无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XIIA
2010版无菌检查法
4、将原排列第 6. 的 0.5%葡萄糖肉汤培 养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌 检查） 修订排列为第 4. ——按顺序归类培养基1.～4. 均为直接用 于无菌检查的液体培养基。
（三）培养基灵敏度检查部分
1、在菌液制备中，修订黑曲霉的孢子悬液 制备方法：规定应使用含0.05％（v/v） 聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，洗 脱孢子及稀释孢子液，制成每1ml中含孢 子数小于100 cfu的孢子悬液。 删除了：（用管口带有薄的无菌棉花或纱 布能过滤菌丝的无菌毛细吸管） 吸出孢子 悬液的操作方法
检视我国历版药典无菌检查法发展历史
1953版 实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法； 用一种培养基检查
1963版
1977版
仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌
开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培养基分别培 养细菌和霉菌
1985版
收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及 霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。
2、“ 日常检验还需要对环境进行监控。” 3、“ 无菌检查人员必须具备微生物专业 知识，并经过无菌技术的培训。
（二）培养基部分
1、删除： 硫乙醇酸盐流体培养基 后括 号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明 2、删除： 改良马丁培养基 后括号（用 于培养真菌）的说明
3、删除： 选择性培养基 项下加入适量中 和剂或表面活性剂 “ 如对氨基苯甲酸 （用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80 （用于非水溶性供试品）或β -内酰胺酶 （用于β -内酰胺类供试品）”等说明。 修订为： 在培养基灭菌或使用前加入适宜的中 和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验 证试验。 增订：表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法 (见微生物限度检查法中）
2010版无菌检查法
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
增、修订涉及范围
前言部分 培养基部分 灵敏度检查 稀释液、冲洗液 方法验证 薄膜过滤法 培养及观察 结果判断 表1、表2和表3
前言部分
1、新增规定：“ 防止污染的措施不得 影响供试品中微生物的检出。” 2、新增规定：“ 日常检验还需要对环 境进行监控。” 3、新增规定：“ 无菌检查人员必须具 备微生物专业知识，并经过无菌技术的 培训。
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
·5、增、修订：装有药物的注射器供试
品的检验方法 删除 “装上无菌针头（非包装中所配带 的）” 修订为 “取规定量，排出注射器中的内 容物，若需要可吸入稀释液或标签所示的 溶剂溶解，直接过滤”
供试品的无菌检查部分
直接接种法
·原直接接种法中删除ß-内酰胺类或
磺胺类供试品
增加 表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物
戊二醛 酚类、乙醇、吸附物 醛类 季铵类化合物（QACs）、 对羟基苯甲酸酯 汞类制剂 双胍类化合物 碘酒、洗必泰类 卤化物 乙二胺四乙酸（EDTA） 磺胺类 ß-内酰胺类抗生素
可选用的中和剂或灭活方法
亚硫酸氢纳 稀释法 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、聚山梨酯
培养基部分
1、删除：1. 硫乙醇酸盐流体培养基 后 括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说 明 2、删除：2. 改良马丁培养基 后括号 （用于培养真菌）的说明
3、删除：3. 选择性培养基 项下 “ 如对氨基 苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80 （用于非水溶性供试品）或β -内酰胺酶（用 于β -内酰胺类供试品）”等说明。 修订为： 在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、 灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。
2010版药典微生物与无菌_
三：微生物限度检查增修定内容 四：新增微生物限度检查法指导原则
⒑结果的判断
由于微生物试验的特殊性，在实验 由于微生物试验的特殊性， 结果分析时， 结果分析时，应从各个可能的方面去 考虑，不但要假设被污染，而且要考 考虑，不但要假设被污染， 虑微生物在原料、 虑微生物在原料、辅料或试验环境中 存活的可能性。此外， 存活的可能性。此外，还应考虑微生 物生长特性。 物生长特性。
甘油冷冻管保存法
甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般 可保存2 可保存2年。 ①将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经 37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮 37℃24～48h培养后，用无菌接种环轻轻刮 取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调 整菌液浓度，使其等同于1 整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。 ②向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为 20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 ③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装 ③轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装 于无菌小试管中，在-30℃ 于无菌小试管中，在-30℃条件下贮存。
一、进一步确定了无菌检查法的定义： 进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医 疗器具、原料、辅料、 疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌 一种方法。 的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止 检验全过程必须严格遵守无菌操作， 再污染 ，但采用的措施不得影响微生物的生 长。 2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验 无菌检查要进行环境检测增加了日常检验 要进行环境检测增加了 还需进行环境检测。 还需进行环境检测。 2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 无菌检查人员必须具备微生物专业知识， 并经过无菌技术的培训。 并经过无菌技术的培训。
(完整版)中国药典2010版附录XII E 细菌内毒素检查法
中国药典2010版附录XII E 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验.当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准.本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU )表示，1EU 与1 个内毒素国际单位（IU ）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的赏试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0。
O15EU／ml（用于凝胶法）或0。
005EU / ml （用于光度侧定法)且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素.耐热器皿常用干热灭菌法（250℃ 、30 分钟以上 ) 去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械,如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH 值在6。
0～8。
0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液)的pH 值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子.内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L）一般按以下公式确定：L=K / M式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU /ml、EU / mg 或EU / U （活性单位）表示；K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU / （kg · h ）表示，注射剂K = 5EU/（kg•h ），放射性药品注射剂K=2.5EU / （kg· h ） ,鞘内用注射剂K = 0。
中国药典2010无菌检查法
装管每基养培丁马良改� lm51于少不量装管每基养培体流盐酸醇乙硫�时同�%01的积体基 养培于大得不�积体品试供的种接合符应量用的基养培中器容个每�外定规有另除。 ) 1:2为 比之数瓶或数支种接的基养培种 2�中基养培丁马良改和基养培体流盐酸醇乙硫至种接别分 量等 �品试供量定规取。品试供的查检菌无行进法滤过膜薄用法无于用适法种接接直 法种接接直�2 。查检菌无的头针菌无的带配所中装包行进法种接接直用采应时同 。作操法方下项品试供性溶水按后然 �滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至合混或�滤过接直�解溶剂溶的示所签标 或液释稀人吸可要需若�物容内的中器射注将�量定规取 品试供器射注的物药有装 。作操法方的下项品试供剂制性溶水非或液溶水照后然�中器容菌无至 移转液溶品试供将并�器容启开菌无再后剂射抛放释�孔小一钻端上器容在速迅作操菌无以 。时小 1约冻冷室冰的 ℃ 02-少至置器容各将�量定规取 品试供剂雾�喷�气菌无 。作操法方的下项品试供性溶水非照基养培入加及洗冲膜滤后滤过 。滤过液溶品试供为作相水层下取�置静�取萃摇振分充�液释稀的 lm001于少不入加中液溶 品试供的中酯丙异酸烷四十菌无的量适有含于�品试供的滤过法无然仍对。滤过速迅热趁并 � ℃ 44过超得不度温但 �热加当适可要需果如 。解溶分充品试供使 �摇振烈剧 �中酯丙异酸烷 四十菌无的量适至合混 �量定规取 品试供剂油性黏和剂膏的酯丙异酸烷四十于溶可 。作操法 方的下项品试供液溶水照他其。基养培的 08酯梨山聚含不或含入加。次 3于少不般一数次洗 冲�膜滤洗冲液洗冲的 08酯梨山聚� 1� % 1.0含用。滤过即立�合混分充�内器容菌无的 lm003液释稀的剂化乳宜适他其或 08酯梨山聚含于溶合混 �量定规取 品试供性溶水非 。作操法方的下项品试供液 溶水照后然 �溶复明说签标按或解溶液释稀的宜适加 �量定规取 品试供体固性溶水 。 lm001基养培丁马良改 入加中器滤一另� lm001各基养培体流盐酸醇乙硫入加中器滤个 2�后洗冲。验试证验法方 同法方洗冲、量洗冲的用所�次 3于少不般一数次洗冲�膜滤洗冲液洗冲用须�剂腐防含或 用作菌抑有具品试供如。滤过即立�匀混�内器容菌无的液释稀量适含至移转部全或�滤过 接直者上以 lm5为量装品试供�瓶�支每�滤过即立�匀混�内器容菌无的 lm001液释稀宜 适含至移转部全�者下以及 lm5为量装品试供�瓶�支每�量定规取 品试供液溶水 。伤损受物生微的上膜滤免避以� lm000l 过超得不量洗冲总� lm001为般一量洗冲 次每膜滤张每�膜滤洗冲液洗冲用要需若�后滤过膜薄经液溶品试供。面表膜滤个整盖粗液 洗冲及液溶品试供持保意注应�率效滤过大最的膜滤挥发为。燥干分充应前用使在器滤过和 膜滤其�品试供类油。膜滤湿润以�滤过液洗冲的量少将先前滤过液溶品试供性溶水 。性整完的后前滤过在膜滤证保应�时用使。质材膜滤择选性特的剂溶 其及品试供据根。 mm05为约径直 mμ54.0于大不应径孔膜滤�器滤过膜薄式闭封用采 法滤过膜薄�1 。行进法方列下按�外定规有另除 基养培种接及理处品试供 。物容内出取�器容开启作操菌无 按再�气空菌无入导内器容向�头针的器滤过菌除有带如�材器菌无的宜适用可�度空真的 定一有内器容品试供果如。毒梢底彻行进面表器容品试供对液毒消的宜适用�时作操 。同相法方的证验与应件条验检和法方查检的用采所查检菌无 的品试供 。法滤过膜薄用采应�许允状性品试供要只。法种接接直和法滤过膜薄括包法查检菌无
2010版无菌、微生物限度检查法课件
检视我国历版药典无菌检查法发展历史
1953版 实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法； 用一种培养基检查
1963版
1977版
仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌
开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培基分别培 养细菌和霉菌
1985版
收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及 霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。
（八） 表1、表2和表3部分
表1
将表1第3列的表题原
“每种培养基最少检验 数量” 修订为：“接种每种培养基所需的 最少检验数量” ——更明确指出接种到培养基中去的检验量。
修订了表1下的
注: 对供试品容器装量不够 接种两种培养基的情况，明确规定最少检验 数量应加倍。
表2
将表2原名称：“上市抽验样品（液体制剂）
⑶新增贴剂供试液制备
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层， 放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。 用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆 盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如 聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力 振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供 试液。
⑷具抑菌活性的供试品增修订内容
的最少检验数量” 修订为：“ 液体制剂最少 检验量及上市抽验样品的最少检验数量” ——明确液体制剂最少检验量见表2的第2列， 供试品最少检验数量见表2的第3列。
· 修订了表2下的 注: ——对供试品容器装量 不够接种两种培养基的情况，明确规定最少 检验数量应加倍。
表3
·将表3原名称：“上市抽验样品（固体制剂） 的最少检验量” 修订为：“ 固体制剂最少检 验量及上市抽验样品的最少检验数量” ——明确固体制剂最少检验量见表3第2列；供 试品最少检验数量见表3的第3列。
无菌检查法2010
无菌检查的定义
中国药典2010年版对无菌检查的定义是：无菌 检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种 方法。 由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检 查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过 无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品 未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都 是无菌的。 反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认 为批产品的微生物污染风险相当高。
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物品表面微生物样本的采集：
采用拭子涂抹取样的方式采样。当人体表面微生物 样本采集完毕后，取拭子，采集直接接触药品的包 装容器表面和瓶塞、瓶盖等处的微生物样本，应选 取不少于3个采样点；取拭子，对集菌过滤器、稀释 剂、冲洗剂等外表面进行微生物采样，每种不少于3 个采样点。拭子按使用说明书的要求立即释放微生 物，并尽快加入培养基。采样完毕后，应使用消毒 剂清洁被采样表面。
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人流、物流程序
物流 取塑料筐数个，内外表面均用适宜消毒剂消毒后 （普通区使用的消毒剂），备用。从样品室取规定 量的注射剂产品，用消毒剂消毒外包装后，放入塑 料筐中。将灭菌好的物品从灭菌器内取出后，放入 塑料筐中。取集菌过滤器、环境微生物采集器材、 稀释剂、冲洗剂和洁净室内用消毒剂，消毒外表面 后，放入塑料筐中。上述物品在控制区内转移入洁 净室的传递窗内，其中样品需要脱去外包装。打开 传递窗内的紫外灯，照射不少于0.5小时。
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方法验证的具体操作： 例、薄膜过滤法无菌检查方法的验证
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例1、薄膜过滤法无菌检查方法的验证 一、目的 考察薄膜过滤法无菌检查的有效性， 确定供试品的稀释浓度，冲洗剂的种类、 用量和冲洗方式以及阳性对照菌 二、供试品 薄膜过滤法检验数量为20瓶，分别接 种每种培养基。验证时的检验量应从全 量开始。
2010年版中国药典无菌检验主要增修订内容
培养基增修订内容
删除了硫乙醇酸盐流体培养基的使用范围(培 删除 养好氧菌、厌氧菌) 删除了改良马丁培养基的使用范围(用于培养 删除 真菌) 删除了选择性培养基使用的表面活性剂种类 删除了 （如对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等），2010 版只说明在培养基灭菌或使用前加入经验证、 适宜的中和剂或表面活性剂，不具体品种了， 其用量应同验证试验
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5
稀释液、冲洗液等增修订内容
除了药典规定的稀释液、冲洗液品种外，增加 增加 了可根据供试品的特性，选用其他经验证的适 宜的溶液作为稀释液、冲洗液（比2005年选择 范围更广了）。 试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂除 证明其有效性外还应证明对污染的微生物无影 响修改为 修改为无毒性。（要做验证） 修改为
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表1、表2和表3
表1 修订了注释项，对供试品每个容器装量不够 接种两种培养基的情况，明确规定最少检验 数量应加倍 表2 2 修订了表格名称，明确了该表格用于确定液 体制剂的最少检验量 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种 两种培养基的情况，明确规定最少检验数量 应加倍
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表3
修订了表格名称，明确了该表格用于确定固 体制剂的最少检验量 修订了注释项，对供试品容器装量不够接种 两种培养基的情况，明确规定最少检验数量 应加倍
8
薄膜过滤法增修订内容
增订了抗生素供试品应选择低吸附的滤器及 增订了 滤膜的规定， 若需要冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般 为100ml，规定 规定总冲洗量不得过1000ml 规定 水溶性供试品含抑菌成分需用适量的冲洗液 冲洗滤膜修改为 修改为所用的冲洗量、冲洗方法同 修改为 ห้องสมุดไป่ตู้法学验证。
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装有药物的注射器供试品的检验方法进行了详 细规定： 取规定量，删去 删去装上无菌针头。。。 删去 修改为排出注射器中的内容物至无菌容器中， 修改为 若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解， 或非水溶性溶剂制剂供试品项下方法操作。 无菌气雾剂供试液的制备：将供试品置冰室修 修 改为置至少-20 ℃冷冻室约1小时。 改为
中国药典无菌检查法
中国药典无菌检查法中国药典无菌检查法是一种无菌检查技术，它主要用于发现和检查无菌状态的药品和药剂。
该技术是在2004年由中国药典编委会发布的，是根据由世界卫生组织处方药物质量标准（WHO FPP）提出的全球标准和监管要求而制定的。
本文旨在介绍中国药典无菌检查法的基本原理及其实施步骤。
中国药典无菌检查法的基本原理是通过蒸馏水或其他试剂，将无菌状态的药品和药剂的菌落总数按照抗药性标准分类。
该法假定药品和药剂在不同抗药性水平上的菌落形成率应该相对恒定，这样可以检查出无菌的药品和药剂。
准备病原体标准株（即抗药性标准株），以确定试剂的有效性。
实施中国药典无菌检查法时，首先要准备取样，包括抗药性标准株、正确的蒸馏水和试剂等，并制备取样容器。
然后将抗药性标准株放入取样容器，加入蒸馏水或其他液体，使其成为一定量的溶液。
接下来，将药品或药剂称出一定量，放入预先准备的容器中，搅拌均匀，使其与抗药性标准株混合。
最后，将混合物均匀分散，并用一定的温度，在一定的光照条件下孵化一定的时间，将菌落总数记录下来，最后，结合抗药性标准株和药品或药剂的菌落总数进行比较，得出无菌检查结果。
由于中国药典无菌检查法有着良好的市场背景，美国食品药品监督管理局（FDA）也用它来检查原料药品和操作性药品。
它也被用来检查医疗器械中的无菌状态，以提高操作质量。
此外，中国药典无菌检查法还具有精确度高、实行简单、使用成本低等优点，使其得到广泛应用。
然而，由于其细节和耗时，在实际运用中也会出现一定的问题。
例如，取样时容器不能被污染，而蒸馏水中的少量悬浮物或颗粒也会影响最终结果。
综上所述，中国药典无菌检查法是一种发现和检查无菌状态药品和药剂的有效技术。
它有着良好的市场背景，精确度高，实行简单，使用成本低，得到了广泛的应用和认可。
但实施中仍存在一定的问题，需要持续加以完善，以保证检查的准确性和有效性。
《中国药典》2010年版附录部分内容
通用检测方法和指导原则主要增修订内容
❖ 电位滴定 1、作图法 零阶 E～V曲线突跃部的中点或拐点所 对应的滴定液体积 一阶导数 一级微商（△E/△V）的极值 所对应的滴定液体积 二阶导数 二级微商（△2E/△V2）等于 零时所对应的滴定液体积
通用检测方法和指导原则主要增修订内容
❖ 2、计算法
二阶导数法较一阶导数法更准确，故最常用
通用检测方法和指导原则主要增修订内容
❖ 酸败度检查法 羰基值的原计算公式有误 羰基值= A
V2 ×1000 854 ×W
1、854的各种V1 醛的2,4-二硝基苯腙的ε，而不是mε 2、V1 供试品稀释总体积
V2 测定用供试品稀释液体积 S 25ml
5ml 25ml
3、修改为 羰基值= 125 ×A ×1000
c、具有足够的灵敏度（0.05mg/L） （3）TOC测量的意义 控制化学污染与微生物污染
通用检测方法和指导原则主要增修订内容
❖ 紫外-可见分光光度法 1、波长校正 增加了高氯酸钬溶液的校正（以10% 高氯酸为溶剂，配制含4%氧化钬的溶液） λmax nm：241.13，278.10，287.18，333.44， 345.47，361.31，416.28，451.30， 485.29，536.64，640.52nm。 2、波长允差 紫外区 ±1nm 500nm ±2nm 700nm ±4.8nm
采用线性内插法
V0=V+
a a+ b
△V
式中 V0：终点时的滴定液体积
a：二级微商为零前的二级微商值
b：二级微商为零后的二级微商值
V：二级微商为a时的滴定液体积
通用检测方法和指导原则主要增修订内容
❖ 不溶性微粒检查法
2010版药典无菌检查法培训
5、方法验证试验----直接接种法
CP2005
CP2010
取符合直接接种法培养基用量要 求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别 接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢 梭菌各2管；取符合直接接种法培养基 用量要求的改良马丁培养基4管，分别 接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲 霉各2管。其中1管接入规定量的供试 品，另1管作为对照，按规定的温度培
无
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，
若保存在2～8℃可以在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证
过的贮存期内使用。
4、稀释液、冲洗液及其制备方法
CP2005
CP2010
如需要，可在上述稀释液或冲 洗液的灭菌前或灭菌后加入表 面活性剂或中和剂等 。
3。根据供试品的特性，可选用其他经验证过 的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或 灭菌后加入表面活性剂或中和剂等 。
大肠埃希菌（Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（staphycococcus） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) 白色念球菌（Candida albicans）] 黑曲霉（Aspergillus niger）
3、培养基的适用性检查
将规定量的供试品按薄膜过滤法 过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中 加入小于100cfu的试验菌，过滤。取 出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基 或改良马丁培养基中，或将培养基加 至滤筒内。另取一装有同体积培养基 的容器，加入等量试验菌，作为对照 。按规定温度培养3～5天。各试验菌
同法操作。
CP2010
3----2010药典
①检验人员和管理人员培训
进行岗前培训 检验人员 技能培训: 熟悉相关检测 方法、程序、检测目的和结果 评价。
管理人员
①其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符 不断接受系统的教育与职责范围相关的培训。 ②客观评估检验人员的能力，必要时对其进行再培 训并重新评估。
2010年版无菌检查法
一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、 原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 应以一次检验为准，不允许复测 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ， 但采用的措施不得影响微生物的生长。 2 、无菌检查环境检测日常检验还需进行环境检测。 3、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过 无菌技术的培训。
沙门菌
营养肉汤
促生长能力
乙型付伤寒沙门菌
四硫磺酸钠亮绿
促生长能力 乙型付伤寒沙门菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 胆盐硫乳琼脂或沙门、 志贺氏属琼脂培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 曙红亚甲蓝琼脂 或麦康凯琼脂 培养基 促生长能力+指示能力 乙型付伤寒沙门菌 三糖铁琼脂 培养基 指示能力 乙型付伤寒沙门菌 1、培养基去掉一些凝集水（可以放35～37℃培养箱内2小时 可去掉） 2、培养时间的掌握，抑制能力，加最高要求在最长时内培 养，若未生长菌就达到要求，促生长能力：加最少的菌培养最 短时间报告。
① 菌悬液的制备及保存条件。 菌悬液制备后在室温下放置应在2小时内使 用，若保存在2～8℃可以在24小时内使用。黑 曲霉孢子悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮 存期内使用，每株试验菌平行制备2个平皿，混 匀，凝固，按规定条件培养计数，同时用相应的 对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 ②对照培养。 黑曲霉孢子悬液对环境抵抗力强，可以延长时 间，但以验证为准。
无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XIIA
附录XII A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。
1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
无菌检查法
1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原 料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规 定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度 B 级背景下的局部 A 级洁净度的单向流空气区 域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染， 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面 及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试 方法》的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行 验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环 境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养， 也可用于需气菌培养； 胰 酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。
培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备， 亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养 基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在 2～25 ℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在 3 周内使用；若保存于密 闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨 (胰酶水解) 葡萄糖 L-胱氨酸 硫乙醇酸钠 (或硫乙醇酸) 15.0g 5.0g 0.5g 0.5g （ 0.3 ml) 酵母浸出粉 氯化钠 新配制的 0.1% 刃天青溶液 琼脂 纯化水 5.0g 2.5g 1.0ml 0.75g 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 pH 为弱碱 性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节 pH 值使灭菌后为 7.1 ±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培1养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的 1/2。
无菌检查法
无菌检查法附录XII A无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2 一25 ℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1 年内使用。
1．硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉5.0g葡萄糖5.0g 氯化钠2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的1 . Oml 0.1％刃天青溶液硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g（或硫乙醇酸）(0.3ml）水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH 值为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH 值使灭菌后为7.1士0.2 。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 , 灭菌．在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟）后，迅速冷却，只限加热1次，并防止被污染。
2．改良马丁培养基胨5.0g 磷酸氢二钾1.0g酵母浸出粉2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水l000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH 值约为6.8 ，煮沸；加人葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4士0.2 ，分装，灭菌。
简述《中国药典》2010年版无菌检验方法
简述《中国药典》2010年版无菌检验方法【摘要】无菌检查法系用于检查《中国药典》要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
提高药品质量可控、有效、安全的技术保障。
【关键词】《中国药典》2010年版；无菌检验方法1 无菌检查的要求无菌检查应在环境洁净度10000级下，局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。
为了保证无菌检查所用洁净区环境的稳定性，保证检验结果的可靠性，对洁净区的环境质量采用合理的控制措施和评价方法。
应定期按《医药工业洁净（室）区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
每次实验前要用适宜的消毒液清洁工作台面，地板，传递窗等，开启空气过滤器、紫外灯照射1小时。
每次实验结束后应先用湿抹布或拖布清理污迹，再用消毒液清洁台面及地面和传递窗等，清洁消毒程序是从内向外，从高洁净区到低洁净区，开启紫外灯照射30分钟。
2 菌种及菌液制备2.1 菌种名称金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代，其转种的培养物为第一代），以保证试验菌株的生物特性。
2.2 菌种及菌液制备①液体培养物直接稀释法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于9-10ml的液体培养基中，按要求的温度和时间培养后作为原液。
取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数50-100cfu（菌落形成单位）。
采用平皿计数法测定活菌数。
②细菌标准浓度比浊法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于琼脂培养基或液体培养基中，按要求的温度和时间培养后备用。
取琼脂培养基上的培养物于适宜的稀释剂中制成均匀的菌悬液；液体培养物一般要比标准比浊管的浓度稀，同时培养基的颜色也影响比浊的结果，所以可采取离心集菌，去掉上清液，底部培养物再用适宜的稀释剂制成均匀的菌悬液，将上述菌悬液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，此时的菌悬液作为原液。
2010年版药典三部附录Ⅰ简介
2010年版药典三部附录Ⅰ简介目录•1拼音•2附录Ⅰ A 注射剂•3附录Ⅰ B 栓剂•4附录Ⅰ C 眼用制剂•5附录Ⅰ D 外用制剂•6附录Ⅰ E 片剂•7附录Ⅰ F 胶囊剂•8附录Ⅰ G 软膏剂乳膏剂•9附录Ⅰ H 喷雾剂•10附录Ⅰ J 颗粒剂•11附录Ⅰ K 散剂•12附录Ⅰ L 鼻用制剂•13附录Ⅰ M 凝胶剂1拼音2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅰ《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅰ制剂通则本通则适用于治疗用生物制品，包括血液制品、免疫血清、细胞因子、单克隆抗体、免疫调节剂、微生态制剂等。
预防用生物制品，按品种项下的要求进行。
2附录Ⅰ A 注射剂注射剂系指以生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或其他辅料等制成的可供注入体内的无菌溶液、乳液、混悬液及临用前用无菌溶剂复溶为溶液、混悬液的无菌冻干制剂。
注射剂可分注射液、注射用无菌粉末。
注射液包括溶液型、乳液型或混悬型注射液。
可用于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射和静脉滴注。
其中，供静脉滴注用的大体积（除另有规定外，一般不小于50ml）注射液也称静脉输液。
注射用无菌粉末系指供临用前以适宜的无菌溶液配制成澄明溶液或均匀混悬液的无菌固体制剂。
可用适宜的注射用溶剂配制后注射，也可用静脉输液配制后静脉滴注。
以冷冻干燥法制备的无菌粉末，称为注射用冻干制剂。
注射剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。
（1）所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要求。
（2）注射剂所用的原辅料应从来源及工艺等生产环节进行严格控制，并应符合注射用的质量标准。
注射剂所用溶剂必须安全无害，并不得影响疗效和质量。
水溶性溶剂最常用的为注射用水，也可用0.9%氯化钠溶液或其他适宜的水溶液。
溶解注射用冻干制剂的无菌溶剂，通常也称注射用稀释剂，主要为灭菌注射用水、氯化钠注射液，应符合本版药典（二部）的规定。
《中国药典》无菌检查法修订
主要内容
我国药典无菌检查法的历史发展 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容 2015版《中国药典》无菌检查法 医院制剂进行微生物控制的必要性
第三页，共36页。
修订时间 1953年版 1963年版 1977年版 1985年版
无菌操作。
5、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检 验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品
的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。
第一页，共36页。
灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作 为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保 证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证 体系和严格的GMP管理。 1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性
只要供试品性状允许，应采用薄膜 过滤法
1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液
性状允许的样品采用薄膜过滤， 利于抗菌影响去除
1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml吐 温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸膏 ＋吐温80
采用薄膜过滤，利于抗菌影响 去除 1．0.1％蛋白胨水溶液
第十三页，共36页。
方法适用性试验的修订
2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。
2015版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、生孢梭菌各2管 胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉。
药典无菌检测法
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。
培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
∙1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌）酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠 2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml；L -胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5ml）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g（或硫乙醇酸0.3ml）；水1000ml；酵母浸出粉5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。
硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
∙2、改良马丁培养基（用于培养真菌）胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为 6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为 6.4±0.2，分装，灭菌。
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附录XII A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。
1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g 水1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
3、选择性培养基按上述硫乙醇盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。
4、营养肉汤培养基胨10.0g 氯化钠 5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水1000mL取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
5、营养琼脂培养基按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
6、改良马丁琼脂培养基按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。
培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
培养基的无菌性检查每批培养基随机抽取不少于10支（瓶），5支（瓶）置30~35℃、另5支（瓶）置20~25℃培养14天，均应无菌生长。
灵敏度检查菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1mL含菌数小于100CFU（菌落形成单位）的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5mL无菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100CFU的包子悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小室内使用，若保存于2~8℃可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种取每管装量为12mL的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种，作为空白对照，置30~35℃培养3天；取每管装量为9mL的改良马丁培养基5支，分别接种小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种，作为空白对照，置20~25℃培养5天。
逐日观察结果。
结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
(1)称取蛋白胨1.0g，加水1000mL，微温溶解，滤清，调pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
(2)pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，称取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000mL，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
(3)0.9%氯化钠溶液称取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000mL，过滤，分装，灭菌（仅用于上述2种溶液不适合时使用）。
根据供试品的特性可选用其它经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法验证试验当建立产品的无菌检查法时是，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。
若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。
对每一试验菌应逐一进行验证。
菌种及菌液制备同培养基灵敏度检查薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100CFU的试验菌，过滤。
将培养基加至滤筒内。
另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，细菌置30~35℃、真菌置20~25℃培养3~5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2管。
其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，另1管作为对照，细菌置30~35℃、真菌置20~25℃培养3~5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。
结果判定与对照管比较，如含供试品的各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的改检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。
验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
供试品的无菌检查抽验数量系指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶）。
成品每亚批均应进行无菌检查。
除另有规定外，原液、半成品及成品按表1规定，上市产品监督检验按表2规定。
接种量系指每个最小包装的最小取样量（mL或g）。
除另有规定外，接种供试品量按表3规定。
若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中[两种培养基的接种支（瓶）数之比为2：1]；若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联加入硫乙醇酸盐流体培养基，另一联加入改良马丁培养基。
只要供试品特性允许，应将所有容器内的内容物全部过滤。
阳性对照以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。
供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。
阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100CFU。
阳性对照液可在供试品无菌检查培养14天后，取其中1份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100CFU阳性对照菌，作为阳性对照。
阳性对照置30~35℃培养48~72小时应生长良好。
阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释液和冲洗液同法操作，作为阴性对照。
阴性对照不得有菌生长。
无菌试验过程中，若需要使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长无毒性。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。
供试品的无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。
操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒。
如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器，取出内容物。
供试品处理及接种培养基除另有规定外，按下列方法进行。
1、薄膜过滤法采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试品溶液过滤前先将少量的冲洗液过滤，以湿润滤膜。
油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
供试品溶液经滤膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100mL，总冲洗量不得超过1000mL，以避免滤膜上的微生物受损伤。
水溶液供试品取规定量，每支（瓶）供试品装量为5mL及以下者，全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。
如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。