电镜样品基本制备技术之负染色技术
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电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
—、负染样品的制备 负染色所用的样品，全部取自悬浮液。 在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度 和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异 和清晰的结合反应。操作时，将带有样品 的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色 处理后即可进行电镜观察。其全部制备过 程分述于下。
第五章 电镜样品的基本制备
第二节 负染色技术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高 密度的、且在透射电镜下又显示结构的重 金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物 标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈 现阴性反差样品的微细结构。所以负染色 所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染 色相反，其样品结构为透明浅色，而背底 则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的 机制，目前还不够清楚。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（三）离心提纯法 用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或
细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。 先用低速离心（3000转／分），弃去较大 杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过 滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉 淀物制成悬液滴样染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
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Βιβλιοθήκη Baidu
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
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2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
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3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
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（二）直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（—）浓缩取样法 适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。 １．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒
和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将 病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟， 使病毒吸附于红细胞表面；
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
而后，以800转／分速度低速离心15分钟， 使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最 后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于 室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可 从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶 液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。
二、染液的配制 一般均由重金属盐配制。最常用的有磷 钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸 钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。 当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水 或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染 色前应用：
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１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
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（二）漂浮法 先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
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四、影响负染效果的有关因素 （—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
三、负染色操作方法 （—）滴染法 将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸 取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液 内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤 纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染 液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸 吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
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注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液 滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜 网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不 能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成 良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布 较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自 然稍干后再加染液。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
—、负染样品的制备 负染色所用的样品，全部取自悬浮液。 在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度 和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异 和清晰的结合反应。操作时，将带有样品 的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色 处理后即可进行电镜观察。其全部制备过 程分述于下。
第五章 电镜样品的基本制备
第二节 负染色技术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高 密度的、且在透射电镜下又显示结构的重 金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物 标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈 现阴性反差样品的微细结构。所以负染色 所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染 色相反，其样品结构为透明浅色，而背底 则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的 机制，目前还不够清楚。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
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（三）离心提纯法 用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或
细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。 先用低速离心（3000转／分），弃去较大 杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过 滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉 淀物制成悬液滴样染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
Βιβλιοθήκη Baidu
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（—）浓缩取样法 适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。 １．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒
和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将 病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟， 使病毒吸附于红细胞表面；
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
而后，以800转／分速度低速离心15分钟， 使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最 后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于 室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可 从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶 液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。
二、染液的配制 一般均由重金属盐配制。最常用的有磷 钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸 钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。 当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水 或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染 色前应用：
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）漂浮法 先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
四、影响负染效果的有关因素 （—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
三、负染色操作方法 （—）滴染法 将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸 取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液 内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤 纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染 液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸 吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液 滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜 网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不 能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成 良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布 较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自 然稍干后再加染液。