RNA建库流程 ppt课件
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
第36章 RNAppt课件
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1.类型I自我拼接
研究四膜虫rRNA前体拼 接过程中发现，此类拼 接无需蛋白质的酶参与 作用，它可自我催化完 成。
26S rRNA的基因中有一 个内含子，此拼接过程 只需要1价和2价阳离子 以及鸟苷酸(或鸟苷)存 在即能自发进行。拼接 实际上是磷酸酯的转移 反应。
第 36 章 RNA的生物合成和加工
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转录 DNA指导下的RNA合成
RNA的合成
复制 RNA指导下的RNA合成 （主要针对一些病毒RNA）
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一、DNA指导下的RNA合成
（一）DNA指导的RNA聚合酶
1. RNA链的合成方向也是5’一3’ 2. 4种NTP（ATCU）合成RNA，镁离子能促进
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2. 类型Ⅱ自我拼接
内含子靠近3’ 端有一保守序 列CUGAC，其 上A的2’-OH可 与末端5’-P形 成磷酸酯键。
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3. 核mRNA的拼接体的拼接
这些内含子的左端(5’端)均为GT，右端(3’端)均为 AG，此称为GT—AG规则(对应于RNA为GU—AG)。此 规则不适合于线粒体和叶绿体基因的内含子，也
上，在SLl因子介导下RNA聚合酶I结合在转录起点上并开始
转录。
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II 类启动子
基本启动子 起始子
上游元件
应答元件
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基本启动子
TATA框
基本启动子序列中心在-25至-30左右的7bp保守
区，功能：与RNA聚合酶的定位有关，DNA双链在 此解开并决定转录的起点位置。
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RNA基本操作技术ppt课件
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2、RNA的浓度
OD260 值 =1 ， 相 当 于 单 链 DNA 或 RNA 为 40μg/mL，寡核苷酸为20μg/mL。
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3、RNA的完整性
rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度 接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加 0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟， 12000g离心10分钟
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例 加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟， 注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然 后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分 钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并 保存于-70℃
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RNA的纯度、浓度与完整性
1、RNA的纯度
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.8-2.0 之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
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基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技术 ppt课件
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
• 乙醇：主要目的是：沉淀+除盐；洗涤异丙醇，也可以溶解一部分
蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA浓度和纯度的测定
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，因为酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰在 280nm附近，而大多数蛋白含有酪氨酸和色氨酸残基，且含量相对恒定。 盐和小分子则集中在230nm处， 320nm或340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0。
“Measure”
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA提取常见问题及分析
得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 28S的亮度是18S的2倍左右 • rRNA占总RNA80%以上。
5lRNA+1ul loading buffer，100V电泳10分钟
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
《RNA生物合成》PPT课件
真核RNA需 要加工
rRNA tRNA mRNA
5’加 在转录过
帽 3’加
程中
剪尾接 转录后进行
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第三节 真核生物转录后的加工
• 意义：转录生成的前体RNA,无生物学活性, 需加工变为成熟、有活性的RNA
• 加工种类：剪切与剪接、末端添加核苷酸、 修饰、RNA编辑
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一、mRNA前体的加工
被切断
加尾信号
GC丰富序列
AATAA----- GTGTGT
A AAUAA
G GUGUGU
A
G
酶切
AATAA----- GTGTGT
A AAUAA A
G
GUGUGU
G
酶切 (继续转录，
AAUAA
GUGUGU
但5’端没 有“帽子”，
A
精选Gp加pt 尾
产物被降3解2 ）
转录后的加工
原核RNA不需加工，边转录边翻 译
例:同一转录本, 在不同的组织, 因剪接差异产生 各自不同的mRNA
• 剪接的本质：磷酸酯键的转移
• 剪接特点 ：剪接部位的结构为内含子末端的特定
序列，分布在内含子的三个部位，5‘端剪切点为
GU;3’端剪切点为AG；靠近3‘端含A序列的分
支点
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• mRNA的剪接：
hnRNA被剪接体作用，剪除内含子、 连接外显子，产生成熟的mRNA的过 程
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3、原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T 在RNA合成中变为U
4、合成过程: 连续，方向：5'→3' 5、合成部位：细胞核内
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二、原核RNA聚合酶
lncrna建库原理
lncrna建库原理LncRNA（长链非编码RNA）是一类在细胞中广泛存在的非编码RNA，长度通常超过200个核苷酸。
近年来，越来越多的研究发现了LncRNA在基因调控、细胞分化和发育等生物过程中的重要作用。
为了更好地理解和研究LncRNA的功能和机制，进行LncRNA建库是一种常用的实验方法。
LncRNA建库的原理基于高通量测序技术，旨在快速高效地筛选并分析细胞中的LncRNA。
该建库方法包括四个主要步骤：RNA提取、LncRNA富集、文库构建和测序分析。
首先，从样本细胞中提取总RNA。
可以采用常规的细胞裂解和蛋白酶处理方法，使细胞中的RNA完整地释放出来。
然后，利用RNA提取试剂盒等工具，将RNA纯化、富集并进行组织。
接下来，需要对富集的RNA进行文库构建。
传统的RNA文库构建方法包括两步骤：首先，将RNA逆转录成cDNA，然后对合成的cDNA 进行文库构建。
在LncRNA建库过程中，一般采用不同的RNA逆转录酶和引物，以确保LncRNA的合成和扩增。
此外，一些新型的LncRNA文库构建方法也在不断的发展，以提高LncRNA的检测灵敏度和特异性。
在文库构建完成后，可以进行高通量测序。
通常采用Illumina等测序平台，通过测序仪将LncRNA进行高通量测序，并生成海量的测序数据。
测序数据包含了LncRNA基因的序列信息，可以通过生物信息学的方法进行分析。
最后，对测序数据进行分析和解读。
通过比对和注释，可以识别和注释样本中的LncRNA。
同时，可以进行LncRNA差异表达分析、功能富集分析等，以深入理解LncRNA在生物过程中的作用。
综上所述，LncRNA建库是一种高通量测序分析技术，用于全面了解LncRNA在基因调控和细胞生物学过程中的功能和机制。
通过LncRNA建库，我们可以更深入地探索LncRNA的生物学特性，为研究人员提供了有价值的工具和资源，以加深对这一重要类别的非编码RNA的理解。
RNA建库通识培训
二、RNA分类
Coding RNA： mRNA
编码蛋白质
total RNA
Noncoding RNA
Ribosomal RNA
rRNA 核糖体组分
Long noncoding RNA lncRNA 调控功能
Small RNA
调控功能
生产基本流程
RNA
样本制备 Step :
（1）反转录时添加放线菌素D，提高链特异性比例; （2）合成cDNA二链时，反应buffer不再是dNTP,而
是dUTP，使cDNA第二条链中的T由U代替，目 的在于在PCR时User 酶消化掉cDNA的第二条 链，仅留下直接由mRNA反转录得到的cDNA 第一条链，保留RNA的方向信息，获得有效数 据更多。
RNA 建库通识
部门：科技服务建库部 姓名：汪丽 时间：2016年7月16日
目录
RNA 概述
建库原
建库注
>>
理及流
>>
意事项
程
RNA概述
一、RNA特点 1、分子相对较小，通常是单链，RNA链可自身折叠形成局部双螺旋； 2、RNA酶极为稳定且广泛存在，所以RNA极易降解； 3、通常有特殊结构。如：mRNA5’端的帽子结构、3’端有polyA尾； 4、通常有前体，需要剪切和修饰才能形成成熟结构 试剂盒去除 total RNA中含量最高的rRNA Ribo-zero 试剂盒去除rRNA的原理：
链霉亲和素
生物素 探针 r/ul，并 保证稀释液体积不小于15ul；
建库原理
2、片段化、反转录及双链cDNA的合成 （1）片段化：打断94℃ 9min，利用RNA对二价阳离子
的敏感性将RNA打断成一定长度的片段，注意严格控 制打断时间，程序结束后立即将样本置于冰上； （2）反转录：以片段化的mRNA为模板，dNTP为底物， 在逆转录酶的作用下反转录合成cDNA，体系有添加
单细胞建库384微孔板方法
单细胞建库384微孔板方法
单细胞建库是一种用于对细胞进行单个细胞的RNA测序的方法。
在384微孔板上进行单细胞建库需要以下步骤：
1. 细胞分离：将样品（例如细胞悬液）按照所需细胞数量均匀分配到384个微孔中。
可以使用细胞分选仪或者手工方法进行分离。
2. 单细胞捕获：用一种适当的方法捕获每个微孔中的单个细胞。
常用的方法包括流式细胞仪、微流控芯片等。
3. 细胞裂解：将每个微孔中的单个细胞裂解，释放出细胞内的RNA。
4. RNA逆转录和扩增：对每个微孔中的RNA进行逆转录反应，生成cDNA。
然后进行PCR扩增，得到足够的DNA数量用于
测序。
5. 混合和净化：将每个微孔中的cDNA混合在一起，并进行
净化，去除杂质。
6. 削减和连接接头：对净化后的cDNA进行削减和连接接头。
7. 建库和测序：将连接好的cDNA进行建库，生成测序文库。
然后进行高通量测序。
8. 数据分析：对测序得到的数据进行分析，包括基因表达量分析、转录组组装和差异表达分析等。
以上是单细胞建库在384微孔板上的一般步骤，具体细节可能有所差异，根据实验设计和仪器设备的不同可能会有调整。
建议在进行实验前参考相关文献和操作手册，确保操作规范和正确性。
RNA的生物合成和加工(1)幻灯片
合成第一个磷酸二酯键 5’-pppGpN-OH
转录起始复合物
σ亚基脱落
RNA pol(αββ′σ ) —DNA—pppGpN-OH
转录起始不需引物！
16/50
RNA聚合 酶保护区 结构基因
终止点 翻译开始
转录开始
-35
-10 +1 10
TTGACA 辨认结合区
TATAAT Purine
（Pribnow box） 转录起始区
-10 解链速度
RNA聚合酶σ因子 – 识别及结合启动子，延长时脱落 – 不参与转录过程，是转录辅助因子 – 识别位点：启动子-35区、-10区
延长---- 转录泡
RNA聚合酶〔核心酶〕 ◆与DNA模板严密结合，沿3’ 5’方向移
动 ◆解旋作用：DNA解开 ◆聚合功能〔不具外切酶功能〕
杂交螺旋 ◆ RNA-DNA形成杂交螺旋 ◆ 转录产物RNA沿5’ 3’方向延长
富含GC/AT的回文构造 自身互补形成 发夹状构造〔hairpin〕 3’尾端有≥4个U
Pol遇此构造停顿工作 DNA和RNA〔dA ：rU〕
稳定性下降
DNA恢复双链， 释放转录产物
5’
3’
AUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU
自发形成茎环结构
5’
UUUU…… 3’
5’ …..
开放〔正调控〕或关闭〔负调控〕
特点：
三个功能构造域：DNA识别结合域
转录活性域
结合其他蛋白的结合域
能识别并结合顺式作用元件(cis-acting element)
正调控与负调控
功 能 结 构 域
反式作用因子构造域的模式
DNA结合域(DNA- binding domain) 锌指构造(zinc finger motif) 同源构造域(homodomain,HD)： 螺旋-回折-螺旋(helix-turn-helix) 亮氨酸拉链构造 (leucine zipper) 螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH) 碱性α螺旋(alkaline α-helix)
mirna建库原理
mirna建库原理引言：mirna（MicroRNA）是一类非编码RNA，长度约为21-25个核苷酸。
它在基因表达调控中起着重要的作用，参与调控细胞的生长、分化和凋亡等生物学过程。
为了研究mirna的功能和作用机制，科学家们开展了mirna建库的研究。
本文将介绍mirna建库的原理。
一、mirna提取：mirna的提取是mirna建库的第一步。
由于mirna在细胞中含量较低，且与其他RNA种类相似，因此需要使用特殊的方法进行提取。
常用的mirna提取方法包括酚-氯仿法、柱子法和磁珠法等。
这些方法可以有效地从细胞或组织中提取出mirna，并去除其他RNA 和DNA等杂质。
二、mirna逆转录：mirna逆转录是mirna建库的第二步。
逆转录是将RNA转录为DNA的过程，常使用反转录酶进行。
在mirna逆转录过程中，需要加入特定的引物，即miRNA RT引物，使得反转录酶能够选择性地逆转录mirna而不是其他RNA种类。
逆转录过程还需要一定的温度和时间条件，以保证反转录酶的活性和反应的完整性。
三、mirna扩增：mirna扩增是mirna建库的第三步。
在mirna扩增过程中，需要使用特定的引物，即miRNA PCR引物，选择性地扩增mirna而不是其他RNA和DNA。
为了增加PCR反应的特异性和效率，常常采用两步法进行mirna扩增，即首先进行预扩增，然后进行二次扩增。
预扩增和二次扩增的条件需要精确控制，以保证扩增产物的特异性和数量的合适。
四、mirna测序：mirna测序是mirna建库的最后一步。
通过测序可以确定mirna的序列，并进一步研究其功能和作用机制。
常用的测序方法有Sanger 测序和高通量测序。
Sanger测序适用于测序少量样品，具有较高的准确性，但测序通量较低。
高通量测序适用于测序大量样品，具有较高的测序通量，但准确性稍低。
根据研究的需要和预算的限制，科学家们可以选择合适的测序方法进行mirna测序。
RNA甲基化研究现状与实验可行性ppt课件
（方法：找到并查看提供此类服务的三家公司，发布服务的思路与消息） 9~9页
三、研究与技术服务意义
（方法：综合学术界发展势态与技术服务发展势态）
10~10页
四、实验原理与本质—Peak峰出现的原理
（方法：综合NCBI上检索到21篇文献中的相关技术言论，着重解释了实验原理与Peak峰出现的原理） 11~12页
八、采购试剂方案
（方法：找出必要的2~4类试剂的采购供应情况，均有代理商！）
18~18页
九、目前我国甲基化诊断产品注册情况
20~21页
（方法：在CFNA官方网站上已经可以检索到一例甲基化诊断试剂盒（PCR荧光探针法））
精选课件ppt
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探究与技术
MeRIP-Seq测序技术 甲基化转录组RNA免疫共沉淀—高通量测序技术（Methylated RNA Immunoprecipitation Sequencing ）
RNA甲基化与MeRIP-Seq测序技术
——甲基化DNA免疫共沉淀技术（MeDIP）、RNA结合
蛋白免疫共沉淀技术（RIP）和RNA测序技术（RNA-seq）
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目录
一、探究与技术—研究历程
（方法：使用关键词“MeRIP”在NCBI上检索到21篇相关文献，形成综述） 3~8页
二、探究与技术—服务历程
提示：MeRIP-Seq测序技术还处于非常早期发展阶段。文章讨论了每个处理步骤背后的基本原理，以及具体实践方法和可能的替代 策略，并且exomepeak R/Bioconductor包是免费提供，参见 。
Methods. 2014 Oct 1;69(3):274-81. 4、2014年，中国科学院北京基因组研究所研究了模式植物水稻全转录组RNA甲基化（愈伤组织Vs叶片）特点，就 是指甲基化位点化富集GO功能差异分析。 一、m6A峰在RNA三类区域分布的百分率。 二、m6A位点在特定转录本序列中的位置。 三、甲基化富集GO功能差异分析。
rna建库初级重组注意事项
rna建库初级重组注意事项一、实验前的准备工作在进行RNA建库初级重组实验之前，需要做好充分的准备工作。
首先，准备好所需的实验材料和试剂，包括RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA合成试剂盒、文库构建试剂盒等。
其次，对实验所需的仪器设备进行检查和校准，确保其正常工作。
同时，要做好实验室的无菌操作环境，保证实验的准确性和可重复性。
二、RNA提取与纯化RNA提取是RNA建库的第一步，是整个实验的关键环节。
在进行RNA提取前，需要注意以下几点。
首先，选择合适的样品进行提取，确保样品的质量和纯度。
其次，按照试剂盒的操作手册进行操作，注意避免RNA的降解和污染。
在提取的过程中，要注意使用RNase-free试剂和工具，避免RNase的污染。
最后，提取得到的RNA需要经过纯化步骤，去除杂质和DNA的污染。
三、RNA反转录RNA反转录是将RNA转录成cDNA的过程。
在进行RNA反转录前，需要注意以下几点。
首先，选择合适的反转录试剂盒和引物进行反转录反应。
其次，反转录反应需要进行优化，包括反应温度、反应时间和反应体系等方面。
在反转录的过程中，要注意避免RNA 的降解和污染，使用RNase-free试剂和工具。
最后，反转录反应后的产物要进行纯化，去除未反转录的RNA和反转录酶等杂质。
四、DNA合成DNA合成是将反转录得到的cDNA转化成双链DNA的过程。
在进行DNA合成前，需要注意以下几点。
首先，选择合适的DNA合成试剂盒和引物进行DNA合成反应。
其次，合成反应需要进行优化，包括反应温度、反应时间和反应体系等方面。
在合成的过程中，要注意避免DNA的降解和污染，使用DNase-free试剂和工具。
最后，合成反应后的产物要进行纯化，去除未合成的单链DNA和合成酶等杂质。
五、文库构建文库构建是将合成得到的双链DNA连接到文库载体上的过程。
在进行文库构建前，需要注意以下几点。
首先，选择合适的文库构建试剂盒和文库载体进行文库构建反应。