电镜样品基本制备技术之负染色技术
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透射电镜的样品制备技术
在光镜下选出所需观察的部位,在玻片反面用 笔做好标记.前固定、漂洗、后固定,脱水及浸 透同常规包埋方法,但各步骤时间可适当缩短. 在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂,将顶端
平整的废包埋块压在其上,于60 ℃聚合硬化.将 粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s,取
下包埋块修块,超薄切片及电子染色.
构不清
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好,结构细腻,无丢失. • 切片厚薄均匀,厚度在60-90nm之间.表面无
皱折、刀痕、震颤等缺陷. • 样品反差良好,无染色沉淀. • 支持膜厚度适中,观察时不产生漂移和破裂.
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合,来提高结构成分散射电子的 能力,从而增加图像反差的染色,又称为正染
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles 20 nm. 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles showing the protein halo around the labelled nanoparticles, 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织.以保证器官的血液供 给,避免缺血造成的组织损伤或自溶.
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下,
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液,直 至组织达到适当的硬度为宜.
灌流固定法
• 指通过血液循环途径,将固定液灌注 到组织器官内,进行固定后再取材的方法. 常用于对缺氧敏感,死后变化快的组织器 官,如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视 网膜和肾脏等.也可用于所取组织的种类 较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透 的组织器官.
平整的废包埋块压在其上,于60 ℃聚合硬化.将 粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s,取
下包埋块修块,超薄切片及电子染色.
构不清
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好,结构细腻,无丢失. • 切片厚薄均匀,厚度在60-90nm之间.表面无
皱折、刀痕、震颤等缺陷. • 样品反差良好,无染色沉淀. • 支持膜厚度适中,观察时不产生漂移和破裂.
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合,来提高结构成分散射电子的 能力,从而增加图像反差的染色,又称为正染
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles 20 nm. 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles showing the protein halo around the labelled nanoparticles, 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织.以保证器官的血液供 给,避免缺血造成的组织损伤或自溶.
• 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下,
边解剖边在取材的部位局部滴加固定液,直 至组织达到适当的硬度为宜.
灌流固定法
• 指通过血液循环途径,将固定液灌注 到组织器官内,进行固定后再取材的方法. 常用于对缺氧敏感,死后变化快的组织器 官,如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视 网膜和肾脏等.也可用于所取组织的种类 较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透 的组织器官.
负染色操作步骤-概述说明以及解释
负染色操作步骤-概述说明以及解释1. 引言概述部分的内容可以按如下方式编写：1.1 概述负染色是一种常用的细胞和组织样品处理技术，它常被应用于生物学和医学研究中，用于观察细胞和组织内部的结构和特征。
相比于传统的正染色方法，负染色操作具有一些独特的优势和特点。
在负染色过程中，样本被浸泡在一种特定的染料溶液中，这种染料溶液往往是一种与样品的成分不相溶的物质。
负染色的关键在于利用染料的物理和化学性质，使其与样品发生作用，从而使样品的细节和特征得以显示。
负染色的操作步骤相对简单，但需要一定的技巧和经验。
本文将详细介绍负染色的操作步骤要点，旨在帮助读者快速掌握负染色技术并正确应用于实验中。
负染色的具体步骤将在接下来的章节中进行介绍，主要包括：样品制备、染料选择、染色操作、观察和分析等环节。
通过正确的操作步骤，可以获得清晰、可靠的负染色结果，从而进一步推进相关研究领域的发展。
总之，负染色作为一种常用的细胞和组织样品处理技术，具有独特的优势和特点。
本文将深入介绍负染色的操作步骤要点，希望能够为读者提供一份实用的参考，帮助其在实验中正确应用负染色技术。
文章结构部分的内容应该是关于整篇文章的组织结构和章节安排的介绍。
可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行叙述：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 负染色操作步骤要点12.2 负染色操作步骤要点23. 结论3.1 总结3.2 展望在引言部分，我们将简要说明本文的主题和目的，以及为什么负染色操作步骤的了解对于某些特定应用领域的重要性。
接下来的正文部分将分为两个要点，分别介绍负染色操作的具体步骤，包括所需材料、实验条件等重要信息。
通过对每个步骤要点的详细描述，读者将能够理解负染色操作的基本原理和实施方法。
最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，回顾负染色操作的关键步骤和要点，并展望未来在该领域的进一步研究和应用方向。
通过以上的文章结构安排，读者将能够清晰地了解整篇文章的内容组织和章节间的逻辑关系，从而更好地理解和掌握负染色操作步骤的相关知识。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病ห้องสมุดไป่ตู้一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
负染色技术1
异常反差原理： 异常反差原理：
用PTA 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂晶体发生 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂 了异常反差。在电镜下观察时发现， 了异常反差。在电镜下观察时发现，在同一视野内凡 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 是被 PTA 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 的晶体， 染色的氧化鎂 的晶体，未被 PTA 染色的氧化鎂晶体则呈现不透明 暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA PTA在电 的（暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA在电 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场， 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场，它 起到一个“静电小透镜”的作用， 起到一个“静电小透镜”的作用，把电子聚焦于样品 使样品中的电流密度得到加强， 上，使样品中的电流密度得到加强，结果样品图象的 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。
(五).注意的问题 五 注意的问题
1).悬液样品的纯度 悬液样品的纯度 2).悬液样品的浓度 悬液样品的浓度 3).样品和染液的均匀分布问题 样品和染液的均匀分布问题 • 使用分散剂 • 亲水性处理 4).样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度问题 5).染色的时机 染色的时机
负染色剂及其适用的PH范围
负染色剂 磷钨酸钾 醋酸铀 甲酸铀 钼酸铵 钨酸锂 硼酸钨钠 浓度 % 2 0.1~1 0.5~1 2.0~3 2 2 PH范围 PH范围 6.0—7.0 4.0—5.2 4.0—5.2 7.0—7.4 6.0—7.5 5.5—7.0 醋酸氨 醋酸氨
样品缓冲液
醋酸氨
•
负染色可观察样品的范围：um~nm 负染色可观察样品的范围 球状 7 nm 链状 直径 2 nm
电镜样品基本制备方法第二节负染色技术
（四）样品的均匀分散性 在进行负染时，经 常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂 与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清 样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是 悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现 象。
电镜样品的基本制备方法
第二节 负染色技术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度 的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如 磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在 黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结 构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄 切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制， 目前还不够清楚。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把 带滤纸吸干铜网上的多余悬液， 再将铜网在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最 后再用滤纸将染液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的悬液将 要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬 液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色 效果，便得不到理想的负染电镜图像。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀 浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离 心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎 片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温 超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸 （PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、 醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷 钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5 ％～3％的溶液，染色前应用：
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及 疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再 将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍 干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊 断．
负染色技术1
电镜观察时的技巧: 电镜观察时的技巧: 1. 全体像的观察 2. 人工假象的判断 3. 负染色的程度与效果 像漂移、电子损伤、聚焦、 4. 像漂移、电子损伤、聚焦、照像
(五).注意的问题 五 注意的问题
1).悬液样品的纯度 悬液样品的纯度 2).悬液样品的浓度 悬液样品的浓度 3).样品和染液的均匀分布问题 样品和染液的均匀分布问题 • 使用分散剂 • 亲水性处理 4).样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度问题 5).染色的时机 染色的时机
负染色技术的特点
负染色技术快速简易、分辨率高（可达20 20Ă 负染色技术快速简易、分辨率高（可达20Ă）。
目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、亚 目前广泛用于生物大分子、细菌、原生动物、 细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察， 细胞碎片、分离的细胞器、蛋白晶体的观察，尤 其是病原的快速鉴定及其结构研究所必不可少的 一项技术。 一项技术。
（一）.负染色的原理 （二）.负染色样品的制备 （三）.负染色液 （四）.负染的操作方法 (五) 负染色中应该注意的问题
负染色技术操作简单，但其原理至今 负染色技术操作简单， 尚不完全清楚。可以归纳为以下两种 尚不完全清楚。 成像原理。 成像原理。
负染色技术的原理
密度反差原理： 密度反差原理： 不同原子序数的元素组成的物质具有不同的密度，电 不同原子序数的元素组成的物质具有不同的密度， 子束通过原子序数高的元素时， 子束通过原子序数高的元素时，与其中电子和原子核碰 撞到机率较高，容易发生散射而形成负反差。 撞到机率较高，容易发生散射而形成负反差。一般认为 任何物体假如被密度比本身大2 任何物体假如被密度比本身大2倍以上的物质所包围或 浸没时， 浸没时，在电子显微镜下反差就能得到加强而形成负反 以生物样品的密度为1 而磷钨酸（PTA） 差。以生物样品的密度为1，而磷钨酸（PTA）的密度为 故染色后形成负反差像。 4，故染色后形成负反差像。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术优秀课件
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更 为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效 果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的 酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到 病毒的结构。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
第六章 负染色技术newC
生物电子显微技术
粘 液 病 毒 － － 流 感 病 毒
生物电子显微技术
SARS病毒负染色 /upload/html/2003042818412/feidian3.htm
生物电子显微技术
1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观 察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类 病毒为冠状病毒。1975年国家病毒命名委员会正式命名了冠状病毒 科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分 为冠状病毒和环曲病毒两个属。
生物电子显微技术
染料
样品
铜 网
负染ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原理图
二、负染色的特点
1. 优点：
生物电子显微技术
⑴ 提高了样品的分辨率和反差高。
分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径
约D=7Å时，＝10～15Å，最高＝5～7Å。
⑵ 常用、简易、快速、不要求高纯度的样品
制备技术，且用量少
⑶ 不改变生物活性，即不因染色造成样品变
生物电子显微技术
生物电子显微技术
生物电子显微技术
番茄黑环病毒
生物电子显微技术
病毒荚膜：未处理
生物电子显微技术
病毒荚膜：负染色
生物电子显微技术
病毒荚膜：旋转投影
生物电子显微技术
病毒荚膜：金属投影
生物电子显微技术
人类腺病毒在人胚肾 细胞核内的晶格排列
生物电子显微技术
腺 病 毒 负 染 色
形。
生物电子显微技术
2. 缺点：
⑴ 负染原理不清楚，结果不稳定，规律
性、重复性差。
(操作时，因样品的种类、染色液浓
度、pH值变化常难以掌握。) ⑵ 负染色技术只能观察样品表面形貌， 内部结构看不清楚。
透射电镜的样品制备技术
保存抗原性物质，多用于免疫电镜技术 中
缺点
高浓度时可使组织结构流失，多不单独 使用
用常于配用制缓固冲定液液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。
的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细
胞的超微结构遭受破坏
方法
物理方法 快速冷冻法 干燥法
化学方法 浸泡固定法 原位固定法 灌流固定法
常用固定剂
戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
无色透明液体，pH=4，使用浓度为2.5～4％，使用温度 4℃。
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
缺点
分子量大，穿透能力差 对碳水化合物和酶固定效果不好 固定时间较长易引起组织变脆 有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 光热作用时易发生变化
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
白色粉末，使用浓度为4％ 优点
对组织的浸透力强
体外培养细胞的固定 单层细胞固定 悬浮细胞固定
加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。 离心。
三.脱 水
目的
将组织内部游离的水分脱净，有利于浸 透和包埋
常用脱水剂
乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
性差
丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
脱水步骤
从低浓度至高浓度系列脱水
50% 酒精 4℃ 10～15min 70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 80% 酒精 室温 10～15min 90% 酒精 室温 10～15min 95% 酒精 室温 10～15min 95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min 95%丙酮 室温 10～15min 无水丙酮 室温 40min 中间换一次
缺点
高浓度时可使组织结构流失，多不单独 使用
用常于配用制缓固冲定液液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。
的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细
胞的超微结构遭受破坏
方法
物理方法 快速冷冻法 干燥法
化学方法 浸泡固定法 原位固定法 灌流固定法
常用固定剂
戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
无色透明液体，pH=4，使用浓度为2.5～4％，使用温度 4℃。
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
缺点
分子量大，穿透能力差 对碳水化合物和酶固定效果不好 固定时间较长易引起组织变脆 有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 光热作用时易发生变化
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
白色粉末，使用浓度为4％ 优点
对组织的浸透力强
体外培养细胞的固定 单层细胞固定 悬浮细胞固定
加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。 离心。
三.脱 水
目的
将组织内部游离的水分脱净，有利于浸 透和包埋
常用脱水剂
乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
性差
丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
脱水步骤
从低浓度至高浓度系列脱水
50% 酒精 4℃ 10～15min 70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 80% 酒精 室温 10～15min 90% 酒精 室温 10～15min 95% 酒精 室温 10～15min 95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min 95%丙酮 室温 10～15min 无水丙酮 室温 40min 中间换一次
电镜样品的基本制备技术之负染色技术PPT课件
活性保护
对于具有生物活性的样品，负染色技 术需要在保持样品活性的前提下进行。 因此，需要在制备过程中采取适当的 措施，如使用稳定剂或保护剂，以保 持样品的生物活性。
涂膜的均匀性与稳定性
均匀性
在负染色技术中，涂膜的均匀性对电镜观察效果至关重要。涂膜应均匀覆盖样品表面， 避免出现涂层不均、颗粒等现象。为保证涂膜的均匀性，可采用旋转涂膜、多次涂覆等
浓度控制
染色液的浓度对染色效果和样品稳定性有重要影响。在负染色技术中，应精确控制染色液的浓度，以 确保染色效果最佳且不损伤样品。同时，还应根据实际情况调整染色液的浓度，以获得最佳的观察效 果。
观察条件的选择与优化
观察条件
负染色技术的观察条件包括电镜的加速电压、工作距离、物镜光圈等参数。这些参数的选择直接影响观察效果和 样品的成像质量。在观察过程中，应根据样品的性质和特点选择适当的观察条件，并进行优化调整。
应用领域与优势
应用领域
负染色技术广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域，如病毒、细菌、细胞、 蛋白质等生物大分子的结构和形态研究。
优势
负染色技术具有操作简便、分辨率高、样品制备时间短等优点，能够清晰地呈 现出样品的形态和结构，为科学研究提供重要的实验依据。
02
负染色技术的基本步骤
样品准备
选取适当的样品
细菌和微生物研究
在细菌和其他微生物的研究中，负染色技术也发挥了重要作用。通过负
染色，可以观察细菌的形态、排列和细胞壁等结构特征，有助于细菌鉴
定和分类。
03
蛋白质和核酸研究
负染色技术也可用于观察蛋白质和核酸等生物大分子的结构和形态。通
过负染色，可以观察到大分子的形状、大小和分布情况，有助于理解其
功能和作用机制。
对于具有生物活性的样品，负染色技 术需要在保持样品活性的前提下进行。 因此，需要在制备过程中采取适当的 措施，如使用稳定剂或保护剂，以保 持样品的生物活性。
涂膜的均匀性与稳定性
均匀性
在负染色技术中，涂膜的均匀性对电镜观察效果至关重要。涂膜应均匀覆盖样品表面， 避免出现涂层不均、颗粒等现象。为保证涂膜的均匀性，可采用旋转涂膜、多次涂覆等
浓度控制
染色液的浓度对染色效果和样品稳定性有重要影响。在负染色技术中，应精确控制染色液的浓度，以 确保染色效果最佳且不损伤样品。同时，还应根据实际情况调整染色液的浓度，以获得最佳的观察效 果。
观察条件的选择与优化
观察条件
负染色技术的观察条件包括电镜的加速电压、工作距离、物镜光圈等参数。这些参数的选择直接影响观察效果和 样品的成像质量。在观察过程中，应根据样品的性质和特点选择适当的观察条件，并进行优化调整。
应用领域与优势
应用领域
负染色技术广泛应用于生物学、医学、环境科学等领域，如病毒、细菌、细胞、 蛋白质等生物大分子的结构和形态研究。
优势
负染色技术具有操作简便、分辨率高、样品制备时间短等优点，能够清晰地呈 现出样品的形态和结构，为科学研究提供重要的实验依据。
02
负染色技术的基本步骤
样品准备
选取适当的样品
细菌和微生物研究
在细菌和其他微生物的研究中，负染色技术也发挥了重要作用。通过负
染色，可以观察细菌的形态、排列和细胞壁等结构特征，有助于细菌鉴
定和分类。
03
蛋白质和核酸研究
负染色技术也可用于观察蛋白质和核酸等生物大分子的结构和形态。通
过负染色，可以观察到大分子的形状、大小和分布情况，有助于理解其
功能和作用机制。
透射电镜常规样品制备流程(精)
透射电镜样品制备流程由于透射电镜能观察的样品必须很薄（60～70nm），所以透射电镜的样品准备要求很严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：一．负染色技术负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。
样品要求：①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。
操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下：1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。
要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。
电子显微镜的制样
⑶超薄切片技术
• 基本操作步骤：取样→固定→脱水→浸透 基本操作步骤：取样→固定→脱水→
与包埋→切片→捞片→染色→ 与包埋→切片→捞片→染色→观察
二、扫描电镜的样品制备 二、扫描电镜的样品制备
• 扫描电镜的结构特点：利用电子束作光栅 扫描电镜的结构特点：
状扫描以获取样品的形貌信息。 状扫描以获取样品的形貌信息。 • 对样品的要求：干燥并且表面能够导电。 对样品的要求：干燥并且表面能够导电。 • 在观察的过程要保持样品不变形，其关键 在观察的过程要保持样品不变形， 是样品干燥； 是样品干燥； • 干燥的方法：自然干燥、真空干燥、冷冻 干燥的方法：自然干燥、真空干燥、 干燥和临界点干燥| 其效果最好） 干燥和临界点干燥|（其效果最好）等。 • 干燥、喷镀金属层后的样品便可用与观察。 干燥、喷镀金属层后的样品便可用与观察。
电子显微镜的制样
• 一、透射电镜的样品制备 • ⑴负染技术 • 含义：与将样品本身染色来提高反差的方法相反，负染色 含义：与将样品本身染色来提高反差的方法相反， • •
技术是用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反 技术是用电子密度高， 应的物质来对样品进行染色。 应的物质来对品进行染色。 优点：简便易行，病毒、细菌、 优点：简便易行，病毒、细菌、离体细胞奇迹蛋白质和核 酸等生物大分子的形态大小和表面结构都可以采用这种制 样方法进行观察。 样方法进行观察。 操作方法:把样品和重金属染料混合后滴加支持膜上， 操作方法:把样品和重金属染料混合后滴加支持膜上，也 可将样品用贴印或喷雾的方法加到载网上后再用染料进行 染色。 染色。
谢谢观赏！
⑵投影技术
• 含义：在真空蒸发设备中将铂或铬等对电 含义：
子散射能力较强的金属原子， 子散射能力较强的金属原子，由样品的斜 上方进行喷镀，提高样品的反差。 上方进行喷镀，提高样品的反差。 • 特点：病毒、细菌鞭毛、生物大分子等微 特点：病毒、细菌鞭毛、 小颗粒的形态大小和表面结构都可以采用 这种方法进行观察。 这种方法进行观察。
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电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（三）离心提纯法 用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或
细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。 先用低速离心（3000转／分），弃去较大 杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过 滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉 淀物制成悬液滴样染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
三、负染色操作方法 （—）滴染法 将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸 取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液 内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤 纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染 液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸 吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液 滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜 网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不 能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成 良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布 较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自 然稍干后再加染液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
—、负染样品的制备 负染色所用的样品，全部取自悬浮液。 在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度 和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异 和清晰的结合反应。操作时，将带有样品 的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色 处理后即可进行电镜观察。其全部制备过 程分述于下。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（—）浓缩取样法 适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。 １．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒
和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将 病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟， 使病毒吸附于红细胞表面；
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
而后，以800转／分速度低速离心15分钟， 使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最 后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于 室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可 从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶 液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。
第五章 电镜样品的基本制备
第二节 负染色技术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高 密度的、且在透射电镜下又显示结构的重 金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物 标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈 现阴性反差样品的微细结构。所以负染色 所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染 色相反，其样品结构为透明浅色，而背底 则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的 机制，目前还不够清楚。
二、染液的配制 一般均由重金属盐配制。最常用的有磷 钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸 钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。 当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水 或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染 色前应用：
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）漂浮法 先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
四、影响负染效果的有关因素 （—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（三）离心提纯法 用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或
细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。 先用低速离心（3000转／分），弃去较大 杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过 滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉 淀物制成悬液滴样染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）直接取样法 对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
三、负染色操作方法 （—）滴染法 将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸 取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液 内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤 纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染 液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸 吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液 滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜 网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不 能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成 良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布 较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自 然稍干后再加染液。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
—、负染样品的制备 负染色所用的样品，全部取自悬浮液。 在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度 和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异 和清晰的结合反应。操作时，将带有样品 的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色 处理后即可进行电镜观察。其全部制备过 程分述于下。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（—）浓缩取样法 适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。 １．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒
和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将 病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟， 使病毒吸附于红细胞表面；
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
而后，以800转／分速度低速离心15分钟， 使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最 后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于 室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可 从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶 液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。
第五章 电镜样品的基本制备
第二节 负染色技术
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
负染色又称阴性反差染色，它是利用高 密度的、且在透射电镜下又显示结构的重 金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物 标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈 现阴性反差样品的微细结构。所以负染色 所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染 色相反，其样品结构为透明浅色，而背底 则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的 机制，目前还不够清楚。
二、染液的配制 一般均由重金属盐配制。最常用的有磷 钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸 钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。 当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水 或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染 色前应用：
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
（二）漂浮法 先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
电镜样品基本制备技术之负染色技 术
四、影响负染效果的有关因素 （—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。