第三章蛋白质一级结构的测定

不带电荷极性R基团氨基酸
O N HH2＋ 3N CH C CH2 CH2 C NH2 O OH O－
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 C OH O
O－ OH
-氨基丁二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
-氨基--羟基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine
不带电荷极性R基团氨基酸
O ‖ HH2＋ O－ 3N N－CH－C－OH │ CH2 │ SH
-氨基--巯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
包括以下几方面内容： ①多肽链的数目； ②每条多肽链中氨基 酸的种类、残基数目和 排列次序； ③链内或链间二硫键 的位置和数目。
蛋白质一级结构测定的意义
①是推测蛋白质高级结构的分子依据
②是理解蛋白质功能的分子基础
③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段
④是研究生物进化的分子佐证

测定的基本战略和步骤
特殊氨基酸的测定
蛋白质中氨基酸组成的表示方法
蛋白质营养价值的评价
1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构
组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。

不变部分
可变部分
2. 蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
Alanine
非极性R基团氨基酸

对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类

①鉴定样品纯度 ②容易找到末端肽段，对于最后拼成一级结构有 帮助 ③可以知道N末端是否被封闭或酰胺化，减少序列
测定中的盲目性
3. 测定一级结构的基本步骤
测定蛋白质分子中多肽链的数目 多肽链的拆分 根据多肽链的长短和氨基酸组成情况，选择两种切点不同的裂
解试剂，分别将多肽链裂解成一系列的肽段
选择合适的分离提纯方法，对上述肽段混合物进行分离纯化以
获得高纯度的各种肽段
用Edman降解法.蛋白质序列仪等测定每一种肽段的氨基酸序列 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 比较两套肽段的氨基酸序列,找出接头肽,建立多肽链的一级结
构
确定S-S,酰胺基、配基在多肽链中的位置
第三章

蛋白质一级结构的测定
测定的基本战略和步骤 蛋白质和肽的氨基酸组成分析


末端氨基酸的测定
肽链专一性水解和肽片段的分离纯化


肽段的序列测定
由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构
第二节 蛋白质和肽的氨基酸组成分析
蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构 蛋白质中氨基酸组成的测定
蛋白质的水解
氨基酸的分离和定量测定
O
-吡咯烷基--羧酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O
H3NN H2 ＋
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
CH C CH2
O－ OH
苯丙氨酸 Phenylalanine
-氨基--苯基丙酸
色氨酸 Tryptophan
甲硫氨酸 Methionine
CH3
-氨基--甲硫基丁酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸
Glycine
不带电荷极性R基团氨基酸
O
H32N H N＋
CH C H
O－ OH
氨基乙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 丝氨酸
Glycine Serine
不带电荷极性R基团氨基酸
O
H3NN H2 ＋
CH C CH2 OH
O－ OH
-氨基--羟基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine
不带电荷极性R基团氨基酸
O H2 N H3N＋ CH C CH OH CH3 OH O－
O
H32N H N＋
CH C CH3
O－ OH
-氨基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸
Alanine
Valine
非极性R基团氨基酸
O
H32N H N＋ O－ OH
CH C CH CH3 CH3
-氨基异戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
，-二氨基己酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
异亮氨酸 Ileucine
-氨基--甲基戊酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
CH CH2 CH2 CH2
HN H2 N ＋
C OH O－
英国Sanger等人于 1953年首先完成了胰岛 素的全部化学结构的测 定工作。 胰岛素的分子量为 5734道尔顿，由51个氨 基酸组成。
B 7 7
NH3+ NH3+
A 6 11
COO-
19
含A、B两条链,A链： 21肽,B链：30肽）。
两链由两个链间二硫 键连接，第三个二硫键 在A链内部形成。
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O H2 ＋ H3NN CH C CH2 OH O－
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
HN
苯丙氨酸 Phenylalanine
色氨酸 Tryptophan
第三章 蛋白质一级结构的测定
一级结构 ( Primary Structure )?
1969年，国际纯化学与应

用化学委员会（IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指 蛋白质多肽链中AA的排列顺 序，包括二硫键的位置。组 成一个蛋白质分子的多肽链 的数目和多肽链中氨基酸的 精确序列是蛋白质一级结构 的两个重要方面。 其中最重要的是多肽链的 氨基酸顺序，它是蛋白质生 物功能的基础。
估计序列测定工作量的大小 计算蛋白质的氨基酸定量组成(M/110)
测定一级结构的准备工作

对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类

知道蛋白质由几个亚基组成，相同？不同？
测定一级结构的准备工作

测定一级结构的准备工作

对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类

知道蛋白质的相对分子量
……
分子量测定的要求并不高，目前用物理化学方法测 出的分子量，误差在10%左右就足够了。 常用测定方法有： ①凝胶过滤法； ②SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法； ③沉降分析法等
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O
＋ HH2N 3N
CH C CH2 CH CH3 CH3
O－ OH
-氨基异己酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O ‖ H3N＋ H2N－CH－C－OH O－ │ CH －CH3 │ CH2 │ CH3


蛋白质和肽的氨基酸组成分析
末端氨基酸的测定
亚基拆离、肽链专一性水解和肽片段的分离纯化

肽段的序列测定 由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构
第一节 测定的基本战略和步骤
测定的基本战略 测定一级结构的准备工作 测定一级结构的基本步骤

• 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础； • 1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨 基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质 一级结构的新纪元； • Moore Stein改进了Sanger的方法， 完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序 列分析； • 大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA； • ……现在已经有十万种以上不同蛋白质 的一级结构被测定。
对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
类

通过氨基酸组成的分析,确定每条多肽链 中氨基酸的种类以及每一种氨基酸残基的数目, 对于选择何种裂解多肽链的方法,极为重要,对 于建立一级结构也有帮助。
测定一级结构的准备工作
－按R基团的极性分类
天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate
带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）
CH
2
O OH O－
H2 ＋ H3NN
CH C
CH2
C OH O
-氨基戊二酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
赖氨酸
Lysine
带正电荷氨基酸（碱性氨基酸）
O H2N H3N＋ CH C CH2 CH2 CH2 CH2 NH2 OH O－
肽段的分离纯化
寻找重叠肽
逐级进行特异性裂解(70年代后提出,对测定分 子量2-3万以上更有效)

B

防止盲目性,利于肽链顺序的重排


裂解后肽段的分离纯化方便
选择裂解试剂困难
2. 测定一级结构的准备工作

对样品纯度的要求 对蛋白质分子量的测定

测定分子中多肽链的数目与种
蛋白质的氨基酸组成 蛋白质的配基 蛋白质的端基分析
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine 酪氨酸 Tyrosine 天冬酰胺 Asparagine
不带电荷极性R基团氨基酸
O
＋ HH2N 3N
CH C CH2 C NH2 O
O－ OH
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine 酪氨酸 Tyrosine 天冬酰胺 Asparagine 谷氨酰胺 Glutamine
类

样品必需纯（>97%以上） ……

常用来检测蛋白质样品均一性的方法有： ①双向分析电泳； ②在解离条件下的凝胶电泳； ③离子交换层析； ④N-末端氨基酸的测定； ⑤亲和层析； ⑥纯化至恒定比活； ⑦肽(酶)谱分析； ⑧Western印渍法。
通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的样 品作为序列测定样品。
20
• 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础；
• 1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨 基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质 一级结构的新纪元； • Moore Stein改进了Sanger的方法， 完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序 列分析；
• 大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA； • ……现在已经有十万种以上不同蛋白质 的一级结构被测定。
－按R基团的极性分类
甘氨酸 Glycine 丝氨酸 Serine 苏氨酸 Threonine 半胱氨酸 Cysteine 酪氨酸 Tyrosine
不带电荷极性R基团氨基酸
O H＋ H3N2N CH C CH2 OH O－
OH
-氨基--对羟苯基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
牛胰核糖核酸酶（RNase） 一条多肽链，124AA残基组成，四 个链内二硫键，分子量13800。它是测出一 级结构பைடு நூலகம்第一个酶分子。

蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学 研究的基础；

1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨 基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质 一级结构的新纪元； Moore Stein改进了Sanger的方法， 完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序 列分析；
-氨基--吲哚基丙酸
蛋白质中20种常见氨基酸的结构
－按R基团的极性分类
丙氨酸
缬氨酸 亮氨酸
Alanine
Valine Leucine
非极性R基团氨基酸
O
HH2＋ 3N N
CH C CH2 CH2 S
O－ OH
异亮氨酸 Ileucine 脯氨酸 Proline
苯丙氨酸 Phenylalanine
大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA； ……现在已经有十万种以上不同蛋白质 的一级结构被测定。


1. 测定的基本战略


用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽段；
分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸序列；
对两套肽段序列比较,找出重叠肽,确定各肽段 位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。
裂解方法的选择