大肠杆菌的培养和分离
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实验1 大肠杆菌的培养和分离
B．划线上一定会出现单个突变菌株
C．此法不能除去污染的杂菌
D．划线上一定会出现细菌单菌落
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是…… …( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
2．实验原理：
使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。 在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一 个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌 操作。
到（ ）
A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落
4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )
A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌
B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液
【实验记录】 请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下 来，传给任课教师。 【结果分析】 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？
实验1-大肠杆菌的培养与分离
原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光 学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结 构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分 为两大营养类型。
自养菌:
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续 划线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
（五）大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形 的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的 芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随 风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽 孢又可以萌发，形成一个细菌.
【课堂练习】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
实验一大肠杆菌的分离和培养
病毒
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
大肠杆菌的分离和培养
问题2：在培养过程中如何进行维持无菌状态？ 消毒VS灭菌
较为温和的方法，如酒精
强烈，完全无菌
芽孢为细菌的休眠体， 对不良环境有很强耐受性
灭菌消毒技术是微生物有关工作中 最普通也是最重要的技术。
灭菌消毒技术大汇总 1、高压蒸汽灭菌法
1kg/cm2、121 ℃下维持15min. 0.5kg/cm2、90 ℃下维持30min.
大肠杆菌的培养和分离 微生物简单介绍 病毒 细菌 放线菌 真菌 原生生物
放线菌
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体（种群） • 菌落是鉴定菌种的重要依据
• 结构 • 异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-) • 应用
问题1：用什么培养大肠杆菌？（稀释）涂布分离法1、玻璃刮刀放在酒精溶液中待用 2、取出时要经过灼烧 稀释10-5—10-7倍， 3、一般要稀释菌液进行培养 取0.1ml不同浓度的稀释液
4、大肠杆菌的培养和分离的过程
一 配制LB培养基,并灭菌 计算称量 溶解 调pH 分装 加塞，包扎 灭菌
二 倒平板、制斜面 三 大肠杆菌的培养 四 大肠杆菌的分离 使所需细菌大量繁殖 获得单菌落，纯化菌株
KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4· 7H2O 葡萄糖 尿素
1.4 g 2.1 g 0.2 g 10 g 1 g
琼脂
15 g
将上述物质溶解后，用 蒸馏水定容到100 mL
（ （ 1 ）此培养基能否用于植物组织培养？ ）下列材料或用具：①培养细菌用的培养基与培养皿， 4 ）转为固体培养基时，常采用 的 65 ）实验结束后，使用过的培养基应该进行 , （ ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管，③实验操作者的双手。 2）培养基中加入尿素的目的是 处理后，才能倒掉。 其中需要灭菌的是： 筛选 ，这种培养基属于 ；需要消毒的是： 。 （3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中 的 和 ，实验需要振荡培养，原因是
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（1)简述甘蔗大规模快速繁殖技术的过程。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
大肠杆菌的培养和分离
培养基种类
物理状态
• 液体培养基 • 固体培养基 • 半固体培养基
工业生产、 工业生产、连续培养 菌种分离、鉴定、计数 菌种分离、鉴定、 菌种保存
培养基种类
化学成分
• 合成培养基 • 天然培养基
菌种分类、鉴定 菌种分类、 工业生产降低成本
培养基种类
添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别
目的用途
•鉴别培养基 鉴别培养基 • 选择培养基
伊红—美蓝鉴别大肠杆菌 伊红 美蓝鉴别大肠杆菌
添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离
1：加抗生素，用于分离真核生物和原核生物 ：加抗生素， 2：加高浓度的食盐获取金黄色葡萄球菌 ： 3：缺N源，分离固氮微生物 ： 源 4：缺少有机C源，分离自养型微生物 ：缺少有机 源
消毒方法
2、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（80℃中15min 、对一些不耐高温的液体，使用巴氏消毒法（ ℃ 或70 ℃中30min，实际生产中常用于鲜奶的消毒） ，实际生产中常用于鲜奶的消毒） 3、对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等 、对接种室、 溶液以增强消毒效果， 溶液以增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒 4、双手使用酒精进行消毒 、
划线分离法
由接种环以无菌操作沾 取少许待分离的材料， 取少许待分离的材料， 在无菌平板表面进行平 行划线或其他形式的连 续划线， 续划线，微生物细胞数 量将随着划线次数的增 加而减少， 加而减少，并逐步分散 开来， 开来，如果划线适宜的 话，微生物能一一分散 经培养后， ，经培养后，可在平板 表面得到单菌落。 表面得到单菌落。 连续划线法 交叉划线法
包器材
包器材
灭菌
条件： 条件： 121℃、 121℃、100kPa 2020-30min
微生物的利用-大肠杆菌的培养与分离
实验原理
① 培养基 ② 大肠杆菌 ③ LB液体培养基和LB固体培养 基 ④ 划线分离法 ⑤ 菌种的低温保存 ⑥ 无菌技术
一、培养基定义及营养成分
1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长 繁殖的营养基质，称为培养基。 2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长 因子等
• 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台
• ② 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须 灭菌。 • 如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培 养基、无菌衣 、口罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处 理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌， 但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
• 2、营养成分 • ① 碳源 • 为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源 • 。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源； • 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳 源；单质碳不能作为碳源。 • 注意：碳源&能源的辨析
• 2、营养成分 • ② 氮源 • 为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源 • 。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等， • 无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利 用 N2。
微生物的利用
1大肠杆菌的培养和分离 2分离以尿素为氮源的微生物
大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的 • 实验原理 • 实验器具与材料 • 实验步骤 • 实验结果和结论 • 知识拓展
实验目的
• 利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作 • 利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离 • 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理
大肠杆菌的培养和分离解读
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
培养基（culture media）
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的 供其生长繁殖的营养基质。
提供微生物生长的条件： 合适的温度：25-37℃ 合适的pH：细菌 6.5-7.5 中性偏碱
真菌 5.0-6.0 中性偏酸 营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，它是效果最好的灭菌方法。
机盐。
细菌喜荤，霉菌喜素
培养基内所需的其他条件
(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱
性 (2)特殊营养物质 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生
素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨
酵母提取物
各成分的量 0.5g 0.25g
1
2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
培养基（culture media）
按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的 供其生长繁殖的营养基质。
提供微生物生长的条件： 合适的温度：25-37℃ 合适的pH：细菌 6.5-7.5 中性偏碱
真菌 5.0-6.0 中性偏酸 营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，它是效果最好的灭菌方法。
机盐。
细菌喜荤，霉菌喜素
培养基内所需的其他条件
(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱
性 (2)特殊营养物质 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生
素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨
酵母提取物
各成分的量 0.5g 0.25g
1
2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
实验1大肠杆菌的培养和分离ppt课件
2、成分
水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
调节pH
真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
四、无菌操作
1.无菌操作的概念
无菌操作杂泛菌指在培养微生物的操作中，所有防止________污染的方法。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下 一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的 增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和 感染操作者。
大肠杆菌在人体的_____中一肠般道对人体无害，但任何 大大肠肠杆杆菌菌如是_果_进__入_____工__程__中_被__广_泌都泛尿会采系对用统人的体工产具生。危害。
基因
质粒、 EcoRⅠ限制酶、
E.coli-DNA连接酶、
受体细胞
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量生长 繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构 的子细胞群体。
天然培养基：
天然培养基有血清、 血浆、和组织提取液 （如鸡胚和牛胚浸 液）。 优点：营养成分丰富， 培养效果好 缺点：来源受限;成分 复杂，影响对某些实 验产物的提取和实验 结果的分析;易发生支 原体污染;
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
主要包括：
_各__种__器__具__必须无菌、 __培__养__基___也必须要无菌、 ___________时不能带入其他杂菌
实验1：大肠杆菌的培养和分离
04 实验结果与分析
大肠杆菌的培养结果
培养基上生长情况
大肠杆菌在培养基上生长良好，菌落 形态呈圆形、湿润、表面光滑，颜色 为乳白色。
生化反应
大肠杆菌能够发酵乳糖产酸，在生化 反应中表现出特定的特征性变化。
菌落计数
通过菌落计数，我们得到了大肠杆菌 的菌落数量，菌落数量在适宜的条件 下随着培养时间的延长而增加。
详细描述
将接种后的培养皿放置在恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。在培养过程中，要定期观察大肠杆 菌的生长情况，记录生长曲线，以便后续分析。培养过程中要保持培养皿的清洁，防止杂菌污染。
大肠杆菌的分离
总结词
分离是通过一定的技术手段将目标微生物从混合菌群中单独 获取的过程。
详细描述
在大肠杆菌培养完成后，采用涂布法或划线法将菌落分离， 获得单菌落。分离过程中要保证无菌操作，避免交叉污染。 分离得到的单菌落可用于后续的鉴定和实验研究。
了解大肠杆菌的生物学特性
了解大肠杆菌的形态、染色、生化反 应等生物学特性，能够通过实验结果 判断所分离的菌株是否为大肠杆菌。
了解大肠杆菌的致病性，包括其产生 的毒素、侵袭力、抵抗力等方面的特 性，为后续实验和研究提供基础。
掌握微生物实验的基本操作
掌握微生物实验的基本操作，包括无菌操作、显微镜使用、细菌计数、菌种保存 等，能够独立完成微生物实验。
条件致病菌
在特定条件下，大肠杆菌可引 起肠道外感染，如败血症、新
生儿脑膜炎等。
抗原结构
大肠杆菌具有O抗原、H抗原 和K抗原，可用于血清学分型
。
大肠杆菌的培养基
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基础培养基
如肉汤培养基、营养琼脂 培养基等，提供大肠杆菌 生长所需的基本营养成分。
大肠杆菌的培养和分离
4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾 以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上 排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。 当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力 至所需时间。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀 压，所以，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌 锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开 排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如 果压力 未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力 突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡 而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发 生污染。 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养24小时， 经检查若无杂菌生长，即可待用。
2、无菌操作 打开滤风机，点燃酒精灯
用酒精棉球擦拭双手。打开培养皿、试管外包纸， 平放。 转接过程中，瓶塞和封口膜只能夹持手上，不许 落台面；操作过程在酒精灯火焰旁操作；接种环 接种前，环头烧红，环柄火焰上穿梭1~2次，放 入试管和培养皿中稍冷却后接触菌落或菌液，使 用完毕后，重复使用前操作，避免菌外泄；使用 玻璃刮刀和镊子时，从酒精中取出后燃尽其上酒 精即可。 胆大心细，动作快捷
平板培养基倒好冷却凝固后，不论接种还 是恒温培养，都需倒放，如正方，水蒸气 在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表 面会冲散菌落，失去分离菌株的效果。
灭菌与消毒
杀死或除去一切微生物的方法——灭菌 杀死病原菌的方法——消毒
灭菌方法分类 （1）干热灭菌法 （2）湿热灭菌法 （3）过滤灭菌法 （4）紫外光灭菌法 （5）化学药剂灭菌法
多数细菌、酵母菌不形成菌丝，其菌落仅 生长在固体培养基表面，可用接种工具将 其全部挑起，即与培养基结合不紧密 。菌 落表面光滑而湿润，有黏稠性。
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划线分离法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次.
2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
物的过程。
（2）灭菌：
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括 所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到 完全无菌的过程。
灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最 普通也是最重要的技术。
1)消毒：
① 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅
杀死物体表面或内部一部分对人体有害的
微生物。包括芽孢和孢子吗？
② 方法:
3、消毒与灭菌
无菌技术的四个方面
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进 行清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具 进行灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品 相接触。
消毒与灭菌
（1）消毒： 利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生
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2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再 进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使 细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，它是效果最好的灭菌方法。
微生物(microorganism)
结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的等生物。
例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型 原生动物等等
微生物的利用： 抗生素；酒；腐乳；污水治理……
大肠杆菌的培养与分离
一、大肠杆菌（E. coli）
兼性厌氧的肠道内的共生菌群
合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和 腐生菌滋生。
2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭 菌；桌面及人手用酒精棉球消毒
3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三 角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁 操作.
4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨
酵母提取物
各成分的量 0.5g 0.25g
NaCl
0.5g
H2O
加至50ml
固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加1g 琼脂
琼脂？ 凝固剂
红藻中提取的多糖,在98 ℃以上熔化，44 ℃以 下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。
平板划线分离法
平板划线的操作
不能使用脱 脂棉，否则 容易吸水， 造成污染。
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
单菌落
进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？
答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的 形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留 在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回 落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成 菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响， 很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此， 恒温培养时，培养皿必须倒置。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
（二）倒平板
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒 后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底 部，待凝，使之形成平面
培养皿壁上 不能沾有培 养液，否则 容易污染。
注意事项：
1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来 倒平板
(不包括芽孢和孢子)
a. 煮沸消毒法
b. 巴氏消毒法:如牛奶的消毒
c. 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤
酚皂溶液等
d. 紫外线消毒
（2）灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生 物，包括芽孢和孢子。
② 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a.灼烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
（四）大肠杆菌的划线分离
分离方法:划线分离法和涂布分离法
固体培养基：菌落
☆ 菌落
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
(三)无菌技术
1、获得纯净培养物的关键: 防止外来杂菌的入侵
2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页)