形态居间种质材料的冬青属苦丁茶类型应为五棱苦丁茶(Lpentagona)的变种。

光学显微镜和扫描电镜研究结果表明,7种冬青属苦丁茶植物的叶表皮微形态特征具有一定的相似性,如气孔器均位于下表皮,每种植物均有正常气孔器和大气孔器,气孔器类型以环列型为主,其次为双环列型；其差异性体现在叶表皮细胞的垂周壁形态和气孔外缘角质层纹饰等方面。

霍山冬青叶表皮微形态与华中枸骨存在着较大区别。

5.观察了不同地域的枸骨和四种性别特征材料的苦丁茶冬青的正常与异常花药与花粉的微形态学特征,同时还研究了大叶冬青、贡山冬青和猫儿刺的花粉特征。

研究结果表明,花药纹饰大体相似,但花粉外壁纹饰和萌发沟、花粉体积在种间和种内具有较大差异。

不育或败育花粉则在萌发沟深度和长度方面与正常花粉具有较大差异。

根据花药与花粉微形态学研究结果,说明花药特征对冬青属系统分类意义不大,但花粉的特征对于冬青属植物的分类具有一定的价值。

扫描电镜研究结果表明,所研究的五类材料其花药纹饰大体相似,都具有不规则脊纹并间有条纹,种间区别不显著；花粉均为三沟型,外壁纹饰均具疣状或钉状颗粒。

不同物种间、不同地域的枸骨与不同性别特征的苦丁茶冬青其花粉体积大小指数、纹饰颗粒密度、萌发沟长度和宽度及其比值等特征都具有多样性。

此外不育或败育花粉微形态体现在萌发沟深浅和长度不一,具有一定的生态学意义。

6.染色体核型分析结果表明,4种冬青属苦丁茶的核型可分为两类,核型分
析的研究结果有助于研究冬青属植物的亲缘关系。

通过酶解离染色后显微镜观察,发现苦丁茶冬青、大叶冬青和形态居间类型种质材料其核型属于2B类型,五棱苦丁茶属于3B类型。

就核型分析结果而言,形态居间类型种质材料的核型更接近于苦丁茶冬青。

7.冬青属苦丁茶化学分类学聚类分析研究结果显示,五棱苦丁茶与苦丁茶冬青归为一类,这表明化学分类学与形态数量分类学研究结果基本一致；同时也显示,苦丁茶冬青在化学成分方面具有一定的多样性,这种多样性与其分布地域有关。

根据RP-HPLC数据和NTsys软件进行了化学分类学研究。

六种冬青属植物中色谱峰共有峰数目有6个,另外在各个物种色谱图中,作者还发现了一些特殊峰。

根据聚类分析的结果,五棱苦丁茶(S12,S13)与苦丁茶冬青(S2)种质材料聚类在一起,其亲缘关系最近,但起源于广西马山石灰岩地区的苦丁茶冬青(S1)种质材料单独聚为1类,其所含有的化学成分种类及含量与其他地域苦丁茶冬青的差异很大。

8.六种冬青属苦丁茶的叶片因种质材料的起源地域,野生来源与栽培条件以及叶片储藏措施的不同,其绿原酸含量存在明显差异。

基于超声提取和RP-HPLC基础上的绿原酸含量研究结果表明,新采集的成熟功能叶经过低温干燥后,其所含绿原酸含量由大到小依次为丁茶冬青>霍山冬青>大叶冬青>五棱苦丁茶>华中枸骨>枸骨；干燥的成熟功能叶放置2月后绿原酸含量显著降低；在苦丁茶冬青野生材料不同发育阶段的叶片中,大部分材料以老叶绿原酸含量最高；一般来说,苦丁茶冬青野生材料叶片中绿原酸含量要高于栽培材料,种间或种内绿原酸含量存在较大的差异,这可能与种质材料的起源地域有关。

9.根据叶总黄酮含量测定结果,并结合绿原酸含量的分析结
果,可以认为霍山冬青是一种良好的苦丁茶种质资源；利用幼嫩叶加工成苦丁茶具有其科学性。

在超声提取、络合反应及紫外分光光度法,以芦丁为标准的含量测定结果表明,就5批次栽培材料的功能叶总黄酮的平均值而言,苦丁茶冬青(3.96%)>五棱苦丁茶(3.67%)>霍山冬青(3.63%)>枸骨(3.04%)>大叶冬青(2.64%)；低温干燥(50℃)放置2月后的叶片总黄酮含量明显降低；栽培条件下的苦丁茶冬青,其成熟叶片中的总黄酮含量平均值要高于野生植株成熟功能叶所含量；就所有个体总黄酮含量而言,霍山冬青最高(7.39%)；幼嫩叶的总黄酮含量具有较高的水平。

10.基于红外光谱分析的研究表明,利用红外二阶导数谱图可以将不同物种的冬青属苦丁茶植物和不同来源的苦丁茶冬青种质材料快速和有效地加以区分。

一维傅里叶中红外光谱分析表明,不同物种的冬青属苦丁茶植物和不同来源的苦丁茶冬青种质材料不易区分,有大量的共同的吸收峰,特征峰相对较少。

通过对指纹区二阶导数图谱变换,将重叠的光谱分开后,除共同的吸收峰外,不同物种的冬青属苦丁茶植物和不同来源的苦丁茶冬青种质材料叶片红外光谱图吸收峰
位置、数目和吸光度显示出了明显差异,利用此差异可以对上述物种或不同来源的种质材料进行鉴别。

利用红外光谱聚类分析表明,形态居间类型种质材料与五棱苦丁茶亲缘关系较近,霍山冬青与华中枸骨亲缘关系相对较远。

11.基于SRAP-PCR分子标记的聚类分析结果表明,供试的6种冬青属苦丁茶可分为两大类,与其他分子标记的实
验结果基本一致。

同时SRAP分子标记实验结果还显示供试的苦丁茶冬青不同的种质材料可分为两大类,这己研究结果为探讨苦丁茶冬青的基因型分类提供了可靠的科学证据。

在本研究中,苦丁茶冬青、五棱苦丁茶和大叶冬青聚为一大类,枸骨、华中枸骨和霍山冬青聚为一大类,这与传统的根据其叶形的分类结果完全一致。

也与其他分子标记实验的结果相吻合。

因此,SRAP分子标记用于冬青属苦丁茶植物分子系统学研究以及种级水平和种下水平分类鉴定是完全可行的。

另一方面,根据聚类分析结果,不同来源的供试苦丁茶冬青种质材料还可分为2个类群,每个类群又可分为若干小类。

这说明苦丁茶冬青存在比较丰富的遗传多样性。

本论文在综合分析各种研究手段的实验结果基础上,对冬青属苦丁茶植物的系统亲缘关系及优良种质资源选择进行了探讨。