微生物限度方法学验证

微生物限度检查

方法学验证

一、检验方法

依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液

表1菌种

表2培养基

表3对照用培养基

表4试剂

稀释液：

（1）pH6.8缓冲液

取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）0.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液

取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液

取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备

1细菌、霉菌、酵母菌

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌

接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～

100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

四、验证内容

1、计数方法验证

将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu 的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。

经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。

2、适用性检查

2.1细菌、霉菌、酵母菌

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～

100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。

细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查

培养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长情况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。

2.2控制菌

2.2.1促生长能力

取大肠埃希菌菌悬液0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别置于胆盐乳糖培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基中；取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别接种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu）涂布于胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基中；于35℃培养18小时，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照，每个培养基平行制备2个平皿。胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基与对照管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

2.2.2抑制能力

取金黄色葡萄球菌100 cfu左右，注入无菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置35℃培养18小时，应不得有菌生长。

2.2.3指示能力

取乙型副伤寒沙门菌10～100cfu，接种于三糖铁琼脂培养基中，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养18小时；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基指示能力见2.2.1中乙型副伤寒沙门菌测试结果，MUG培养基指

示能力见2.2.1中大肠埃希菌测试结果。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。

控制菌培养基适用性检查

培养基的促生长性及指示性菌落生长状态一致，抑制性均无菌落生长，说明培养基适用性良好。

3、抑菌性：取连续生产的三批样品进行测定

3.1细菌、霉菌、酵母菌

3.1.1供试液的制备：称取本品10g，加pH6.8缓冲液100ml，混匀，制成1：10的供试液。

3.1.2试验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中，立即倾注15～20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

31.3菌液组：取上述各试验菌液1ml，加入相应的培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入15～20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2个平皿。

3.1.5回收率标准

以供试品对照组为样品空白(C

)、以菌液组为对照(T)、以试验组为测试品(C)计：

)/T≥70%

(C-C

细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测结果统计