第三章蛋白质一级结构的测定
蛋白质一级结构测序解析
蛋白质顺 序测定基 本方法路 线
纯蛋白质
二硫键拆开
末端氨基酸测定 专一性裂解
将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
测定一级结构的基本方法
基本步骤： (1) 测定末端氨基酸数目，确定蛋白质分子是由几条 肽链构成的； (2) 拆分蛋白质分子的多肽链，断开多肽链内二硫键 并分离出每条肽链。 (3)将肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成 (4)鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基 (5)至少用两种方法将多肽链水解成较小的片段； (6)分离并测定各肽段的氨基酸序列； (7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构； (8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
胰岛素
-巯基乙醇
碘乙酸
尿素和盐酸胍与蛋白质的可能作用方式： a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在 水中的溶解度
（NH）
脲或胍 脲或胍
（四）氨基酸组成的分析
氨基酸分析仪进行测 定，测定每条多肽链 的AA组成，并计算出 AA成分的分子比。
（五）裂解多肽链成较小的片段
酶解法：如胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 化学法：如溴化氰法 羟胺法
二硫键位置的确定
+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ第 二 向
a b
-
pH6.5 图中a、b两个斑点是 由一个二硫键断裂 产生的肽段
+
第一向
-
Brown和Hartlay对角线电泳图解
（九）蛋白质测序举例
• 胰岛素测序自学
胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。
含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽）。 A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之 间形成一个链内二硫键。
第三章 蛋白质一级结构及测定
③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二 硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试 剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与 疏基乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。
还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定 SH基的方法可用烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生 物。
它能选择性 地切割由甲 硫氨酸的羧 基所形成的 肽键
R1 O + HO -CH-C-N-CH-C=NH-CH-C~ 2 Br O H2C O CH2 + CH2-S-C N ¼»ÁÇË ×ùòèá R H O H 2O +-CH-C-N-CH-C O O H2C-CH2
R
H
R1 O H2N-CH-C~ C¶ ë ¶ NÄ ¶ ËÄÎ ©Ë
R1 R2 Rh H2N-CHCO~NH-CHCO~NH-CHCOOH R1 R2 õë £Â õë £Â £±¼È³Ìõ뻺Σ ¨½×©éá£Â¯Ïï© Î Ë NH2NH2 Þ® o 100 C 5~10h Rh
H2N-CH-CONHNH2+H2N CH CONHNH2+....+H2N-CH COOH
OH－ pH9 —
苯异硫氰酸酯 ( PITC ) S
=
②与Edman试剂反应的 产物为：苯乙内酰硫脲氨 基酸（PTH-氨基酸） ③PTH-氨基酸可用乙 酸乙酯抽提，再用纸层析 或薄层层析鉴定
S C
－NH－C－NHCHCO－NHCHCO —
苯氨基硫甲酰多肽 （氨基酸）
S－C C N H － —
R H+ O
蛋白质的一级结构
蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA
1*104 5*103 2*103 1000 200 -500 100
பைடு நூலகம்
蛋白质与多肽无严格的界线 ——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大
蛋白质构象和结构的组织层次
蛋 白 质 的 结 构 层 次
一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构
①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。
②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂
3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和
（六）、肽段氨基酸序列的测定
Edman法 （苯异硫氰酸酯法）
O NH CH C R1 R2
水解位点
O NH CH C R3
O NH CH C R4
O NH CH C
肽链
胰蛋白酶trypsin
• R1=Lys（K）和Arg（R） • 专一性较强，水解速度快 • R2=Pro（抑制）
（五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 2、化学裂解法 多 肽 链 的 选 择 性 降 解
（一）、肽和肽键的结构
①肽键中C-N键有部分 双键性质 ——不能自由旋转 ②组成肽键原子处于 同一平面（肽平面） ③有一定键长键角 ④大多数情况以反式 结构存在
共价主链
（二）、肽的物理化学性质
等电点（两性）。 • 酸碱性质取决于： —α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离 • 具有双缩脲反应——Pr特有的反应。
（一）、蛋白质测序策略
蛋 白 质 一 级 (6)多肽链断裂成多个肽段 结 • 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 构 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。 的 测 定 (5)分析多肽链的N-末端和C-末端
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
[理学]第三章 蛋白质一级结测定_OK
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¤
用DNS法鉴定N-末端氨基酸， 用Edman法降解提供依次减 少一个氨基酸残基的多肽。
¤
¤ 27
其它测定方法
（2）其他序列测定法（了解）
• 酶降解 法
序列
ABCDEFGHIJK---
酶解
AB，CD，EF，GH，IJ， K－
Edman循环后再酶解
BC，DE，FG，HI，JK，---
• 质谱法
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酶解法末端测序
多 肽 链 的 选 择 性 降 解
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酶法专一性水解
肽键的专一性水解(酶法)
重要的具有典型特征的有： 胰蛋白酶：R1=Lys, Arg 糜蛋白酶: R1 =Phe, Tyr, Trp
21
了解
• 化学法：(Cyanogen bromide)
• 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧
多 基所形成的肽键。
5
测定步骤
• 2、多肽链的拆分。 • 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚
蛋 体。 • 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
白 质 一 级 结 构 的 测 定
6
测定步骤
• •
蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定
3、二硫键的断裂
几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下， 用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成 的巯基，以防止它重新被氧化。
Edman
H
O
O
氨
N C S H N CH C NH CH C
基
R1
R2
酸 顺
H
N C S: O
蛋白质一级结构的测定
其他裂解肽的方法：
A：部分酶分解法：0.1N HCl在110度或6N HCl 在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和 肽均不适用； B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成 一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。 羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达 70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro； C： 稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键 对酸不稳定； D：Cleavage at Trp resides by oiodosobenzoine acid (亚碘酰基苯甲酸）产率： 70%-100%
多肽的专一性降解（specific cleavage of
大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目 前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但 由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这 种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶 法俩种。 1 化学法（大片段）
A:Cyanogen bromide (CNBr) 它选择性的切断Met残 基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser) 和高丝氨酸内酯(Homoserine lactone)。 在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚 远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨 酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加， 计算甲硫氨酸的量。 the protein）
• 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 • 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中 的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进 化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序 差别越大. • 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β -链 上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨 大差异
蛋白质一级结构测定详解
2020年10月2日星期五
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本法的优点： （1）除去N末端氨基酸后剩下的肽链 部分仍是完整的，可以依照前法重复 测定新生的N末端氨基酸。
2020年10月2日星期五
4
天然蛋白质分子量的测定，对于蛋
白质一级结构的测定是十分重要的信息。 根据蛋白质的分子量和蛋白质分子中氨 基酸的平均分子量，可以大致估计蛋白 质分子中氨基酸组成的数目。
在蛋白质序列测定中，对分子量测 定的要求不高，误差小于10%即可以。
分子量的测定立法主要有：
SDS-凝胶电游泳法、超速离心法、
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法双向层析指纹图
2020年10月2日星期五
2b3ack
异硫氰酸苯酯法：目前应用最广泛的 一种氨基末端的测定方法多肽或蛋白 质与PITC在pH≈9，40 ℃作用时形成 苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质（简称 PTC多肽或蛋白质）后者与酸在有机 溶剂中反应后，代表N末端的PTC氨基 酸环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物 而从肽链上掉下来，此产物可用气液 色谱法进行鉴定。
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氨
基
酸
组
成
测
定
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氨
基
酸
自
动
分
析
仪
原
理
图 2020年10月2日星期五
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多肽链的末端分析
（氨基）端的测定 （1）2，4-二硝基氟苯法（DNP）
（2）丹磺酰氯（DNS-Cl）法（DNS）
（3）异硫氰酸苯酯（PITC）-Edman降解法
能研究生命过程中的许多复杂问题。
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤蛋白质可是个神奇的东西呀！就像我们生活中的一个小秘密，要想揭开它的神秘面纱，了解它的一级结构，那可得一步步来。
首先呢，得把蛋白质从它所在的环境中分离出来，这就好比从一堆杂物中找出我们想要的宝贝。
然后，对它进行纯化，把那些杂质都去掉，让它变得纯净纯净的，就像把宝石打磨得亮晶晶的。
接下来，就是关键的一步啦，测定它的分子量。
这就好像要知道一个人的体重一样，得有个准数呀！可以用一些专门的方法，比如凝胶过滤或者质谱法啥的。
然后呢，把蛋白质切成小小的片段。
这就像是把一个大蛋糕切成小块，这样我们才能更好地研究它呀。
这一步可以用一些酶或者化学试剂来帮忙。
再之后呀，对这些小片段进行分析。
哎呀，就像我们仔细观察每一块小蛋糕，看看它们都有啥特点。
可以用各种方法，比如氨基酸分析呀，或者测序啥的。
最后呢，把这些小片段的信息整合起来，就像拼图一样，把它们拼成一个完整的画面。
这样，我们不就知道蛋白质的一级结构啦！
你想想看呀，这就好比我们要了解一个人的故事，得从他的点点滴滴开始拼凑，最后才能知道他完整的经历。
测定蛋白质一级结构不也是这样嘛！这可是个精细的活儿呢，需要我们耐心又细心地去做。
要是不这么一步步来，那可就像没头苍蝇一样乱撞啦，怎么能揭开蛋白质的神秘面纱呢？所以呀，这每一步都很重要，都不能马虎呢！我们得认真对待，才能真正了解蛋白质的奥秘呀！你说是不是这个理儿呢？
总之呀，测定蛋白质一级结构虽然有点复杂，但只要我们按照这些基本步骤来，一步一个脚印，就一定能成功的啦！让我们一起加油，去探索蛋白质的神奇世界吧！。
蛋白质分子基础蛋白质一级结构测定
Ala ·Phe·Gly·Lys +Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
因此，得到蛋白质的序列为：
Ala ·Phe·Gly·Lys ·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val
二硫键的确定
蛋白质用胃蛋白酶充分处理
（b）Sanger试剂处理得DNP-Ala。 （c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以
Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。 （d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，
Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。
缺点：
不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。
氨基酸的分离与含量测定
特殊氨基酸的测定
色氨酸的测定
紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比
例，可用方程计算出Trp的含量：
Trp ＝ (A288Tyr*1280) －(A280Tyr*385)
↓ 点样、滤纸中央 PH6.5 第一向电流
↓ 肽段按大小及电荷分开
↓ 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（－S－S－断裂）
↓ 含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽
↓滤纸旋转90 PH6.5第二向电流
↓ 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷
↑↓ 偏离对角线
↓ 茚三酮 AA顺序分析
↓ 确定二硫键的位置
由下列信息求八肽的序列。 （a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val
蛋白质一级结构的测定
05
蛋白质一级结构测定的应用 与展望
在生物科学研究中的应用
蛋白质功能研究
通过测定蛋白质一级结构，可以 深入了解蛋白质的功能和作用机 制，为生物科学领域的基础研究 提供重要信息。
生物进化研究
蛋白质一级结构的比较分析有助 于揭示生物进化的规律和机制， 为生物进化研究提供有力支持。
生物标志物发现
蛋白质一级结构的测定可以为生 物标志物的发现和鉴定提供依据， 有助于疾病预警、诊断和治疗。
详细描述
序列分析法是测定蛋白质一级结构最直接的方法，包 括Edman降解法、化学裂解法、质谱法等。Edman 降解法是通过将蛋白质一级结构中的每个氨基酸残基 依次进行化学修饰和测序，从而确定氨基酸的排列顺 序。化学裂解法则是利用化学试剂将蛋白质分解成较 小的肽段，再测定每个肽段中氨基酸的组成和排列顺 序。质谱法则通过分析蛋白质的离子化特性来确定氨 基酸序列。
质谱技术的优势与局限性
优势
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高 准确性等优点，能够快速准确地测定蛋 白质一级结构，且样品需求量少，适用 于大规模蛋白质组学研究。
VS
局限性
质谱技术对于样品纯度和分子量范围有一 定的要求，对于复杂样品和低丰度蛋白质 的测定仍存在挑战。同时，质谱仪器成本 较高，操作和维护较为复杂。
肽质量指纹图谱
通过将蛋白质酶解成肽段，利用质谱技术分析肽段的质量， 可以获得肽质量指纹图谱，用于蛋白质的鉴定和一级结构 的测定。
串联质谱
串联质谱技术通过将肽段离子进一步裂解，产生更小的片 段离子，从而更精确地测定肽段序列和氨基酸组成，进一 步确定蛋白质一级结构。
磷酸化位点测定
质谱技术还可以用于磷酸化位点的测定，通过分析磷酸化 肽段的离子，可以确定磷酸化位点和磷酸化类型。
蛋白质的一级结构(共价结构)
1.蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
2.蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象（高级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)3.一级结构的要点．4.蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3）测定多肽链的氨基酸组成。
（4）断裂链内二硫键。
（5）分析多肽链的N末端和C末端。
（6）多肽链部分裂解成肽段。
（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。
（9）确定多肽链中二硫键的位置。
5.蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
6. 直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法 N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4B 法裂解 B1 B2 B3 B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
7. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测600-800bp8. 测序前的准备工作9. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。
（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS —cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸10. 测定分子量用于估算氨基酸残基n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法11. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：⑴非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3Hβ巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 (α2β2)（注意，人的血红蛋白α和β的N 端相同。
）分子量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆二硫键： M 1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M 1 + 2M 212. 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。
蛋白质结构
蛋白质的结构可以分为四个层次来研究，即一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。
其中一级结构又称蛋白质的化学结构（chemicalstructure）、共价结构或初级结构。
而二级结构、三级结构和四级结构又称为蛋白质的空间结构或三维结构(threedimensional structure)。
一、蛋白质的一级结构（一）蛋白质的一级结构所谓蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置。
一级结构是蛋白质分子结构的基础，它包含了决定蛋白质分子所有结构层次构象的全部信息。
蛋白质一级结构研究的内容包括蛋白质的氨基酸组成、氨基酸排列顺序和二硫键的位置，肽链数目，末端氨基酸的种类等。
蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的生物大分子，不同蛋白质的氨基酸种类、数量和排列顺序都不同，这是蛋白质生物学功能多样性的基础。
一级结构是蛋白质的共价键结合的全部情况，在生物化学及其相关领域中，许多问题都需要知道蛋白质的一级结构。
有些蛋白质不是简单的一条肽链，而是由2条以上肽链组成的，肽链之间通过二硫键连接起来，还有的在一条肽链内部形成二硫键（图2-7）。
二硫键在蛋白质分子中起着稳定空间结构的作用。
一般二硫键越多，蛋白质的结构越稳定。
蛋白质的氨基酸排列顺序对蛋白质的空间结构以及生物功能起着决定作用，通常氨基酸的排列顺序是不能轻易改变的，有的蛋白质分子只有—个氨基酸的改变就可能改变整个蛋白质分子的空间结构和功能，所以蛋白质的一级结构包含着决定其空间结构的因素。
（二）蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定就是测定蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，这是揭示生命本质，阐明结构与功能的关系，研究酶的活性中心和酶蛋白高级结构的基础，也是基因表达、克隆和核酸顺序分析的重要内容。
蛋白质一级结构的测定主要包括以下基本步骤：1．测定蛋白质的分子量和氨基酸组成获取一定量纯的蛋白质样品，测定其分子量。
将一部分样品完全水解，确定其氨基酸种类、数目和每种氨基酸的含量。
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不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证
测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。
不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类
①鉴定样品纯度 ②容易找到末端肽段，对于最后拼成一级结构有 帮助 ③可以知道N末端是否被封闭或酰胺化，减少序列
测定中的盲目性
3. 测定一级结构的基本步骤
测定蛋白质分子中多肽链的数目 多肽链的拆分 根据多肽链的长短和氨基酸组成情况，选择两种切点不同的裂
解试剂，分别将多肽链裂解成一系列的肽段
选择合适的分离提纯方法，对上述肽段混合物进行分离纯化以
获得高纯度的各种肽段
用Edman降解法.蛋白质序列仪等测定每一种肽段的氨基酸序列 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 比较两套肽段的氨基酸序列,找出接头肽,建立多肽链的一级结
构
确定S-S,酰胺基、配基在多肽链中的位置
第三章
蛋白质一级结构的测定
测定的基本战略和步骤 蛋白质和肽的氨基酸组成分析
末端氨基酸的测定
肽链专一性水解和肽片段的分离纯化
肽段的序列测定
由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构
第二节 蛋白质和肽的氨基酸组成分析
蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构 蛋白质中氨基酸组成的测定
蛋白质的水解
氨基酸的分离和定量测定
O
-吡咯烷基--羧酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O
H3NN H2 ＋
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
CH C CH2
O－ OH
苯丙氨酸 Phenylalanine
-氨基--苯基丙酸
色氨酸 Tryptophan
甲硫氨酸 Methionine
CH3
-氨基--甲硫基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸
Glycine
不带电荷极性R基团氨基酸
O
H32N H N＋
CH C H
O－ OH
氨基乙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 丝氨酸
Glycine Serine
不带电荷极性R基团氨基酸
O
H3NN H2 ＋
CH C CH2 OH
O－ OH
-氨基--羟基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine
不带电荷极性R基团氨基酸
O H2 N H3N＋ CH C CH OH CH3 OH O－
O
H32N H N＋
CH C CH3
O－ OH
-氨基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸
Alanine
Valine
非极性R基团氨基酸
O
H32N H N＋ O－ OH
CH C CH CH3 CH3
-氨基异戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
，-二氨基己酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
异亮氨酸 Ileucine
-氨基--甲基戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
CH CH2 CH2 CH2
HN H2 N ＋
C OH O－
英国Sanger等人于 1953年首先完成了胰岛 素的全部化学结构的测 定工作。 胰岛素的分子量为 5734道尔顿，由51个氨 基酸组成。
B 7 7
NH3+ NH3+
A 6 11
COO-
19
含A、B两条链,A链： 21肽,B链：30肽）。
两链由两个链间二硫 键连接，第三个二硫键 在A链内部形成。
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O H2 ＋ H3NN CH C CH2 OH O－
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
HN
苯丙氨酸 Phenylalanine
色氨酸 Tryptophan
第三章 蛋白质一级结构的测定
一级结构 ( Primary Structure )?
1969年，国际纯化学与应
用化学委员会（IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指 蛋白质多肽链中AA的排列顺 序，包括二硫键的位置。组 成一个蛋白质分子的多肽链 的数目和多肽链中氨基酸的 精确序列是蛋白质一级结构 的两个重要方面。 其中最重要的是多肽链的 氨基酸顺序，它是蛋白质生 物功能的基础。
估计序列测定工作量的大小 计算蛋白质的氨基酸定量组成(M/110)
测定一级结构的准备工作
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类
知道蛋白质由几个亚基组成，相同？不同？
测定一级结构的准备工作
测定一级结构的准备工作
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类
知道蛋白质的相对分子量
……
分子量测定的要求并不高，目前用物理化学方法测 出的分子量，误差在10%左右就足够了。 常用测定方法有： ①凝胶过滤法； ②SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法； ③沉降分析法等
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O
＋ HH2N 3N
CH C CH2 CH CH3 CH3
O－ OH
-氨基异己酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O ‖ H3N＋ H2N－CH－C－OH O－ │ CH －CH3 │ CH2 │ CH3
蛋白质和肽的氨基酸组成分析
末端氨基酸的测定
亚基拆离、肽链专一性水解和肽片段的分离纯化
肽段的序列测定 由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构
第一节 测定的基本战略和步骤
测定的基本战略 测定一级结构的准备工作 测定一级结构的基本步骤
• 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础； • 1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨 基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质 一级结构的新纪元； • Moore Stein改进了Sanger的方法， 完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序 列分析； • 大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA； • ……现在已经有十万种以上不同蛋白质 的一级结构被测定。
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定
测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类
通过氨基酸组成的分析,确定每条多肽链 中氨基酸的种类以及每一种氨基酸残基的数目, 对于选择何种裂解多肽链的方法,极为重要,对 于建立一级结构也有帮助。
测定一级结构的准备工作
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
CH
2
O OH O－
H2 ＋ H3NN
CH C
CH2
C OH O
-氨基戊二酸