产几丁质酶的筛选及活力测定

产几丁质酶的筛选及活力测定

一、实验材料

1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。)

2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。，搅拌5 s，水浴至45。然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7 d后可以使用。) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。

几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。（胶体几丁质固体培养基。0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）

马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。

二、筛选

1.初筛采用平板透明圈法。用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。用游标卡尺测量几丁质水解圈直径(R／ram)与菌落直径(C／mm)，计算R／C比值。

2. 复筛摇瓶发酵，即在300mL三角瓶中装入30mL基础培养基，用3mL孢子悬液(1×107／mL)接种，28℃，160 r／rain旋转摇床培养96h。相同条件下接入几丁质酶诱导培养基培养24 h。离心发酵液(3 000 r／min，20min)的上清液即为粗酶液，测定酶活力。

3. 几丁质酶活性测定

取0．5mL粗酶液与0．5 mL含1．0％胶体几丁质的磷酸缓冲液(0．1 M，pH 6．0)混合，50℃保温1 h，煮沸5min，冰浴冷却，10000 r／min离心5 min，取上清液加入DNS试剂1 mL。于100℃加热10 min，冰浴冷却，离心后取上清液在波长540nm下测吸光度。以N一乙酰氨基葡萄糖做标准对照。

酶活力单位定义：在上述条件下，每小时产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。(采用DNS(3，5一二硝基水杨酸)比色法。，测定还原糖含量，其标准曲线的回归方程为Y=0．840 5x+0．009 9，式中x为N一乙酰葡萄糖质量(mg)，Y为吸光值，R2=0．996 2。在3根1．5“离心管中分别加入0．5 ml待测液和0．5nd浓度l％胶体几丁质；向其中I根离心管加入0．5 ml[DNS，放入100 ℃水浴10 rain，作为对照；另外3根离心管于4。℃水浴60 rain后，加入0．5 d DNS，放人100℃水浴10rain。3根管中均加入5 rnl 蒸馏水，4 000 r／rain离心10 rain后，取上清液，于540 nm测量OD，根据N一乙酰氨基葡萄糖的标准曲线计算出还原糖含量。酶活力单位(U／m1)表示在上述反应条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需酶量。)（from：《淡紫拟青霉几丁质酶提取工艺的优化研究》）