显微注射技术

细胞显微操作技术

XXX,YYY,ZZZ

一、目的要求：

1.练习针刺细胞（未受精卵、去卵核、早期胚胎细胞或体外培养细胞）。

2.练习微吸管制备。

3.掌握细胞显微移植技术（细胞核、外源基因）。

二、实验原理：

采用显微操作系统（倒置显微镜/体视显微镜+显微操作器）将供体物（基因、细胞核或细胞其他成分）直接注入宿主细胞（去核卵母细胞、胚胎细胞或体外培养的细胞）中，研究供体物的功能或者获得转基因动物的技术。

供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。

核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。

重编程有三种可能的结果：

（1）供核基因组完全没有进行重编程，重构胚很快死亡；

（2）部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡；

（3）完全重编程，产生正常的克隆动物。

外源基因导入（基因沉默、过表达、转基因动物）：

利用显微操作系统将外源目的基因（DNA或RNA）直接注入到受体细胞或受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，培养/筛选，获得转基因动物/性状分析。

显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。

显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。

三、实验材料与仪器：

实验材料：斑马鱼Danio sp.胚胎（一细胞期）

仪器和器材：

倒置显微镜（或解剖镜）

显微操作仪（油压或氮气压力）

拉针仪（水平拉针仪或垂直拉针仪）

胶头吸管、胶固定板。

主要试剂：酚红。

四、显微注射操作过程：

1.材料准备：

1.1注射针头的拉制：

水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉

成两个所需的微注射针头。

垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。

1.2注射针内装液：

【方法一】：使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品。

【方法二】：将玻璃毛细管固定在显微操作仪上，缓缓旋转油压泵，使油慢慢进入

毛细玻璃管中，直至毛细管尖端有少量油滴聚成小滴，用卫生纸的边缘

轻轻将油滴拭去，然后将毛细管的尖端小心的插入酚红染料液中，缓缓

回转油压泵，边观察毛细管中的燃料液面，边缓缓转动。到管中液面足

够时，稍待片刻，小心地拔出毛细管，装液完毕。

2.注射针安装和定位：

2.1将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定

到微操作仪的托针管上。

2.2把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上，用低倍物镜对准细胞调焦；

2.3移动针头并在显微镜下调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的中心上方；

2.4使用工作用放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。

3.显微注射：

3.1使针尖对准细胞的待注射部位（细胞与针尖在同一焦面上），旋转推进旋钮，针刺

入细胞内（卵膜、细胞膜、核膜）。

3.2旋转加样旋钮，将样本加入，并离开细胞。【如图显示：酚红已注入胚胎中。】

五、作业：

（一）、简述细胞显微注射过程以及注意事项。

[A]显微操作过程见实验操作步骤。

[B]显微注射操作注意事项：

1、使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用

硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，

从而引起针尖阻塞而影响注射。

2、针内注液方法二并不是严格的操作，以上操作只是针对本次实验简便而为。

3、操作过程中，注意避免将毛细管折断，并避免被毛细管扎伤。

4、在旋转油压泵时要轻、缓，避免油压过高，将毛细管冲出或造成其他危险。

5、要注意保持针头的清洁，以防针头堵塞。

（二）显微拍照注射前后的胚胎。

注射前的胚胎

注射后的胚胎

六、实验小结：

通过本次实验，我组同学们练习了玻璃毛细吸管的制备，并进一步练习和掌握了针刺细胞（斑马鱼早期胚胎细胞）的实验操作。在一定程度上掌握了细胞显微移植技术（外源基因），但总体上讲还需要练习，以便熟练掌握显微注射操作。