分子生物学——基因诊断

治疗
正
❖ 当代及子代
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内容提要
第一节 基因治疗的策略 第二节 基因转移技术 第三节 基因干预 第四节 治疗基因的受控表达 第五节 基因治疗的应用研究 第六节 基因治疗的问题与展望
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第一节 基因治疗的策略
一、基因置换 二、基因添加 三、基因干预 四、自杀基因治疗
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脂质体介导的基因转移示意图
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（二）受体介导转移技术
将 DNA 与 细 胞 或 组 织 亲 和 性 的 配 体偶联，可使DNA具有靶向性。
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受体介导转移技术示意图
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（三）基因直接注射技术
如：肌内注射携带凝血因子Ⅸ 基因的 重组AAV注射液，可产生血友病所需的凝 血因子Ⅸ 。
② 病毒有三个结构基因： gag、pol和env基因（编 码包装蛋白）。
③ 5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ） 等。
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2. 逆转录病毒介导的基因转移系统
逆转录病毒载体
保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗 粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因， 但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。
1. ex vivo（经活体） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过 筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基 因在体内有效地表达相应产物，以达到治 疗的目的。
2. in vivo（活体内） 是指将目的基因直接应用于患者体内。
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基因转移的两种途径
ex vivo 靶细胞 将目的基因导入患 者靶细胞,体外培养
其策略包括：基因内部调节机制、基因外 部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特 异性表达及治疗基因的诱导表达等。
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一、基因内部的调节机制
利用特定基因的转录调控元件来控制治 疗基因表达的细胞或组织特异性。
1. 使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件， 例如酪氨酸酶基因的利用。
2. 使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件， 例如甲胎蛋白(AFP)基因的利用。
② 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短 暂。
③ 部分环节可能产生复制型腺病毒。 ④ 靶向性差。
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（ 三 ） 腺 相 关 病 毒 （ adeno-associated virus, AAV）载体
AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。 其基因组DNA小于5 kb，无包膜。AAV不 能独立复制，只有在辅助病毒存在时，才 能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建 立溶源性潜伏感染。
① 随机整合，有插入突变、激活癌基因 的潜在危险；
② 逆转录病毒载体的容量较小，只能容 纳7 kb以下的外源基因。
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（二）腺病毒(adenovirus，AV)载体
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腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无 包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞 作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移 至细胞核内，保持在染色体外，不整合进 入宿主细胞基因组中。
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引导序列
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（二）核酶的应用
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定 的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要 的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上 解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。
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第四节 治疗基因的受控表达
治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表 达的时间、空间和水平三个方面。
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2. AAV载体的缺陷：
① AAV载体容量小，最多只能容纳5 kb外 源DNA片段。
② 感染效率比逆转录病毒载体低。 ③ 在40%～80%的成人中存在过感染，可
能会引起免疫排斥。
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二、非病毒载体介导的基因转移系统
（一）脂质体介导的基因转移技术 基本原理：利用阳离子脂质体单体与DNA 混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂 质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细 胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转 移至细胞内，并进行表达。
明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。
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五、基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强的细胞因子或 MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微 环境中的抗癌免疫反应。
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第二节 基因转移技术
一、病毒介导的基因转移系统 二、非病毒介导的基因转移系统
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根据基因转移的途径不同，基因治疗分为：
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（一）逆转录病毒（Retrovirus）载体
膜蛋白
人类免疫缺陷病毒 （HIV）
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核心蛋白
逆转录酶
+ssRNA
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逆转录病毒的生活周期
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1. 逆转录病毒前病毒的结构特点
① 两端各有一长末端重复序列LTR。
LTR由U3、R和U5三部分组成，内含增强子、启动
子、poly(A)加尾信号及病毒整合序列(IS) 。
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二、基因外部的调节机制
通过施加外部刺激，比如对病灶局部进行 热处理或电离辐射等，促进治疗基因在特定 细胞或组织中表达。
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三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达
利用病灶特异的微环境及其特异表达的基 因来控制治疗基因的表达。如肿瘤组织往往会 出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境，其中高表达 的GRP78/Bip蛋白编码基因的启动子即可用于 控制治疗基因的肿瘤组织的特异表达。
染色体
校正后的染色体
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二、基因添加 (gene augmentation)
定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身 不表达的基因。
类型：
在基因缺陷的细胞中导入相应的正常基因，补偿 缺陷基因的功能，细胞内的缺陷基因并未除去；
向靶细胞中导入其本来不表达的基因，利用其表 达产物达到治疗疾病的目的。
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（二）受体介导反义RNA转移技术
受体介导反义RNA转移技术可以实现: ① 受体介导的RNA转移十分专一，而且效
率高； ② 被转移的RNA是被保护的，与周围环境
之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗 环境中的核酸酶的降解作用。
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（三） 反义RNA的应用前景
（1）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒
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基因同源重组技术
定向整合的条件:转导基因的载体与基因组 DNA具有相同的序列。带有目的基因的载 体就能找到同源重组的位点，进行部分基 因序列的交换，使基因置换这一治疗策略 得以实现。
基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting）
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基因同源重组技术
重组载体
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腺相关病毒基因组的结构
Ψ：包装信号序列； REP:病毒复制基因； CAP:编码衣壳蛋白的基因； ITR：反向末端重复序列
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1. AAV的特点
① 以潜伏感染为主； ② 高效定点整合至人染色体中，避免随机
整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基 因激活的潜在危险性。
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第三节 基因干预
一、反义RNA 二、RNA干扰 三、核酶
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一、反义RNA
（一）反义RNA与基因表达调控
指能与特定基因mRNA互补结合的一类
RNA,可抑制一些有害基因的翻译。
关键技术问题： 1. 专一性转移问题 2. 反义RNA进入靶细胞前的降解问题
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第十三章 基因治疗原理与研究进展
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基因治疗的概念
将某个遗传物质转移到患者细 胞内，使其在体内发挥作用，以达 到治疗疾病目的的方法。
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基因治疗分类
➢ 体细胞(somatic cell)基 因治疗
❖ 只限于某一体细胞的基因 的改变
❖ 只限于某个体的当代
➢ 生殖细胞(germline)基因 ❖ 对缺陷的生殖细胞进行矫
载体 目的基因
in vivo
将目的基因直 接输入体内
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将重组靶细 胞回输体内
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一、病毒介导的基因转移系统
病毒载体介导的基因转移效率较高， 因此它也是使用最多的基因治疗载体。据 统计，有72%的临床实验计划和71%的病 例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆 转录病毒载体。
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3. 逆转录病毒载体的特点
① 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶 细胞。
② 逆转录病毒结构基因缺失，但不影响其他 部分的活性。
③ 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组 中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表 达。
④ 包装好的假病毒颗粒易于分离制备。
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4. 逆转录病毒载体的主要缺点
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1.腺病毒载体的优点wk.baidu.com
① 基因导入效率高； ② 宿主范围广； ③ 基因转导与细胞分裂无关； ④ 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷
雾吸入或气管内滴注； ⑤ 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基
因。
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2. 腺病毒载体缺点
① 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治 疗基因表达时间相对较短。
LTR
therapeutic gene LTR
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2. 逆转录病毒介导的基因转移系统
辅助细胞株 它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建 而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆 转录病毒载体包装。由于缺乏包装型号， 本身不能被包装成病毒颗粒。
gag pol env
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逆转录病毒包装系统
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三、基因干预（gene interference）
定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达， 或者通过破坏某个基因的结构而使 之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。
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四、自杀基因治疗
原理：将“自杀”基因导入宿主细胞 中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物 前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞 产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细 胞的目的。
为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。
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自杀基因的作用机制
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（一）自杀基因系统
TK/GCV ： 单 纯 疱 疹 病 毒 （ herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核 苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变 成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚 合酶活性，导致细胞死亡。
五、基因免疫治疗
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一、基因置换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通 过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组 内原有的缺陷基因。
目的：将缺陷基因的异常序列进行校正。
特点：对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原 位修复，不涉及基因组的任何改变。
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CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶 （5-FU）。
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（二）旁观者效应
旁观者效应(bystander effect)：“自杀基因” 导入后，不仅使导入了“自杀基因”的肿瘤细 胞在用药后被杀死，而且与其相邻或远处的未 转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
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四、治疗基因的诱导表达
可诱导性基因表达系统能防止治疗基因 表达不再受外界控制。
这种系统的必要成分：一种是转录激活 物，它与DNA结合的活性受某种诱导药物控 制；另一种则是特异性基因表达调控元件， 仅对这种转录激活物有所响应。
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二、RNA干扰 （RNA interference，RNAi）
由双链RNA诱发的基因沉默现象：与 其有同源序列的mRNA被降解，从而抑制 了该基因的表达。
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（一）RNA干扰的机制
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（二）RNA干扰的应用前景
1. 研究基因功能的新工具 2. 肿瘤的基因治疗
3. 病毒性疾病的基因治疗
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三、核酶(ribozyme)
具有酶活性的RNA，可降解特 异的mRNA序列。
核酶
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靶RNA
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核酶的作用机制
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（一）核酶的设计
用于基因治疗的核酶分子由三个 部分组成，中间是保守序列（能够组 成酶活性结构域），两端是引导序列 （guide sequences）。