第8章 基因工程菌的培养
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀，这可是个大话题啊！基因工程菌构建的方法和步骤，听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心，我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧，一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说，就是把一种生物体的基因提取出来，然后放到另一种生物体里，让它变得更强大、更有用。
这样一来，我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么，怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢？这可是个技术活儿，需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步：提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步：构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件，让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步：转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步：筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件，让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步：扩大培养规模。
基因工程菌发酵培养的流程
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
基因工程菌的培养
基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。
当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。
三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。
甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。
生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。
因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。
四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。
第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。
第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。
（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。
最新【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养幻灯片课件
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
发酵工程第八章基因工程菌发酵
工程菌活化、筛选和保藏方法
• 2. 含质粒大肠杆菌的活化：10ml LB培养基装50ml三角瓶中，灭菌 后接菌种，150rpm,37℃振摇1216小时；
• 3．含质粒大肠杆菌的筛选：：20ml 灭 菌LB培养基装一块平板，加卡那霉素 （1mg/ml）1ml. • 划线接种（上述活化的菌种），37℃倒 置培养12-16小时；
• 4. 含质粒大肠杆菌的增殖培养： 3ml LB液体试管中加入150µl卡那霉 素，挑选单菌落接入， 250rpm,37℃剧烈振摇12-16小时， 供质粒抽提和菌种保藏用。
• 5. 取150µl的培养物入1.5ml微量 离心管中,加850µl灭菌的甘油， 密封管口，放-20℃保藏。
☆
第二节 工程菌的发酵
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
7.0
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
4．透析培养
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产 物和培养基分离，通过去除培养液中的代 谢产物来解除其对生产菌的不利影响。传 统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等 代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生 长及外源基因的表达，而透析培养解决了 上述问题。
5．固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持 质粒的稳定性。有人将固定化技术应用 到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒稳定性大大提高，便于进行连 续培养，特别是分泌型菌更为有利。因 此基因工程菌固定化培养研究已得到迅 速开展。
简述基因工程菌的培养方式
简述基因工程菌的培养方式基因工程菌是指通过基因工程技术将目标基因导入到细菌中，使其表达目标蛋白或产生目标物质的菌株。
基因工程菌的培养是进行基因工程研究和应用的重要环节之一。
下面将从菌株的选择、培养基的配制、培养条件的控制等方面简述基因工程菌的培养方式。
一、菌株的选择菌株的选择是基因工程菌培养的第一步。
常用的基因工程菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等。
选择菌株时需要考虑其生长速度、基因导入效率、表达目标蛋白的能力等因素。
一般情况下，大肠杆菌是最常用的基因工程菌株，因为其生长速度快、易于培养和转化。
二、培养基的配制培养基是基因工程菌培养的基础，其组成要能满足菌株生长和表达目标蛋白的需要。
一般的培养基包括基础培养基和选择性培养基。
基础培养基是提供菌株生长所需的营养物质，如碳源、氮源、矿物质等。
选择性培养基则是通过添加特定的抗生素或抗性基因使得只有带有目标基因的菌株能够生长和繁殖。
培养基的配制需要根据具体实验的需要和菌株的特性进行调整。
三、培养条件的控制培养条件的控制对于基因工程菌的培养至关重要。
其中包括温度、pH值、气体环境、培养时间等因素的控制。
一般情况下，基因工程菌株的适宜生长温度为37℃，pH值为6.5-7.5。
气体环境方面，大肠杆菌一般需要在含氧的条件下培养，而酵母菌则需要在缺氧条件下培养。
此外，培养时间也需要根据菌株的生长速度和目标蛋白的表达时间进行调整。
四、培养方式的选择基因工程菌的培养方式主要包括液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养和蛋白表达，可以通过摇瓶培养或发酵罐培养进行。
固体培养适用于筛选和分离菌株，常用的固体培养基有琼脂和琼脂糖。
同时，还可以根据实验需要选择特定的培养方式，如表达载体的选择、诱导剂的添加等。
五、培养监测和收获在培养过程中，需要定期监测菌株的生长情况和目标蛋白的表达情况。
常用的监测手段包括测定菌液的光密度(OD值)、蛋白含量的测定、酶活性的检测等。
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程菌培养
（2）基因工程产品大多处于细胞内，提取 前需将细胞破碎，增添了很多困难。而且 发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加 上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力)， 故提取较困难，常需利用高分辨力的精制 方法，如色层分离等。 （3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高， 对于安全性的要求更为严格。
细胞的破碎
基因工程菌的不稳定性及对策
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组 质粒的不稳定性： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、 修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。 质粒拷贝数的影响
质粒的拷贝数的影响
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数， 在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应 成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降， 高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性 增加。
蛋白质的浓缩与分离
基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技 术生产应用的基础,其产品在化工、食品、 环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。 但能否实现高密度培养及高目标产物浓度, 是工程菌能否以较低成本实现规模生产的 决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的 各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本, 最终使目标产物生产的规模化和产业化得 以实现。
企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应 在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是： (1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态 下进行内部灭菌的培养装置； (2)培养装置的排气由除菌器排出； (3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收 集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组 菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的 侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培 养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安 全柜内进行，或是采用密闭型的设备。
基因工程菌培养
2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
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4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是元件促进重组分子的缺失重排
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
r1质粒上的parb基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂成本较高提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态避免因表达造成不稳定性问题的发生
第八章基因工程菌发酵
（五）溶解氧
一般对于需氧的基因工程菌发酵，要求培养 液中有足够高的溶解氧，特别是在进行高密 度培养时。近年来很多实验证明不同的菌株 对氧的需求是有差别的。追求高的溶氧水平， 虽然能得高的菌体密度，但在质粒稳定性和 产物的表达上未必得到好的效果，有的甚至 会对纯化提取产生不良影响。因此，溶氧的 水平应根据使用的菌株和表达产物的需要， 控制在适量水平。
（六）比生长速率
基因工程菌在培养过程中的比生长速率 与重组产物的表达效率存在一定的关系。 Riesenberg在用大肠杆菌TG1(pBB210)生产 α干扰素时，发现在较低的比生产速率 （0.15h-1）有较高的产率。因而在发酵过程 中如果能对基因工程菌的比生长速率进行控 制，能有效提高生产水平。
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
• 动物细胞培养的一般流程为： • 机体组织→切碎→酶解→离心收集 →单细胞→培养→种子→液氮冷藏 →复活培养→扩大培养→反应器大 规模培养
（二）动物细胞的培养特性
• 动物细胞一般经约50代分裂繁殖，便退化死 亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞 特性仍保持正常。这类细胞被称为初代培养 细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现 繁殖能力突然增强、几乎无限制繁殖的细胞， 其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成 等都发生了变化，完全失去原细胞的特性。 我们把这一类通常所说的癌细胞称之为确立 细胞株或株化细胞。
重组工程菌的培养
二、基因工程菌的培养工艺
5. 诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。
二、基因工程菌的培养工艺
6. 诱导表达程序的影响
二、基因工程菌的培养工艺
7. pH的影响
如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳 生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。
细胞生长期的最佳pH为6.8～7.4， 外源蛋白表达的最佳pH为6.0～6.5。
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
二、基因工程菌的培养工艺
第八节 基因工程菌的培养
本节讲解的三个重点内容 1. 基因工程菌的培养方式 2. 基因工程菌的培养工艺 3. 基因工程菌的培养设备
一、基因工程菌的培养方式
1. 分批培养
分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体 密度也有限。
一、基因工程菌的培养方式
2. 补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时 间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
二、基因工程菌的培养工艺
3. 温度的影响
温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成 水平上。
二、基因工程菌的培养工艺
4. 溶解氧的影响
溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产 物的生成影响很大。
维持较高水平的DO2 值（>40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋 白产物的形成。
基因工程菌培养的研究背景实验流程
基因工程菌培养的研究背景实验流程
基因工程菌培养的研究背景和实验流程
09生物制药房志文 A090501002
一、研究背景
基因工程菌株培养是传统发酵工艺的延伸和发展。
而微生物发酵主要是为了获得它们的初级或次级代谢产物。
随着科技的发展和生活的需要，外来物质的活性和产率就成为科学家和工程师们关注的主要内容。
一些转基因工程菌的培养获得的药物也在疾病治疗方面取得了突破。
基因工程菌的培养是为了获得大量的基因表达产物。
这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
在基因工程菌的发酵中，菌体的政治和产物的表达都是在对数期完成的，所以，发酵工艺的改进也是研究的一个重要部分。
二、实验流程
1、目的基因的获取（文库中获得、人工合成、PCR）
2、表达载体的构建（原核/真核）
3、重组工程菌的形成
4、外源基因的导入（电穿孔、氯化钙、微注射）
5、重组菌体的筛选（抗药性筛选法、限制性酶切图谱法）
6、表达产物的鉴定（蛋白质生物结构鉴定法）
确定工程菌之后便可以进行大规模的发酵生产。
工程菌工业化培养中，产物产率往往比实验室培养的产率低，所以要更加注意对发酵过程有影响的因素。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤1. 了解基因工程菌嘿，伙计们，今天我们要聊聊“基因工程菌”这个话题，别担心，我不会用什么高深的术语把你绕晕。
我们先来把概念捋一捋。
基因工程菌，简单来说，就是把外来的基因“送”进某种细菌的体内，让这些细菌变成小小的生物工厂，生产我们需要的物质。
就像你在厨房里加点调料，能把菜肴的味道改变一样。
基因工程菌的目的是通过这种“改造”，让细菌能够合成有用的蛋白质、酶或者其他的化学物质。
这样一来，它们就能帮助我们解决各种问题，比如生产药物、清理污染或者改良作物。
2. 构建基因工程菌的步骤要构建基因工程菌，我们得经过几个步骤，哎呀，这可不简单，但也不至于让人望而却步。
接下来，我就给你细细道来，千万别走神哦！2.1 选择目标基因首先，我们得决定要插入哪个基因。
这个基因可以来自其他生物，比如植物、动物，甚至是其他细菌。
想象一下，你要给你的微型生物工厂添加一项新技能，就像给它升级一个新功能。
这一步就像是挑选你最喜欢的配料，关键在于找出最适合你需求的那个基因。
2.2 构建载体接下来，我们要搞个“载体”，也就是用来运输目标基因的工具。
可以把它想象成快递公司，我们的目标基因就像包裹，载体就是快递员。
常见的载体有质粒（就是一种小小的DNA环）或病毒载体。
载体的选择，基本上是看你的目标基因是小巧玲珑还是“大块头”，当然也要看它的安全性和有效性。
2.3 转化细菌现在，咱们得把装载着目标基因的载体“送”进细菌里。
这一步就像把新员工介绍给公司的老员工，确保他们能顺利融入团队。
我们用的技术有几种，比如化学转化、热激转化和电转化。
每种方法都有自己的“拿手绝活”，这时就得看情况选择最合适的了。
2.4 筛选和鉴定好了，目标基因成功送到细菌体内后，我们得确认它是否真的“安家”了。
这个步骤就像是检查你的新配方在实际操作中是否真的有效。
我们会用一些方法来筛选出那些成功转化的细菌，比如抗生素筛选、荧光标记等。
搞定这些之后，我们还需要用一些高大上的技术，如PCR、测序，来确认基因的确切位置和表达情况。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤嗨，大家好！今天咱们要聊聊一个听起来可能有点高深的东西——基因工程菌的构建。
别担心，我会把这事儿说得简单明了，像在跟朋友闲聊一样。
如果你对基因工程一知半解，也不用急着担心，接下来的内容会把这事儿讲得像做菜一样简单易懂。
好了，咱们开始吧！1. 先来个热身：什么是基因工程菌？说白了，基因工程菌就是经过“动刀子”的细菌，咱们给它加了些新“配料”。
这就像是你喜欢的菜里突然多了点特别的调料，让它味道更好或者更特别。
这个“动刀子”其实是指把一些新的基因搞到细菌里去，这些新基因会让细菌做出一些你平时见不到的“特技”，比如说生产某种药物或者是分解污染物。
2. 基因工程菌的构建步骤好啦，进入正题。
咱们要一步步来，首先得搞明白整个过程都包括哪些步骤。
别担心，这个过程并不复杂，主要就是几个大步骤：2.1 设计基因首先，咱们得确定你想要的“特技”是什么。
比如你想让细菌制造某种药物，那么你就需要设计一个含有这个药物生产所需基因的“蓝图”。
这一步就像是做菜之前，你得先想好要做什么菜，准备好食谱。
设计的过程需要用到一些高科技的工具和软件，但大致上就是确定你要的基因序列。
2.2 制备载体有了基因的设计，接下来要做的就是把这些基因装进“载体”里。
载体就像是细菌的“旅行包”，它能帮助基因顺利进入细菌体内。
载体一般是一些小的环状DNA，这些DNA就像是装在“小盒子”里的基因，好比是给细菌送去的“外卖”。
这个载体要跟细菌的细胞膜亲密接触，才能顺利把基因送进去。
2.3 转化细菌接着，就是把装有基因的载体送到细菌里面，这个过程叫做“转化”。
把细菌和载体混在一起，再通过一些方法，比如热激、电击等，帮它们“融合”。
想象一下你在举办一场小派对，细菌就是客人，载体就是派对上的小礼物，我们要确保这两者能“相遇”。
2.4 筛选和验证好了，基因送进去了，接下来就得确认细菌是不是变得“乖乖”的了。
我们要做一些筛选工作，确保细菌里确实有咱们放进去的基因。
基因工程菌培养
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• （2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。 而且发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加上一般大分子较小分子不稳定 (如对剪切力)，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色层分离等。
• （3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高，对于安全性的要求更为严格。
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它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很 大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。
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培养温度
• 高温提高生长速度 • 低温增加重组菌稳定性 • 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的
培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。
件较用合成培养基为高
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的 稳定
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• 选择合适拷贝数的菌株
在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作 的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前 培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高， 在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。
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• 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。 实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组
成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。
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• 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移 至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外 扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。
第8章 基因工程菌的培养
8.5 基因工程菌生长与表达的影响因素
8.5.1 溶氧浓度对工程菌发酵的影响
DO 1.8~2.6mg/L时，菌体湿重 1.9~2.08g/L，外源基因 表达量为13.8~16.7%； DO 4.0mg/L时，菌体湿重 2.27g/L，外源基因表达量 为26.4%； 诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译， 细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通 过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值， 不仅能提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物 的形成。
发酵染菌及其防治知识点回顾
• 染菌对发酵生产的影响
染菌对不同产品发酵过程的影响
不同时期发生染菌对发酵的影响
染菌程度对发酵的影响
发酵染菌及其防治知识点回顾 • 发酵染菌的途径分析
发酵染菌后的异常表现
染菌的检查判断
染菌原因分析
发酵染菌及其防治知识点回顾
• 发酵染菌的常见种类及防治对策
种子带菌及防治
空气带菌及防治
重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内 合成后就会造成伤害。高表达的外源蛋白尤 其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生 长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡。 重组大肠杆菌高表达的障碍主要有：
外源基因的不稳定性；高生长速率与高表达之间的矛 盾；乙酸的产生、蛋白的降解。
8.4 重组大肠杆菌的高密度培养策略
8.5.5 乙酸对生长和表达的影响
1、乙酸的产生及抑制作用机制
细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产
生的能量足以满足合成和异化的需求，不会
产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌
仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通
过乙酸生成途径储备ATP和NADH。
8.5.5 乙酸对生长和表达的影响
药品生产技术《基因工程菌的培养方式》
教师：
授课专业
生物技术及应用、生物制药技术
上课地点
多媒体教室
授课时间
学习内容
学习情境4微生物工程菌发酵制药技术
基因工程菌的培养方式
课时
8
教学目标
知识目标
掌握基因工程菌的培养方式。
技能目标
能从事基因工程菌的培养。
素质目标
精细标准操作、有平安意识、环保意识。
教学重点难点
重点：基因工程的一般过程和主要步骤。
基因工程菌的培养方式
培养、
固定化培养。
请同学们自己查找详细相关学习信息
作业
有哪些方式可用于基因工程菌培养？
教学反应
工程菌发酵的过程控制根本理论。
难点：基因工程菌的构建。
工程菌发酵的控制。
目标群体
学生在前面学习了?应用微生物根底?，?生物化学?的具备了微生物生理特点及代谢的根底知识。
教学环境
教室、实训室
教学方法
1、理论讲授2、实训课：讲授、演示与学生操作，教学做一体化
时间安排
教学过程设计
课前5分钟演讲或平安教育
学习情境4微生物工程菌发酵制药技术
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