氩氦刀冷冻治疗对机体免疫反应影响的研究进展

ＤＯＩ：１０畅３８７７ ／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４唱０７８５．２０１２．０５．０４２ 作者单位： １０００２８ 北京，煤炭总医院呼吸内科 通讯作者： 王洪武，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｈBiblioteka ｎｇｗｕ２００８＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
板聚集及血流淤滞形成冰晶及微血栓，对于肿瘤及肿瘤周围病 灶有明显治疗作用［１０］ 。 （３） 热池效应：即在较粗的血管（ 直径 ＞ ４ ｍｍ）中正常的血液仍在不停地流动，所以不会损伤血管［１１］ ，使 靠近大血管的肿瘤根治成为可能。 （４）凋亡效应：在冷冻的周边 地带，低温不足以杀死肿瘤细胞，但肿瘤细胞表达凋亡信号，引 起细胞凋亡［９］ 。 （５） 抗肿瘤免疫作用［１２］ ：一些研究［１３］ 认为冷冻 坏死的肿瘤细胞可致敏树突状细胞（ ＤＣ），激活 Ｔ 淋巴细胞，刺 激机体产生冷冻免疫抗体，即超低温诱导的免疫反应，同时具有 增强残存的肿瘤细胞对放化疗的敏感性。
中华临床医师杂志（ 电子版）２０１２ 年 ３ 月第 ６ 卷第 ５ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ １，２０１２，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５
· １２６３·
血液循环，无法刺激免疫增强。 Ｋａｗａｎｏ 等［２２］ 研究小鼠骨肉瘤模 型，肿瘤经冷冻处理，其肿瘤裂解物与 ＤＣ 体外共同培养，ＤＣ 与 冷冻处理的肿瘤共同植入小鼠体内其抗肿瘤作用明显高于单独 植入冷冻肿瘤细胞或 ＤＣ，提示经肿瘤裂解物致敏的 ＤＣ 与冷冻 后肿瘤细胞有协同抗肿瘤作用，细胞因子 ＩＦＮ唱γ和 ＩＬ唱１２ 可促进 ＤＣ 激活 ＣＤ８ ＋Ｔ 细胞，发挥肿瘤特异性免疫反应，认为 ＤＣ 在没 有足够肿瘤抗原刺激的情况下，抗原提呈能力明显降低，抗肿瘤 作用亦不明显。
随着现代 免 疫 学 检 测 技 术 应 用， 有 关 黑 色 素 瘤［２３］ 、 结 肠 癌［２４］ 、乳腺癌［２５］ 的动物实验表明，冷冻消融可促进淋巴细胞肿 瘤特异性 ＩＦＮ 分泌、提高 ＮＫ 细胞、ＣＴＬ 的特异性杀伤活性等，从 而诱导肿瘤特异性免疫反应，但对转移瘤或再种植肿瘤的抑制 作用较弱。 段蕴铀等［２６唱２７］ 研究发现经氩氦刀冻融的肿瘤细胞可 作为肿瘤全细胞抗原致敏 ＤＣ，激发特异性抗瘤免疫。 王志明 等［２８］ 利用氩氦刀冷冻治疗动物肿瘤实验结果也表明，氩氦刀具 有减少肿瘤转移，提高自然杀伤细胞水平、ＣＤ４ ／ＣＤ８ 比值的作 用。 郑晓寰等［２９］ 将 ２５ 只荷瘤兔随机分成两组：冷冻治疗组和对 照组，氩氦刀冷冻治疗肝癌可促进凝固性坏死灶周围组织的细 胞免疫反应。 Ｂａｇｌｅｙ 等报道用冷冻处理的肿瘤细胞可以诱导特 异性的 Ｔ 淋巴细胞。 由氩氦刀冷冻肺癌细胞制备的肿瘤粗抗 原，可有效地激发 ＤＣ 的活性和功能，表现为促进淋巴细胞的活 化增殖、细胞因子分泌，抗肿瘤免疫反应等。
· １２６２·
中华临床医师杂志（ 电子版）２０１２ 年 ３ 月第 ６ 卷第 ５ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ １，２０１２，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５
· 综述·
氩氦刀冷冻治疗对机体免疫反应影响的研究进展
彭丹 王洪武
目前，恶性肿瘤的治疗仍以手术治疗为主，但因许多患者确 诊时已属中晚期，肿瘤负荷大，病灶多，分布于多个部位，或者因 为患者合并有严重心、肺功能不全无法承受手术，因而使大部分 晚期肿瘤患者入院时已失去了常规手术根治切除的机会［１唱２］ 。 对于晚期肿瘤患者只能依赖姑息性非手术治疗，治疗手段包括： 放疗、化疗、免疫治疗、中药治疗、局部物理治疗等。 在众多的局 部物理治疗手段中，氩氦靶向治疗技术疗效明显，创伤小，同时 还引起机体免疫反应，在治疗实体肿瘤方面越来越显出其优势。 但目前实验及临床研究表明，冷冻治疗后引起免疫增强的同时 也会引起免疫抑制，本文就氩氦刀冷冻治疗引起机体免疫反应 及其机制做一综述。
三、氩氦刀治疗肿瘤的免疫调节作用 最早在 ２０ 世纪 ６０ 年代 Ｓｈｕｌｍａｎ 等［１４唱１５］ 首先证实了冷冻免 疫存在，随后 Ｓｏａｎｅｓ 等［１６］ 报道前列腺癌冷冻治疗后肺转移瘤缩 小，还发现兔的前列腺经多次冷冻后，在其血中可发现前列腺的 特异性抗体，并提出冷冻免疫反应的概念。 冷冻免疫反应是指 冷冻消融后肿瘤坏死释放肿瘤抗原，刺激体内免疫系统产生抗 肿瘤免疫反应，有利于清除体内残留癌细胞。 直到今天，更多的 方法揭示冷冻免疫反应的存在，其中在动物肿瘤模型上对原发 肿瘤行氩氦刀冷冻治疗，随后在适当的时间再次给动物接种肿 瘤，发现肿瘤不再生长。 Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ 等［１７］ 也发现在他们的动物模 型中冷冻治疗确实引起免疫反应，它可以减少再接种肿瘤生长， 甚至可以消除再接种肿瘤，但一个有趣的发现是，当冷冻组织留 在体内时会引起免疫抑制，这些结果显示存在一个起始的抗原 刺激，过多的抗原有可能促进免疫抑制。 １．氩氦刀治疗后免疫增强作用：随着免疫检测技术的发展， 氩氦刀治疗后引起机体免疫反应的机制越来越多地被揭示，氩 氦刀治疗后的数小时至数天内可发现炎症反应的存在，３ ｄ 内淋 巴细胞聚集在肿瘤组织周围，而巨噬细胞的数量在 ７ ｄ 内达到高 峰，一直持续 １５ ｄ 左右。 经氩氦刀处理过的肿瘤可释放肿瘤抗 原刺激 Ｂ 细胞，使 Ｂ 细胞产生具有专一性的抗体，抗原抗体结合 产生体液免疫反应。 Ｔｓｕｊｉｎｏ 等发现冷冻局部可出现淋巴细胞浸 润和免疫球蛋白抗体表达。 Ｈｏｆｆｍａｎｎ［１８］ 以小鼠血管紧张素前列 腺肿瘤为模型，发现冷冻术后肿瘤的特异性抗体效价升高，但冷 冻对机体的影响仅限于细胞及血管的变化，并不能明显抑制远 处肿瘤转移的增殖。 氩氦刀冷冻治疗可诱发特异性免疫，效应细胞主要是巨噬 细胞和自然杀伤细胞。 而功能最强的专职抗原提呈细胞 ＤＣ 是 机体特异性免疫应答的重要启动和调节因素，ｄｅｎ Ｂｒｏｋ 等［１９］ 在 小鼠肿瘤模型中用铟标记相关蛋白，氩氦刀治疗组与非氩氦刀 治疗组相比，示踪蛋白大多被 ＤＣ 摄取，经肿瘤抗原致敏的 ＤＣ 可通过细胞毒性 Ｔ 淋巴细胞（ ＣＴＬ） 有效激发特异性抗肿瘤免 疫［２０］ 。 Ｂａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ 等［２１］ 的临床研究表明，转移性肝癌经氩氦 刀冷冻治疗与手术治疗及射频消融相比，抗肿瘤相关性神经节 苷脂抗体明显增加，同时还发现氩氦刀治疗后引起的肿瘤坏死 不仅仅是释放上述抗体入血，还作为体液免疫的抗原，持续缓慢 释放入血，理论上可以有效诱发肿瘤特异性免疫反应，而射频消 融由于高温导致细胞膜融解和蛋白变性，没有肿瘤抗原释放到
瘤抗原的吸收导致 ＣＤ４ ＋ＣＤ２５ ＋抑制性 Ｔ 淋巴细胞活性增强，产 生免疫抑制。
四、氩氦刀联合免疫治疗的相关研究 随着冷冻免疫反应的研究不断深入，氩氦刀联合免疫治疗 模式随即被提出，即在氩氦刀治疗原发肿瘤的同时联合免疫调 节剂增强冷冻免疫反应，达到有效控制肿瘤复发和转移的目的。 肿瘤细胞冻融后的产物，作为特异性抗原致敏机体的 ＤＣｓ，通过 刺激 Ｔ 细胞发挥 ＣＴＬ 效应诱导凋亡［１９，２４］ 。 这种凋亡效应则可 能发生在通过血液循环而能够到达的全身，从而作为消灭机体 残余病灶的重要手段。 氩氦刀治疗所诱导的全身的特异性免 疫，优于引起免疫功能低下的全身性放化疗，它可以保留机体自 身免疫机能，进一步激活免疫，因此是一种祛邪兼扶正的治疗。 一些动物实验［３３唱３４］ 将接种前列腺癌肿瘤细胞的小鼠分为两组， 一组给予氩氦刀除处理，另一组在氩氦刀处理前给予肿瘤坏死 因子预处理，通过影像学、组织学、免疫组织化学等方法评估氩 氦刀治疗后局部冰球及随后的生物学效应，结果显示肿瘤坏死 因子预处理可加强对肿瘤细胞的破坏，同时促进炎症反应及淋 巴细胞的聚集，明显增强氩氦刀抗肿瘤作用。 Ｕｄａｇａｗａ 等［２４］ 发 展了一种有效的免疫治疗方法，他们在建立了 ＢＡＬＢ ／ｃ 小鼠肿瘤 模型后，先用卡介苗细胞壁骨架刺激培养小鼠的树突状细胞，然 后冷冻消融肿瘤，随即在冷冻消融的肿瘤原位注射入培养的树 突状细胞，结果表明对于冷冻消融的肿瘤和远处肿瘤均有明显 治疗作用。 Ｔｓｕｊｉｎｏ 等［３５］ 对非小细胞肺癌的患者手术后进行自 体 ＤＣ 疫苗的回输，能有效提高患者的各项免疫指标（ Ｔ 细胞亚 群：ＣＤ４ ＋、ＣＤ８ ＋，自然杀伤细胞的水平和细胞因子：ＴＮＦ、干扰 素、ＩＬ唱２、ＩＬ唱１２）。 进一步实验研究表明，冷冻联合瘤内注射促 ＤＣ 活化免疫调节剂（ ＣｐＧ唱ＯＮＤｍｌ 或 Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ２１１ ） 也可明显提 高冷冻消融诱导的抗肿瘤特异性免疫反应，有效抑制转移瘤的 发生。 五、总结 综上所述，氩氦刀作为一种新兴的治疗方式，其适用范围越 来越广，目前已广泛地应用在前列腺癌、肺癌、肝癌、肾癌等实体 瘤，能够减轻肿瘤负荷、减少肿瘤产生的免疫抑制因子，术后应 激反应轻、机体免疫抑制小，坏死的原位肿瘤抗原释放后能够刺 激机体免疫功能。 目前研究多集中在动物实验，部分动物实验 表明氩氦刀联合抗肿瘤疫苗应用在治疗肿瘤方面取得良好成 绩，但仍需大规模临床试验证实。 如果氩氦刀联合 ＣＩＫ 过继免 疫治疗或树突状疫苗等免疫治疗方法能应用于临床，将会在中 晚期肿瘤的临床治疗方面开辟新的局面。
另一方面氩氦刀治疗后的免疫反应很大程度上依赖细胞因 子的释放。 其来源主要有两方面，冷冻治疗的组织本身；冷冻时 的肿瘤细胞，间质细胞，免疫细胞等。 ＤＣ 能够分泌多种诱导不 同类型免疫细胞分化的细胞因子如 ＩＬ唱１２，ＩＬ唱１，ＩＬ唱６［３０唱３１］ ，其中 ＩＬ唱１２ 调节特异性和非特异性的免疫反应，能够促进未致敏的 ＣＤ４ ＋Ｔ 淋巴细胞分化成 Ｔｈ１ 细胞；还可以诱导自然杀伤细胞、 ＮＫＴ 细胞和 ＣＴＬ 增生，并增强其细胞毒性和分泌毒性介质的能 力。 冷冻时可使细胞膜破坏，细胞内蛋白释放出来，包括细胞因 子。 当冷冻较大肿瘤时，偶尔会发生冷冻休克，引起弥散性血管 内凝血和多器官功能衰竭。 研究认为冷冻休克是由于大量细胞 因子释放入血，氩氦刀治疗较大肝转移癌后 ＩＬ唱１β，ＩＬ唱６，ＴＮＦ唱α 血清水平明显升高。 虽然冷冻休克很少出现，但其与冷冻区域 大小密切相关。 当冷冻区域较小时，细胞因子的释放可促进淋 巴细胞是增生和抗原提呈细胞的成熟，从而促进免疫反应。
一、氩氦刀治疗的临床应用 氩氦刀以其极低的温度破坏肿瘤组织，冷冻治疗并不是一 种新的手段，早在十九世纪中叶，Ｋｏｒｐａｎ［３］ 在治疗进展期的乳腺 癌时利用冰盐水麻醉，同时发现低温对肿瘤细胞有很好的杀伤 作用，从此开始了利用低温冷冻治疗表浅肿瘤的历史，随着氩氦 刀技术的发展，冷冻治疗由最初局限于皮肤表浅部位疾病开始 应用于深部组织病变，其中最早应用冷冻治疗的实体性肿瘤是 前列腺癌。 王洪武等［４］ 在 ＣＴ 引导下经皮穿刺氩氦靶向治疗肺 癌，治疗 ２７８ 次，治疗病灶 ３０７ 个，治疗后并发症较少且较轻，近 期消融效果与肿瘤大小及部位有关。 此外王洪武［５］ 将氩氦刀应 用于转移性骨 肿 瘤， 能 迅 速 缓 解 疼 痛， 疼 痛 评 分 明 显 降 低， ＫＰＳ 评分明显提高，止痛药物也明显减少，取得了非常满意的疗效。 随着时间的推移，冻融破坏的骨质还可能发生钙化，减少病理性 骨折的发生。 目前氩氦刀广泛应用于各脏器的实体肿瘤，它可 对多种良恶性实体肿瘤施行精确冷冻切除，特别在脑胶质瘤、肝 癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾肿瘤、乳腺癌等治疗领域取得了 突破性的进展。 二、氩氦刀抗肿瘤机制 大量体内外实验研究［６］ 试图揭示低温冷冻引起组织损伤的 机制，Ｋｏｒｐａｎ 等［７唱８］ 实验动物胰腺组织给予低温冷冻，在电子显 微镜下观察胰腺组织发现胰腺外分泌细胞超微结构改变，血管 毛细血管的改变和微循环淤滞提示血管生成抑制，并且合并冷 冻坏死及冷冻凋亡。 目前一致认同的氩氦刀治疗肿瘤的机制有 如下几个方面：（１） 溶解效应：靠近冷冻探头的区域 冷 冻速 度 很 快，可迅速在细胞内形成冰晶，这是引起细胞膜破裂致肿瘤细胞 死亡的主要原因。 然而在离冷冻探头较远的区域，冷冻速度明 显下降，细胞内液由于类脂膜的保护不能被冷冻，只有细胞间液 可被冷冻，由此导致细胞外渗透压降低，细胞内液向细胞间质流 动，引起细胞脱水。 当高压氦气快速复温时，胞外冰晶融化，胞 内仍处于高渗状态，大量水分透过破坏的磷脂膜进入到胞内致 使细胞破裂［９］ 。 （２）微血栓形成：当靶区溶化后微小血管内血小