第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
双向凝胶电泳技术.
制备原则：
由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循
（1）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在
（2）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （3）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （4）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：
(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。
(2)极酸或极碱蛋白的分离。 (3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。 (4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切
双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其
分辨率已从15个蛋白质点发展到10000多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨1000-3000个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。
由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此2DE的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中5000种蛋白分离开，2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。
聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
凝胶电泳分离技术
之蔡仲巾千创作复杂体系的分离技术凝胶电泳分离技术凝胶电泳分离技术摘要：凝胶电泳（Gel electrophoresis）, 也可称为胶体电泳或扁平式电泳法.凝胶电泳分离技术用途非常广泛, 尤其是在生物学和化学的领域, 是用于分离分歧物理性质（如年夜小、形状、等电点等）的分子的技术, 一般可用于质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者免疫印迹检测之前来进行部份提纯分子.本文将通过对凝胶电泳分离技术的概念, 原理, 特点和应用四部份的简要介绍, 使读者对该技术有一定初步的了解.第一部份基本概念一、凝胶凝胶（gelatum）又称冻胶,是指溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接, 形成空间网状结构, 结构空隙中布满了作为分散介质的液体或气体, 这样一种特殊的分散体系称作凝胶.IUPAC给出的凝胶界说是非流动性的胶态网络或者是贯穿其整个体积由流体膨胀聚合物网络.（凝胶）凝胶是一种充沛稀释的交联系统, 在稳定状态下没有流动性.凝胶的主要成份是液体, 但由于液体中的三维交联网络, 凝胶在很多方面有着与固体相近的特性.凝胶可以包括共价聚合物网络结构, 氢键、结晶、螺旋结构, 玻璃状结构, 层状结构和微粒无序结构.凝胶可分为弹性凝胶和脆性凝胶, 弹性凝胶失去分散介质后, 体积显著缩小, 而当重新吸收分散介质时, 体积又重新膨胀, 例如明胶等；脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时, 形状和体积都不改变, 例如硅胶等.由溶液或溶胶形成凝胶的过程称为胶凝作用.在凝胶电泳分离技术中, 凝胶作为分离分子的基质, 在分离卵白质或小的核酸（DNA、RNA、或寡核苷酸）的时候, 通常是用分歧浓度的丙烯酰胺和一个交联剂聚合而成, 形成份歧年夜小网眼的聚丙烯酰胺网状系统, 最初使用的凝胶是淀粉凝胶, 但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶.二、电泳电泳（electrophoresis）是在电场的作用下而发生的物质运动, 分歧的物质在一定的电场强度下, 由于所带电荷分歧, 因此受到的引力分歧, 向相反电极泳动速度分歧进而达到分离目的.原则上按电泳的原理来分, 可分为二类：（1）自由界面电泳, 又称移动界面电泳, （电泳原理示意图）是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳.其装置复杂, 价格昂贵, 费时费力, 方便于推广应用.（2）区带电泳：是指有支持介质的电泳, 待分离物质在支持介质上分离成若干区带.支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散, 以使被分离的成份获得最年夜分辨率的分离.按支持介质种类的分歧, 区带电泳可分为纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳.聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最经常使用的支持介质.在凝胶电泳分离技术中, 电泳是指在凝胶上用来推动或拉住分子的电动势.三、凝胶电泳凝胶电泳分离技术（Gel electrophoresis separation technique）是一种以具有网状多孔结构的凝胶为支持物的电泳技术.同时由于凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用, 因此有很高的分离能力.从凝胶层面上来看, 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳, 从电场层面上来看, 有普通电场凝胶电泳和脉冲电场凝胶电泳.凝胶作为支持介质的引入年夜年夜增进了电泳技术的发展, 是我们人类对技术的综合利用, 自然成为分析卵白质、核酸等生物年夜分子的重要手段.第二部份基来源根基理将一种分子放置在电场傍边时, 它会以一定的速度移向适当的电极, 如果分子带负电多就会往氧化极移动, 带正电多就往还原极移动.电泳分子在电场作用下的迁移速度, 叫做电泳的迁移率, 它同电场的强度和电泳分子自己所携带的净电荷数成正比. 由于在凝胶电泳分离技术中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质, 如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等, 从而降低了扩散和对流运动, 因此电泳的迁移率与分子的年夜小和缓冲液 的粘度成反比.根据以上因素我们可以通过电泳将卵白质或核酸分子混合物中的各种成份彼此分离开来.核酸分子的糖—磷酸骨架中的磷酸基团带负电荷, 当核酸分子被放置电场中时, 它们就会向正电极的方向迁移, 由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质, 相同数量的双链DNA 几乎具有等量的V ：泳动速度cm/秒或分 u ：泳动率或泳动度（cm/伏.秒或分）U ：电压 常压（100-500v ）高压（500-1000v ）仅需几分钟】t:电泳时间（秒或分） d:泳动距离cm E:电场强度 v/cm l:支持场的有效长度cm净电荷, 因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移, 分子量较小的DNA分子比分子量较年夜的DNA分子迁移要快些.卵白质有分歧的电荷和复杂的形状, 当放电动势在样品上, 卵白质可能会以分歧的速度进入凝胶或完全不移动, 而卵白质在有洗涤剂如十二烷基硫酸钠或十二烷基磷酸钠呈现时会变性, 洗涤剂会以负电荷覆盖卵白质, 所以键结后蜕变的卵白质带有负电荷, 而且所有卵白质有相似的“荷质比”（电荷和质量的比值）.在跑完电泳, 最小的分子几乎都达到氧化极之后, 可以对凝胶里的分子染色, 这样才华看到分子.可以用溴化乙锭, 银或考马斯亮蓝染色, 也可以用其他方法看到凝胶里分离后的混合物组成, 如果分析物的分子在紫外线下会发光, 就可以在紫外线下拍出凝胶的照片, 如果要分离的分子有放射性原子, 就可以用同位素示踪剂记录.如果一开始有很多个混合物一个接一个注入相邻的“井”, 跑出来的结果会是一条一条平行的轨迹.根据分歧分子的数量, 每一条轨迹都有一条或以上, 明显的亮带, 暗示原本混合物分离出来的组成, 每个亮带代表一个组成, 组成物分离不完全就会跑出重叠的亮带, 或者难以分辨的污点就暗示许多组成物没有分解.第三部份特点凝胶电泳的电泳迁移率是指在单元电场强度时带电分子的迁移速度, 而迁移率与带电分子所带静电荷和所处电场电场强度成正比, 与分子的年夜小和缓冲液的摩擦系数成反比.（一）电场强度电场强度是指单元长度的电位降, 也称电势梯度.电场强度愈年夜, 带电颗粒的泳动越快.但凝胶的有效分离范围随着电压增年夜而减小.（二）样品的物理性质（1）分子年夜小当核酸分子年夜小超越20kb时, 普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开, 此时电泳的迁移率与分子年夜小无关.（2）分子空间构型当分子空间构型分歧, 其迁移率也分歧.（3）分子带电量分歧核酸分子的电荷密度年夜致相同对迁移率影响不年夜.（4）分子碱基组成分歧核酸分子碱基组成对迁移率影响不年夜.（三）支持物的物理性质凝胶浓度越小, 孔径越年夜；浓度越年夜, 孔径越小.琼脂糖是线性多聚体年夜分子, 含有分歧浓度琼脂糖的凝胶构成份子筛的网孔年夜小分歧, 适于分离分歧浓度范围的核酸分子.聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺在交联剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶, 其网孔的年夜小由两物质的相比较例决定.第四部份应用一、琼脂糖凝胶电泳（一）简介琼脂糖主要从琼脂中提取而来并经糖基化修饰, 是一种聚合链线性分子, 琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布, 当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接, 形成孔径结构, 并随着琼脂糖浓度分歧形成份歧年夜小的孔径.（琼脂糖结构式）使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质, 发挥分子筛功能, 物质分子通过会受到阻力, 年夜分子物质在泳动时受到的阻力年夜, 因此在凝胶电泳中, 带点颗粒的分离不单取决于净电荷的性质和数量, 而且还取决于分子的年夜小, 这就年夜年夜提高了分辨能力.根据相关性质, 可以分为：（1）低熔点凝胶, 用于DNA片段的回收、酶切、连接等.（2）高熔点凝胶, 用于分离小于1kb的DNA片段, PCR产物的分析.（3）快速凝胶, 电泳速度较快, 节省实验时间.（4）其他类型, 依据机械强度和熔点选择.（二）特点（1）凝胶结构均匀, 孔径较年夜, 可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等年夜分子物质.（2）把持简单、快速, 通过调整其使用浓度, 使得分辨率可以达到年夜大都实验的要求, 成为分离、鉴定、纯化核酸分子的经常使用方法.（3）琼脂糖凝胶因不含硫酸根和羧基, 几乎消除琼脂的电渗.（4）对卵白质吸附极微, 故无拖尾现象.（5）透明度较好, 可直接或干燥成薄膜后进行染色.（6）不吸收紫外光, 可直接利用紫外光吸收法作定量测定.（7）机械强度差, 易破碎, 浓度不能太低, 易被细菌污染, 不容易保管.二、聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）简介聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成的年夜分子.带有酰胺侧链,没有或很少有带离子的侧基,因而电渗作用比力小, 不容易和样品相互作用.根据凝胶溶液和电泳缓冲液对卵白质构象的影响, 可分为两种方式:一是非变性聚丙烯酰胺凝胶, 在电泳的过程中, 卵白质能够坚持完整状态, 并依据卵白质的分子量年夜小、卵白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开, 在未变凝胶中分离DNA的缺点是DNA 的迁移率受碱基组成和序列的影响.由于无法得知未知 DNA的迁移是否反常, 故不能用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定分子的年夜小.二是用于分离及纯化单链DNA 片段的变性聚丙烯酰胺凝胶.这类凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）的存在下聚合而成的.变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关, 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等.（二）特点（1）具有分子筛效应, 分辨率高（2）样品不容易扩散, 用量少, 灵敏度可达10（3）化学性质稳定, 分子结构中富含酰胺基, 具有稳定的亲水基团（4）凝胶不带电荷, 消除电渗现象（5）机械强度好, 有弹性, 在一定浓度范围内无色透明（6）网孔可调节（三）十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）仅根据卵白质亚基分子量的分歧就可以分开卵白质.该技术最初由Shapiro 于1967年建立, 他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后, 卵白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的年夜小（可以忽略电荷因素）.十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂, 在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在.这种阴离子去污剂能破坏卵白质分子间以及与其他物质分子间的非共价键, 使卵白质分子的二硫键被还原剂翻开其实不容易再氧化, 这就保证了卵白质分子与SDS充沛结合从（SDS结构示意图）而形成带负电荷的卵白质-SDS复合物.卵白质分子与SDS结合后所带上的SDS负电荷年夜年夜超越了卵白质分子原有的电量, 因而也就掩盖或消除分歧种类卵白质分子间原有的电荷不同.这样的卵白质-SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再受卵白质原有电荷和形状等因素的影响, 而主要取决于卵白质分子量年夜小.当卵白质的分子质量在15000-20000之间时, 电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系, 符合下列方程式：lgMw=-b.Mr+K.式中, MW为卵白质的分子量, mR为相对迁移率, b为斜率, K为截距, 在条件一按时, b和K均为常数.采纳SDS-PAGE系统作单向电泳, 不单可以根据分子量年夜小对卵白质进行分离, 而且可以根据电泳迁移率年夜小测定卵白质的分子量.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测, 纯化的卵白质通常在SDS电泳上应只有一条带, 但如果卵白质是由分歧的亚基组成的, 它在电泳中可能会形成份别对应于各个亚基的几条带.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度, 一般只需要不到微克量级的卵白质, 而且通过电泳还可以同时获得关于分子量的情况, 这些信息对了解未知卵白及设计提纯过程都是非常重要的.三、脉冲电场凝胶电泳（一）简介一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA, 这是因为在琼脂糖凝胶中, DNA分子的有效直径超越凝胶孔径时, 电场作用迫使DNA变形挤过筛孔沿着泳动方向伸直, 因而分子年夜小对迁移率影响不年夜, 此时凝胶介质的分子筛效应不明显.脉冲电场凝胶电泳是在琼脂糖凝胶上外加正交的交变脉冲电场, 其方向、时间与电流年夜小交替改变, 每当电场方向发生改变, 年夜分子的DNA便滞留在爬行管内, 直至沿新的电场轴向重新定向后, 才华继续向前移动, DNA分子越年夜, 这种重排所需时间就越长, 当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时, DNA就可以按其分子量年夜小分开, 因此分辨力较高, 是用于分离年夜分子量线状DNA分子的一种电泳方法.（二）应用（1）用于分离线状DNA, 从环状DNA中分离出线状DNA的技术称作脉冲场聚丙烯酰胺凝胶电泳, 先采纳在钳位均匀电场中的水平聚丙烯酰胺凝胶电泳, 后改在电场转凝胶电泳条件下的缓冲溶液非连续性垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳, 从而使分离简单, 有效.（2）用于分离EB病毒基因组, EB病毒不能在其转化的淋巴细胞中引起年夜量溶解性感染, 因此采纳惯例方法分离EB病毒DNA比力困难, 以往的分离方法需要从年夜量的部份感受态B-淋巴细胞培养物中增殖病毒粒子, 故分离到的纯EBDNA量很少, 采纳PFGE分离技术则能获得更多的量.（EB病毒）（3）用于研究年夜分子复合物如何形成生物系统, 通过提高成熟线形双链细菌DNA和体内外成熟细菌DNA末端连接复合物的分离长度, 提高细菌DNA环状形式的分离, 提高线状单链细胞DNA的分离, 提供分析卵白质-DNA复合物的相对简单的方法, 提供比液相阶段更为简单和有效的、对所有细菌DNA进行定量分析的固相阶段分析法来达到目的.（4）用于研究细胞凋亡, 因凋亡时DNA的降解先于细胞形态学的变动, 故敏感、特异地检测降解DNA的片段梯度被认为是检测细胞凋亡的标识表记标帜.四、不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳在有较高pH值的电泳胶聚合后, 在此基础上再制备一段低于pH值的年夜孔径聚积凝胶, 当给两极施加电场,缓冲离子从上方的缓冲液库向聚积凝胶迁移, 上方缓冲库中缓冲阴离子进入聚积凝胶后, 凝胶中的pH值比它们自身的pK值要低很多, 因此酿成电中性, 引起导电体的缺乏, 于是聚积凝胶中电阻增年夜, 年夜部份电场就加在聚积凝胶上, 招致卵白质分子在聚积凝胶中的迁移速度比在电泳胶中年夜很多, 致使所有卵白质分子在两种凝胶的界面上密集, 当低pH值的缓冲离子从聚积凝胶中迁出, 所有缓冲离子都是高pH值, 两种凝胶电阻率相同, 各种卵白质分子再同时从界面向正极迁移, 可使试样带变窄, 提高分辨率.五、等电点聚焦电泳（一）简介等电点聚焦是根据卵白质的净电荷或者等电点的分歧来进行分离, 将试样至于pH梯度的凝胶中, 卵白质在电场作用下沿着pH值梯度方向迁移, 当达到某一位置时, 在该pH条件下, 其净电荷为零, 因此不再移动, 由于许多卵白质都有其特定的等电点, 因而可将卵白质分离开来.丙酰胺衍生物作缓冲液可使梯度缓冲离子固定化, 其中R为羧酸基或季铵基, 每种缓冲液都有一特定的pK值, 衍生物与丙烯酰胺一起聚合, 在聚合之前和聚合过程中施加电场, 在电场的作用下各种缓冲液按pH值高低顺序自动排列成序, 这样在电场作用下, 各缓冲液按pK高低次第自动排列成pH梯度, 当整个凝胶聚合后, 各缓冲液被聚合到凝胶中而固化, 因而可利用pH梯度准确地分离具有分歧等电点的各种卵白质, 提高分辨率.高电场可提高等电点聚焦的分离效果, 但需要有效地散热, 在试样处置过程中, 要注意防止卵白质的任何化学组成或结构的改变, 以免引起等电点的移动.（二）特点（1）分辨率高, 区带清晰、窄, 加样部位自由, 重现性好, 可测定卵白或多肽的等电点.（2）需无盐溶液, 不适用于在等电点不溶解或发生变性的卵白.六、二维凝胶电泳二维凝胶电泳首先在第一维空间用等电点电泳区分等电点分歧的卵白质, 然后将色带切下放入十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶中将分子量分歧的卵白质区分开来, 等待一段时间让两种凝胶预先达到平衡, 再进行第二维电泳, 可分辨5000种左右的卵白质.七、双向凝胶电泳双向凝胶电泳技术是唯一一种可同时分离上千种卵白质的方法, 可承载几毫克卵白质样品, 将其分离成上千个卵白点.但传统的双向电泳技术存在局限性, 例如效率分歧造成胶与胶之间重复性差, 存在误差使得很难区分卵白点丰度的变动是来源于实验误差还是诱发发生的生物学变动, 难以将卵白质表达量的变动定量, 疏水性膜卵白以及高度酸性或碱性的卵白的溶解度差招致其在双向电泳第一向等电聚焦中难以溶解造成卵白质的损失, 高丰度卵白的静态范围超越了检测可能性的静态范围招致低丰度卵白难以检测, 单一分离难以应对年夜规模的卵白组学分析等.九、不同凝胶电泳不同凝胶电泳技术建立在双向电泳技术的基础上, 以在双向电泳前先对卵白样品进行荧光标识表记标帜为基础, 能够在同一块双向电泳胶中进行两个卵白质样品差此外检测与定量, 从而可以防止传统双向电泳技术胶与胶之间重复性差的缺陷.（荧光染料）由于荧光染料的敏感性及线性, 不同凝胶电泳技术与其他标准的染色技术相比具有更加精确的定量能力, 另外不同凝胶电泳技术不需要进行电泳后的固定或脱色过程, 可减少卵白质尤其是低分子量卵白质的损失, 而且可以在同一块凝胶中比力两个分歧的卵白样品, 胶与胶之间变动的影响完全消除, 使得卵白点荧光强度的不同是来源于生物学变动而非试验误差, 可信度增加.第五部份结论从以上分析中我们可以看出, 凝胶电泳是样品物质在凝胶上进行电泳的过程, 能用来分离鉴定小分子物质（如核苷酸、氨基酸和肽类等）和年夜分子物质（如核酸、卵白质以及病毒颗粒等）.凝胶电泳分离技术是依照物质的电荷几多和分子年夜小进行分离的.凝胶电泳的主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶.凝胶电泳分离技术具有以下特点：一、用途广泛, 对年夜部份高分子物质均可定性定量分离提纯.二、用量小, 平安经济.三、凝胶可控, 选择具有多样性.四、分子筛作用和电泳作用的结合, 分辨能力强.五、把持简单, 制备容易.目前, 科学家正在对积极研究探索凝胶电泳分离技术的其他特性, 相信未来其在生物化学、医学临床等其他方面会而获得更为广泛的应用.第六部份参考文献[1]《卵白质、凝胶电泳及其分析应用》, 陈丹华, 1995年03月[2]《琼脂糖凝胶电泳实验技术研究》, 黄永莲, 2009年06月[3]《聚丙烯酰胺凝胶电泳及其在食品检测中的应用》, 唐亚丽等, 2007年12月[4]《脉冲电场凝胶电泳及其应用》, 彭黎明等, 2000年6月[5]《生物化学技术原理及应用》, 赵永芳, 2002年07月第3版, 科学出书社[6]《分析化学中的分离方法》, 王应玮, 梁树权, 1988年03月第1版, 科学出书社[7][8]。
简述双向电泳的原理
简述双向电泳的原理
双向电泳是一种在凝胶电泳中使用的技术，用于分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物分子。
其原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，以便在凝胶中获得更好的分离效果。
在双向电泳中，首先在一个方向上施加电场，使待分离的生物分子向一个方向移动。
然后，改变电场的方向，使其在另一个方向上移动。
这样，生物分子会在两个方向上进行移动，从而实现更好的分离效果。
双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和电泳技术。
在凝胶电泳中，待分离的生物分子会在凝胶矩阵中随着电场的作用而移动，根据其大小和电荷的不同而被分离开来。
而双向电泳则是在凝胶电泳的基础上，通过改变电场的方向，使生物分子在两个方向上移动，以获得更好的分离效果。
双向电泳在生物分子分离和分析中具有重要的应用，尤其在蛋白质分离和分析中，可以帮助科研人员更准确地分离和鉴定不同的蛋白质。
通过掌握双向电泳的原理和技术，科研人员可以更好地开展生物分子研究，为生命科学领域的发展做出贡献。
总之，双向电泳的原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，在凝胶中实现更好的分离效果，具有重要的生物分子分离和分析应用。
双向凝胶电泳介绍(Thermo)
1D- IEF
Practice
Preparative and analytical polyacrylamide and agarose gels can be readily cast in the laboratory for a variety of pH ranges. Gels are typically cast in sizes of 10 X 8 cm to 23 X 20 cm and in a variety of thicknesses. Precast Immobilized and ampholyte-containing gels are readily available in a variety of pH ranges. Precast sizes range from 0.5 X 6 cm strips for single samples to 12.5 X 24.5 cm large format for multiple samples. Precast gels are available in ultrathin formats, providing a high degree of resolution.
Coomassie blue stained, wide format IEF gel.
1D-SDS-PAGE
Sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Proteins are denatured in SDS. Negatively charged SDS coats the polypeptide evenly circa 1 SDS per 1.5-2.0 peptide bonds The charge density of the denatured protein is then independent of polypeptide length. Protein samples are loaded in individual wells at top of polyacrylamide gel
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
第五章 蛋白质分析及预测方法(新)
第八章 蛋白质分析及预测方法
一、分子量及等电点
蛋白质的一些基本性质可直接分析其一级序 列而获得，如蛋白质的氨基酸组成、分子质 量、等电点(pI)、亲水性和疏水性、信号肽、 跨膜区等。
作者评测：Q3=68%
作者评测：Q3=72.2% CASP2：Q3=67.7% [40.8-82.4]
作者评测：Q3=72.2% CASP1：Q3=71.6% [46.3-94.1] CASP2：Q3=74% [53.1-92.9]
作者评测：Q3=63%
作者评测：Q3=70.9% CASP2：Q3=57.8% [43.6-67.1]
(1978) Gibrat JF, Robson B, Garnier J (1987)
King RD, Sternberg MJE (1996)
PREDATOR Yi & Lander
NNSSP
Frishman D, Argos P (1996) Yi TM, and Lander S (1993) Salamov AA, Solovyev VV (1995)
（一）、Chou-Fasman方法 Chou-Fasman方法曾经是现在仍然是最为普
遍应用的方法。 其基本出发点在于对于蛋白质20种不同的氨
基酸残基在不同的二级结构中出现的几率进 行统计分析得出在不同二级结构中出现的倾 向性。利用这种倾向性，加之周围残基的信 息，在一定规则的指导下就可以进行预测了。
ProtParam可计算蛋白质分子量、理论等电点、氨 基酸组成、各原子组成、在280nm附近的吸光系数、 估计半衰期、稳定指数等，但如蛋白质中含翻译后 修饰过的氨基酸残基，则不计算在内。
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质或核酸分析技术，其特点如下：
1. 高分辨率：双向凝胶电泳可以提供较高的分辨率，允许分离几乎相同大小的DNA片段或蛋白质，使其成为分析样品组成和结构的有力工具。
2. 分离适应性强：双向凝胶电泳适用于各种样品类型，包括DNA、RNA和蛋白质等，可以进行定性和定量分析。
3. 定量准确性：通过比较样品与标准曲线，双向凝胶电泳可以精确地确定样品中的目标物含量。
4. 可视化：双向凝胶电泳结果可以直接观察，并且可以使用染色剂或放射性示踪剂对目标蛋白质或核酸进行可视化。
5. 提供局部结构信息：双向凝胶电泳可以提供有关分子的局部结构信息，如转录起始位点、剪接位点等。
6. 适用于高通量分析：双向凝胶电泳可以同时分析多个样品，适用于高通量分析，提高分析效率。
总的来说，双向凝胶电泳具有高分辨率、适用于多种样品、准确度高、可视化、提供局部结构信息和高通量分析等特点，是一种常用的分析技术。
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
转印至膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）是一种常用的蛋白质
分离和分析技术。
该技术基于蛋白质的等电点电泳和SDS-PAGE两个步骤，可
以将复杂的蛋白质混合物在二维空间中进行高效分离。
在第一个维度的等电点电泳中，蛋白质根据其等电点的不同而在电场中移动，直到达到等电点停止运动。
在第二个维度的SDS-PAGE中，将蛋白质根据其分子量的大
小进行分离，通过聚丙烯酰胺凝胶中的孔隙网络进行阻滞和过滤。
最终，结果可以通过染色或质谱分析来可视化和识别不同蛋白质的分离。
通过2D-PAGE技术，可以同时考察蛋白质的等电点和分子量，从而实现高分辨率的蛋白质组分析。
这项技术在生物学、药学、生物医学等领域中广泛应用，可以用于寻找生物标志物、分析蛋白质相对丰度、比较样品间的差异等。
双向二维聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳操作
双向二维聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳操作下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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宿主细胞蛋白(HCP)检测方法及其原理
宿主细胞蛋白(HCP)检测方法及其原理HCP（Host Cell Proteins，宿主细胞蛋白）是指生物制品生产过程中，来自生产用细胞的蛋白质杂质。
例如，当使用哺乳动物细胞（如CHO细胞）生产重组蛋白时，除了目标蛋白外，还可能有一些CHO细胞本身的蛋白存在于最终产品中。
这些HCP可能会影响产品的稳定性、效力或安全性，因此需要进行检测和控制。
以下是HCP检测的常用方法及其原理：1、ELISA (酶联免疫吸附测定法)（1）原理：特异性抗HCP抗体被固定在酶标板上。
待测样品中的HCP与抗体结合，然后再加入与HCP结合的酶标记的二抗。
通过测定酶的活性，可以间接测量HCP的含量。
（2）优点：灵敏，可以量化HCP的总量。
（3）缺点：需要高质量的抗HCP抗体，可能不检测到所有的HCP杂质。
图1。
2、质谱法（1）原理：利用质谱仪检测和鉴定样品中的蛋白质。
（2）优点：可以鉴定具体的HCP种类，高分辨率。
（3）缺点：技术要求高，成本较高，数据处理复杂。
3、免疫印迹 (Western Blot)（1）原理：先通过凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到膜上，并使用特异性抗HCP抗体检测目标HCP。
（2）优点：可以鉴定和定量特定的HCP。
（3）缺点：只能检测到与使用的抗体有反应的HCP。
4、二维凝胶电泳 (2D-PAGE)（1）原理：通过两个方向的凝胶电泳分离蛋白，一维按等电点，二维按分子量，形成蛋白质的二维图谱。
（2）优点：可以观察到样品中所有蛋白的分布。
（3）缺点：技术要求高，不能直接量化。
在生物制品的开发和生产中，通常会结合多种方法来检测和控制HCP，以确保产品的质量和安全性。
page凝胶电泳实验要点
page凝胶电泳实验要点Page凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子（如DNA、RNA 和蛋白质）的方法。
它基于生物大分子在电场中的电荷和大小的差异，通过电泳迁移的速度的不同来实现分离。
本文将从实验前的准备工作、样品制备、凝胶制备、电泳条件和结果解读等方面介绍Page凝胶电泳实验的要点。
实验前的准备工作是确保实验能够顺利进行的关键。
首先，需要准备好实验所需的仪器和试剂，包括电泳仪、Page凝胶、电泳缓冲液、样品和分子量标记物等。
其次，要对仪器进行检查和校准，确保仪器的正常运行。
同时，要按照实验设计的要求，准备好所需的样品和试剂。
样品制备是Page凝胶电泳实验的关键步骤之一。
对于DNA和RNA的分离和分析，需要进行DNA或RNA的提取和纯化工作。
对于蛋白质的分离和分析，需要进行蛋白质的提取和富集工作。
样品的制备过程中要注意避免污染和降解，确保样品的纯度和完整性。
凝胶制备是Page凝胶电泳实验的核心步骤之一。
Page凝胶通常使用聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖双杂化凝胶。
凝胶的制备涉及到凝胶浓度、凝胶缓冲液的配制、凝胶模具的选择和凝胶聚合等步骤。
在制备凝胶时，要注意避免气泡的产生和凝胶的不均匀性。
电泳条件是Page凝胶电泳实验中影响分离效果的重要因素之一。
电泳条件包括电场强度、电泳缓冲液的选择、电泳时间等。
不同的生物大分子在电泳时需要不同的电场强度和电泳时间。
在设置电泳条件时，要根据样品的特性和实验目的进行调整，以获得最佳的分离效果。
结果解读是Page凝胶电泳实验的最后一步。
通过观察电泳结果，可以判断样品中生物大分子的分子量、数量和纯度等信息。
在解读结果时，要注意区分目标条带和杂交条带，根据分子量标记物的位置和大小，确定目标条带的分子量。
同时，还可以根据目标条带的强度和数量，推测生物大分子的含量和纯度。
Page凝胶电泳是一种重要的生物大分子分离和分析方法。
在进行Page凝胶电泳实验时，需要做好实验前的准备工作，合理制备样品和凝胶，设置适当的电泳条件，并正确解读实验结果。
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Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。
同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求 流程 技术路线
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
生物学问题 的提出
蛋白质样品的制备
凝胶中的蛋白
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽 肽指纹图 肽序白转录后修饰的鉴定
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。
20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS)
(Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H.
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
蛋白点 的切取
图像扫描和初步分析
蛋
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
白
蛋白信息的 初步获得
质
组
分
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
其它实验 的进一步
析 流
验证
程
蛋白质组研究的基本技术路线
J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die
anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。
1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优 化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；
此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一 般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质 点。
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。