酶测定、方法
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
酶样品测定方法
酶样品待测酶液制备方法磷酸缓冲液的制备中性蛋白酶（pH=7.5）准确称取磷酸氢二钠6.02g和磷酸二氢钠0.5g，加水定容至1000ml，配好后用pH计校正。
淀粉酶（pH=6）称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解并定容于1000ml，配好后用pH计校正。
脂肪酶（pH=7.5）称取磷酸二氢钾1.96g，十二水磷酸氢二钠39.62g，用水溶解并定容于500ml，配好后用pH计校正。
酶液的制备称取样品1.000g至10ml试管中，加入磷酸缓冲液5ml，置于高速匀浆机捣碎，然后连残渣一起倒入100ml容量瓶中定容，室温静置1h，期间反复震荡3次，然后取4ml在16000r/min下离心5分钟，取上清液4℃保存待测。
酶活测定淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶采用建成生物工程研究所试剂盒测定，中性蛋白酶采用福林酚法测定。
淀粉酶原理：淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合生成蓝色复合物，根据蓝色的深浅可推算出水解的淀粉量，从而计算出淀粉酶的活力。
单位定义：在37℃、pH6.0下，与底物作用30分钟，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。
分析方法：计算：酶活力（U/g）= (空白管吸光度-测定管吸光度)/空白管吸光度×(0.4×0.5/10) ×(30分钟/7.5分钟) ÷（取样量×酶液浓度）脂肪酶原理：甘油三酯和水制成乳化液，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊性状，胶束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下发生水解，使胶束分裂，散射光或浊度因而降低，降低的速率与脂肪酶活力有关。
单位定义：在37℃条件下，在反应体系中与底物反应1分钟，每消耗lμmol 底物为1个脂肪酶活力单位。
分析方法：1、将分光光度计在420nm处以Tris缓冲液调零。
2、将底物缓冲液在37℃预温5分钟。
3、在试管中加入0.025ml待测样本，再加入试剂四0.025ml，然后加入4ml预温的底物缓冲液，盖住管口，颠倒混合5次，在420nm处比浊，读取吸光度值A1。
测量酶方法
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase , SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除02，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备： 1.高速台式离心机； 2.分光光度计； 3.微量进样器； 4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）； 5.试管或指形管数支。
（三）试剂:1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml（现用现配）；3.750卩mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,（避光保存）；4. 100卩mol/L EDTA- Na2溶液：称取0.03721gEDTA— Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20卩mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml（避光保存）。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5〜2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750 卩mol/L NBT 溶液0.375 卩mol/L 100 卩mol/L EDTA—Na2 液0.310 卩mol/L 20 卩mol/L核黄素0.320卩mol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0 混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000LX日光下反应20min （要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长）。
几种酶的测定方法
各种酶的测定方法:土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
试剂配制：1.甲苯（分析纯）2.10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。
（当天做当天配）3.柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。
4.苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。
B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。
将二溶液保存在冰箱里。
使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5.次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。
标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105 °C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。
将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。
分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50 毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
分析步骤：称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C 恒温箱中培养24小时，过滤。
取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。
20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。
反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。
每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。
酶的测定方法
酶的测定方法
酶是一种生物大分子，能够催化生物化学反应。
酶的测定方法有多种，如下：
1. 活性测定法
酶的活性是指每单位时间内酶所催化的反应物的转化量。
通过活性测定法可以测定酶的活性，常用的方法包括比色法、荧光法、放射性测定法等。
2. 蛋白含量测定法
酶是一种蛋白质，因此可以通过测定酶的蛋白含量来间接测定酶的含量。
常用的蛋白含量测定方法包括比色法、光度法等。
3. SDS-PAGE电泳法
该方法利用SDS-PAGE电泳将酶分离出来，然后通过染色等方法测定酶的含量。
4. 免疫学方法
该方法利用酶的抗原性质，通过抗体结合酶来测定酶的含量或活性。
常用的方法包括ELISA等。
总之，不同的酶测定方法适用于不同的酶以及不同的实验目的，选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
- 1 -。
酶活性的检测方法
DNS 还原糖 显色反应
比色法
蔗糖转化酶的活性检测： 光谱学检测
蛋白酶活性的检测：
BBA - Proteins and Proteomics, 1864 (1), 2016, 130-142
酶活性的检测方法
（二） HPLC检测法
植酸酶的活性检测方法： （植酸酶催化的脱磷酸反应的探针）
Soil Biology & Biochemistry 41 (2009) 192-200
酶活性的检测方法
酶活性的检测方法
（五） 耦合反应法（可耦合脱氢酶反应） 脱氢酶以NADH/NADPH为辅酶
NADH/NADPH的转换可耦 合340nm吸光度变化：
酶活性的检测方法
葡萄糖激酶的活性检测：
3.反应条件应有利于指定反应方向的进行，可以移除生成 物，或接上耦合反应。
二、酶活性的检测方法
直接测定生成物
耦合反应法 （可耦合脱氢酶反应）
光谱学检测法 HPLC检测法 化学测定法 电极检测法
酶活性检测的具体方法
（一） 光谱学检测法
• 生成物有特定的紫外或荧光吸收
木聚糖酶、纤维素酶活性检测：
木聚糖 羧甲基纤维素
主要内容
酶催化反应原理 酵素产品部分酶活性的检测
一、酶催化反应原理
把催化反应转化成可测量的模式
Juang RH (2005) EPA
测量酶催化活性应注意的事项
酶活性的检测通常是指催化活性的检测，建立活性检测步 骤时，应注意：
1.测定生成物的产生量比测定反应物的消失量），回 馈抑制酶反应。
酶活性的检测方法
（三） 化学测定法
• 如果生成物不具有光谱学特性，可以通过化学反应使之转化成 具有特定光谱吸收的物质，进而进行测定。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活测定方法
酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力的测定随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。
比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。
酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
各种酶活力测定方法及注意事项
各种酶活⼒测定⽅法及注意事项碱性蛋⽩酶及各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及测定有感因长期测定碱性蛋⽩酶酶活⼒与⾓蛋⽩酶活⼒与胶原酶活⼒和弹性蛋⽩酶活⼒，碱性蛋⽩酶活⼒测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可⼤⼤减少误差。
其余酶活⼒测定过程中因⽆统⼀标准且底物差异⼤，导致长期酶活⼒测定的混乱，各种酶活⼒测定⽅法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活⼒只能仅作参考。
以下是各种蛋⽩酶活⼒测定⽅法及标曲绘制：碱性蛋⽩酶测定⽅法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋⽩酶活⼒测定福林法以下是⽅法碱性蛋⽩酶的测定⽅法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进⾏，即 1 个酶活⼒单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min ⽔解酪蛋⽩产⽣ 1 µg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（µg/mL）取 100 µg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取⽔的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使⽤液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃⽔浴锅中显⾊ 20 min，⽤分光光度计于波长 680 nm，10mm ⽐⾊⽫，以不含酪氨酸的反应管作为空⽩，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或⽤回归⽅程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（µg），既为吸光度常数 K 值。
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
5种酶测定方法
丙二醛含量(MDA)原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。
在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
三、材料、仪器设备及试1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10％三氯乙酸：50gTCA 用水定容至500ml0.6％硫代巴比妥酸（TBA）溶液：0.6gTBA 溶于100ml水中（加少量1mol/L NaOH溶解）采用赵世杰(1994)方法，略有改动。
称取新鲜材料0.2 g，加入8 ml 10%TCA（三氯乙酸）溶液 (分三次加入，注意冲洗研钵)，在预冷研钵上充分研磨，4000 rpm离心10 min。
取上清液2 ml(对照加2 ml蒸馏水)，加入2 ml 0.6%TBA(硫代巴比妥酸)(用10%的TCA溶液配制)溶液，加塞，摇匀。
酶活力测定的原理和方法
柱法测定：
• 将一定量的固定化酶装进具有恒温装置 的反应柱中，让条件适宜的底物溶液， 以一定的速率流过酶柱，收集流出的反 应液。按常规方法测定底物的消耗量或 产物的生成量。测定方法与游离酶反应 液的测定方法相同。
连续测定
• 利用连续分光光度法等方法可对固定化酶反应 液进行连续测定，从而连续测定酶活力。测定 时，可将振荡反应器中的反应液用泵连续引到 连续测定仪（例如，双束紫外分光光度计等） 的流动比色杯中进行连续分光测定。或者使固 定化酶柱流出的反应液连续流经流动比色杯进 行连续分光测定。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应
一级反应
Km
[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶的测定(详细)
一、脲酶测定(比色法)1.方法原理脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。
测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。
现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
2.试剂配制（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
3.操作步骤取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。
15min后加10mL10％尿素溶液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀，37℃恒温箱中培养24h。
过滤，取1mL滤液注入50mL 容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
）。
标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。
随加随摇匀。
20min 后显色，定容。
lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。
酶检测方法
酶检测方法酶是生物体内一类具有特定功能的蛋白质，它们在生物体内发挥着关键的催化作用。
酶的活性能够反映生物体内代谢的运行状态，因此酶检测在生物学研究、临床诊断和生物工程等领域起着重要的作用。
本文将介绍酶检测的方法，并分析其原理和应用。
一、酶检测的原理每种酶都具有特定的底物，当底物被酶催化后产生一定的产物，可以通过测量产物的数量或者相关反应的速率来间接反映出酶的活性。
酶的检测方法主要有光度法、荧光法、比色法和电化学法等。
光度法是利用酶催化反应后产生的物质溶液的吸收特性来检测酶活性的方法。
首先，选择具有特定光学属性的底物，使酶催化后的产物能够吸收特定波长的光线。
然后，通过测量反应体系中吸光度的变化来确定酶的活性。
举例：以辣根过氧化物酶的检测为例，辣根过氧化物酶能够将辣根过氧化物（HRP）和底物间的过氧化氢催化成高活性的自由基，进而氧化显色底物，形成有色产物。
利用比色法测定产物的吸光度变化，即可定量检测出辣根过氧化物酶的活性。
荧光法是利用酶催化反应产物的荧光特性来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，有些底物和产物具有荧光特性，通过测量产物的荧光强度变化可以确定酶的活性。
举例：以葡萄糖氧化酶的检测为例，葡萄糖氧化酶能够将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，产生荧光物质NADH。
通过测量NADH的荧光强度变化，可以判断葡萄糖氧化酶的活性。
比色法是利用酶催化反应后产生的有色产物来检测酶活性的方法。
在酶催化反应中，底物与其他试剂反应产生有色产物，通过测量产物的吸光度变化来确定酶的活性。
举例：以碱性磷酸酶的检测为例，碱性磷酸酶能够将对硝基苯磷酸钠底物催化成黄色产物对硝基苯胺。
通过测量对硝基苯胺的吸光度变化，可以确定碱性磷酸酶的活性。
五、电化学法电化学法是利用酶在电极表面催化产生电流来检测酶活性的方法。
在电极表面固定酶，底物被酶催化后，产生电荷转移，可以通过测量电流变化来确定酶的活性。
举例：以谷胱甘肽还原酶的检测为例，谷胱甘肽还原酶能够将还原型谷胱甘肽（GSH）氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。
鉴定酶的实验原理
鉴定酶的实验原理
鉴定酶的实验原理是基于酶作用的化学反应或活性的特异性验证。
以下是常见的几种鉴定酶的实验原理：
1. 活性测定法：通过酶催化产物的生成或底物的消耗来测定酶的活性。
例如，测定酶催化反应生成的产物的比色变化、荧光发射强度变化、电流变化等。
2. 底物降解法：以底物作为酶的底物，通过测定底物的消耗或产物的生成来鉴定酶的活性。
例如，测定酶对蛋白质的水解活性时，可以通过检测多肽键的断裂情况来判断酶活。
3. 抑制测定法：添加已知酶动力学抑制剂，观察酶活性的下降情况以鉴定酶的种类。
抑制剂的作用机制可以是竞争性抑制、非竞争性抑制或混合性抑制。
4. 反应速率测定法：通过测定酶反应速率的变化来鉴定酶的种类或测量酶活性的变化。
例如，通过监测酶催化反应速率的变化来测定酶的酶活。
这些实验原理可以根据不同的酶特性和具体的实验目的进行选择和应用。
5种酶测定方法
丙二醛含量（MDA）原理丙二醛（MDA是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5—三甲基恶唑2、4 —二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100 —300卩g • g —1Dw根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0.5nmol • L—1。
在532nm 600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
三、材料、仪器设备及试1. 材料：植物叶片。
2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。
3. 试剂：10%三氯乙酸：50gTCA用水定容至500ml0.6 %硫代巴比妥酸（TBA）溶液：0.6gTBA溶于100ml水中（加少量1mol/L NaOH溶解）采用赵世杰（1994）方法，略有改动。
称取新鲜材料0.2 g，加入8 ml 10%TCA（三氯乙酸）溶液（分三次加入，注意冲洗研钵），在预冷研钵上充分研磨，4000 rpm离心10 min。
取上清液2 ml（对照加2 ml蒸馏水），加入2 ml 0.6%TBA硫代巴比妥酸）（用10%勺TCA溶液配制）溶液，加塞，摇匀。
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总蛋白酶活性测定用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物测定。
偶氮酪蛋白以20 mg/L的浓度溶于0.15molL /NaCI溶液。
取该液0.3mL加人含中肠酶液的0.3mL PH7.2磷酸盐反应缓冲液中反应。
在30℃反应2h,加人0.6mL的2 0%(重量/体积)三氯乙酸终止反应。
反应混合物在11200 x g、4℃下离心15min后,取上清液,在366nm测光吸收值。
反应混合物1个吸收单位的变化定义为1个偶氮酪蛋白单位。
类胰蛋白酶活力测定采用两种专性底物:BAPN A和TAME。
BA PNA以2 0mgm /L溶于二甲基亚矾,取40ul 加入含中肠酶液的1.5mL PH7.2的磷酸盐L反应缓冲液中,反应20min后,加人0.5mL30%(体积/体积)乙酸终止反应,在405nm测光吸收值。
TAME以2mmol/L 溶于0.15mol/L NaCI溶液中。
反应缓冲液为pH 7.2的磷酸盐缓冲液，其余反应步骤同强碱性类胰蛋白酶活性测定，最后在248 nm测定吸光值.
淀粉酶活性的测定: 主要按照3，5- 二硝基水杨酸法(张桂芬等，2008)进行，具体的操作步骤为: 1) 标准曲线的制作: 配制浓度为1．0 mg/mL
的麦芽糖标准溶液10 mL，测定时分别稀释至0.2，0.4,0.5,0.6, 0.7，0.8 和1.0 mg/mL。
依次取上述溶液10 μL 分别移入0．2 mL PCR 管，每管加入10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)，置沸水浴中煮沸5 min，冰浴冷却后加入蒸馏水80 μL。
以微量移液器取混合溶液90 μL 移入酶标板(美国Costor)，立即于490 nm 处读取OD 值，并确定OD值与麦芽糖含量之间的对应关系; 2) 样品酶液的测定: 取5 μL 浓度为1 % 的淀粉溶液移入0．2 mLPCR 管中，加入5 μL 待测样本酶液，混合均匀，于25℃温浴3 min 后加10 μL 显色剂(3，5- 二硝基水杨酸试剂)终止反应。
其他操作步骤及OD 值的测定方法同标
准曲线。
此时所测得的麦芽糖量为淀粉在淀粉酶的作用下所形成的麦芽糖。
淀粉酶活性以μg(麦芽糖) /mg pro·min 表示。
蛋白含量测定:参照Bradford(1976)考马斯亮蓝(G- 250)方法，采用3 mL 的反应体系。
对照缓冲液(pH 7.2)500 μL，考马斯亮蓝2．5 mL。
以牛血清白蛋白作标准曲线。
肪酶活性测定：依次加入p H 7.2 磷酸盐缓冲溶液 2.4 mL, 橄榄油1.0mL, 并于37水浴锅中磁力搅拌预热5 m in, 再加入中肠消化液0.16 mL, 磁力搅拌10min , 立即加入苯510 mL, 继续搅拌2 min ,终止反应,转移至离心管, 4 000 r min/L 离心10 m in ,取上层有机相4.0 mL于锥型瓶中, 加1.0 mL 显色剂( 5 % 醋酸铜溶液用吡啶调节至p H 6.1), 磁力搅拌3m in , 4000 r/m in- 1 离心10 m in , 取上层溶液于710 nm 处测定吸光度。
以pH 7.2磷酸缓冲溶液取代中肠消化液作为对照。
在上述实验条件下, 以每分钟水解橄榄油产生1 L/mol油酸所需的酶量定为1个酶活力单位。
每组设3个重复。