薄层色谱法
色谱学 第三章 薄层色谱
在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三 者是相互联系而又相互竞争的，如此构成了 整个层析分离过程 。 在薄层吸附色谱过程中，主要为物理吸附， 无选择性。因之吸附剂与多元组分溶液接触 时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位 重量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量” 会因物质种类而异），另一方面，吸附剂也 可吸附流动相分子。由于物理吸附是可逆的， 故被吸附的分子同时也可被解吸出来。
偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 对羟基偶氮苯
Ⅱ 0.61 0.28 0.18 0.11 0.04 0.01
表3-2 硅胶活度分级法 Rf Ⅲ Ⅳ 0.70 0.83 0.43 0.67 0.30 0.53 0.13 0.40 0.07 0.20 0.01 0.07
除上二种外，还有其他一些吸附剂。吸附剂品种如下： （1）硅胶：薄层色谱用为200~250目粒度，规格很多，一般如有石膏作粘 结剂，称硅胶G；石膏含量为5~20%，一般为10~13%，亦有用淀粉作粘 结剂的，称硅胶S，不加粘结剂者称硅胶H或硅胶N，为了便于观察组分的 斑点，也可在硅胶中加入荧光指示剂。如果又加有粘结剂时，则称为硅胶 GF或硅胶GF254，即吸收254nm紫外光。 （2）氧化铝：根据加有粘结剂情况不同，有H、G、HF、GF等品种。 （3）硅镁吸附剂：即费罗里硅土，使用前要在130℃下活化二小时。 （4）纤维素：长度仅为2~20微米的短纤维，分天然纤维和微晶纤维两种 形式，也可加粘合剂、一般用于亲水性物质的分离，如羟基化物等，但缺 点为不能用浓硫酸等腐蚀性溶剂进行显色。 （5）聚酰胺：这是一种使用广泛的有机吸附剂，多用于分离酚类化合物， 样品容量大，但粘结能力差，可加入纤维素或淀粉作粘结剂。 （6）烧结薄层板：这是一种多次使用的薄层板，是由200~300目石英或玻 璃粉，与200~300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂 在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高温下烧结，即成烧结板。 烧结板用一次后可用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水洗干净后烘干再 继续使用。
薄层色谱法
薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料（1）薄层板市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。
自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。
最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%~0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。
使用涂布器涂布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或有双槽展开缸，展开时须能密闭，水平展开用专用的水平展开缸。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法(1) 薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。
如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。
薄层色谱法
课程：分析制样技术
薄层色谱法
一、薄层色谱法概念及原理
• 薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固－
液吸附色谱。 • 样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同， 使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显 然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而 试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。
四、注意事项
1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。
2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互 作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离 ，但不适用于酸性组分的分离。
3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开 剂的极性，从而达到分离效果的目的。
二、吸附剂与展开剂的选择
（2）展开剂：
选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比 。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小 或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。 单一溶剂极性大小顺序如下： 酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯 仿>二氯甲烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石 油醚
① 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用
而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板 放入则显色。
② 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组
分显色。
③ 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发
薄层色谱法
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介绍
薄层色谱，或称薄层层析(thin—layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以 合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、 类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采 用。
药物和药物代谢
薄层色谱法在合成药物和天然药物中的应用很广。有些文献和内容偏重于合成药物、化合物及其代谢产物， 有文献为在中草药分析中的应用。
优点
薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20 分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0．01μg的样品分离，又能分 离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生 物高分子的分离效果不甚理想。
薄层展开
展开剂也称溶剂系统，流动性或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的主要任务是溶解被分 离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使各组分的Rf值在0.2~0.8之间并对被分离物质要有适当的选择性。 作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、适当的稳定性、低黏度、线性分配等温线、很低或很高的蒸气 压以及尽可能低的毒性。
点样应注意的问题：
(1)点样量：原点位置对样品容积的负荷量有限，体积不宜太大，一般为 0.5~10μl，样品的浓度通常为 0.5~2mg，太浓时展开剂从原点外围绕行而不是通过整个原点把它带动向前，使斑点拖尾或重叠，降低分离效率。 点样量太小，不能检出清晰的斑点影响判断。点样量太多，展开剂不能全部负载，容易产生拖尾现象。当点样量 适合时，可采用点状点样；当点样量过大，原点无法负荷时，可采用条带状点样，得到更好的分离效果，提高分 辨率。
薄层色谱法
l点样器:
一般采用微升毛细管（定量点样毛细管： 0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等）、微升注射
器或半自动、全自动点样器材，手动点样时建议
采用微量毛细管。
l展开缸
应用适合薄层板大 小的薄层色谱专用展开 缸（箱），展开缸有水 平式和直立式两种类型。 日常用的最多的是直立 式展开缸。它又分平底 展开缸或双槽展开缸。 双槽展开缸具有节省溶 剂、便于预平衡、可控 制展开缸内相对湿度等 有点，故此常推荐使用。 水平展开用专用的水平 展开缸。
Ø 限度检查 采用定量配制的对照品对照或对照品稀释 对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的 对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜 色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作， 峰面积不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定 检查的斑点数和限量值。
Ø含量测定 照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分 的含量。
高效薄层板（HPTCL）所使用的固定相较普通薄层 板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的 展开距离中可以达到更好的分离效果。
传统薄层板与高效薄层板的比较
平均粒度（um） 颗粒分布（um） 点样量（ul） 展距(cm) 分离时间(min) 检测限：可见光（ng）
荧光（ng） 薄层厚度（mm）
TCL 10-40 宽 大 10-15 30-200 100-1000 1-ห้องสมุดไป่ตู้00 0.2-0.3
l 定义：薄层色谱法，或称薄层层析(thin—layer chromatography），系将适宜的固定相涂布于玻 璃板、塑料或铝基片上，成一均匀的薄层；将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端，在展开 容器内用适宜的溶剂（展开剂）展开，使供试品 中所含成分分离，采用适合的显色剂或显色方法 显色，将供试品色谱与对照物色谱比较，或采用 薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查，或含量测 定的方法。
薄层色谱法
选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅 胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺 分离亲水性化合物，选择纤维素和离 子交换纤维素及硅藻土。 一般，被分离组的极性强，选择吸附 能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强 者。
种类： • 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 • 氧化铝—有碱性、中性、酸性 • 硅藻土—为化学中性吸附剂 • 纤维素—天然多糖类 • 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形 成氢键的物质有特别的选择性
什么是TLC？
薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC） 是将适宜的固定相喷涂（或喷雾）于玻璃板， 塑料或铝基片上，成一均匀薄层。干燥后 进行点样，展开，斑点定位；或与适宜的 对照物随行对照比较，或用薄层扫描仪扫 描，用于药物或其他化合物的分离，鉴别， 检查或含量测定等。
– 通过板上光谱图定性
• 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光 谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。 • 可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用 计算机检索定性。
– 与其他技术连用
• TLC-付里叶变换IR联用 • TLC-MS联用
• 定量方法
– 间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗 脱下来，再对洗脱液定量。 • 分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法
• TLC是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特 别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变 化的物质的分离。 • 薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样 和展开剂用量少，展开速度快。 • TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测 柱色谱过程 。 • 在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原 料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
• 选择：“相似相溶”原则 同吸附柱色谱 极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇 ＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲 烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>环己 烷>石油醚。
薄层色谱法
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薄层色谱法
（thin layer chromatography; TLC) （一）概述 1.背景
1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一 种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色 谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高， 结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后 发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪 器化，并实现了计算机化。
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展开时的注意事项
产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是 使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶 剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展 开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 值比边缘的Rf值小，即边缘效应。
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展开时的注意事项
消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层
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六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱
1.丹皮酚； 2～5.六味地黄丸
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薄层色谱法（TLC)应用实例
二、醋酸可的松中其他甾体的检查
取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶 液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿甲醇(9︰1) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅴ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl， 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 (385︰60︰15︰2) 为展开剂，展开后，晾干，在105 ℃干燥 10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品 溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主 斑点比较，不得更深。
⑵点样
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细 管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样 点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细 线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量 过多。
薄层色谱法
4.点样过程 确定点样位置
吸取点样溶液
点样。
a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作 好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm； b.用点样设备吸取一定量的溶液； c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被 其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完 成一次点样。 注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干 后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时， 点样设备不能混用。
薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进 行定性鉴别、杂质检查和含量测定。
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第三节 在药物分析中的应用
主要用于中药、化学药物、生物制品等的定 性鉴别、杂质检查、含量测定。
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一、在鉴别方面的应用
通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证 各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的 Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照 物为同一物质。 为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开 系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一 致，则可认定两者是同一物质。
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锯齿扫描
(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄 层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光 束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两 波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的 干扰。
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化合物斑点的吸收光谱
单波长与双波长扫描曲线的比较
6.定量方法
2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站 3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种
透射法：测量反射光的强度 反射法：测量透射光的强度
L 光源；MC 单色 器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电 检测器
薄层色谱法
第二部分色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。
与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。
被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。
被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。
可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。
此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。
（1）载体对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。
硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。
常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。
加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。
TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
薄层色谱法
薄层色谱（Thin-Layer Chromatography: TLC）是在玻璃板上，塑料片或者铝箔覆盖有很薄的一层吸附剂的一种用于分离混合物的色谱法。
薄层板展开的方法是其中一端被溶剂浸润后，溶剂在吸附剂的间隙中扩散，溶剂往上方移动进行爬板（毛细管现象）。
如果在板子上点样混合物的话，那么化合物也会随着溶剂的移动而移动。
这个时候，由于化合物与固定相（吸附剂）的吸附度，移动相（溶剂）的亲和性的差异，混合物中各个化合物的移动速度与移动距离（Rf值）也不同。
也是利用这个原理，该方法可以用于有机化合物的分离纯化。
特别是在有机合成中，作为吸附剂的有硅胶，矾土，纤维素等等，展开溶剂的话通常有乙酸乙酯/正己烷体系，二氯甲烷/甲醇体系等等，根据具体情况运用到的体系也不同，这里就不多举例了。
TLC点板与跑板方法（出处：）TLC跑板法可以称为追踪一个反应的眼睛，是十分简便但又特别重要的分析手段。
往往不重视TLC或者对此方法掌握的不是很好的人，做实验也是多少有点问题的。
而怎样点板比较好呢？通常如上图所示，左边是原料，右边是混合物，中间是原料与反应混合物，这样的一个点板方式小编认为是比较推荐的。
而中间的这个原料与反应混合物叠加的点有以下三点作用：由于展开的方法问题有可能造成爬板的时候不是直线爬，所以有时候原料与反应混合物的Rf值可能差距不大，会分不清楚避免由于反应混合物中溶剂残留的问题，影响到Rf值有时候反应混合物在点板的时候会分解，有可能观测不到。
除了以上三点以外，我想这样点板还有很多好处，希望能够作为参考。
另外展开后，如何确认点的位置，一般我们用UV 或者显色剂的方法来观测，这在我们chem-station 以前的文章（各种TLC显色剂的调配方法）中有详细阐述，有需要的同学可以作为参考。
0502薄层色谱法
0502薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检査或含量测定。
1.仪器与材料(11薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。
固定相中可加入黏合剂、荧光剂。
硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、G、H表示含或不含石膏黏合剂。
F254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。
按固定相粒径大小分为普通薄层板（10〜4(^m)和髙g薄层板(5〜10pm)0^保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。
固定相颗粒大小一般要求粒径为10〜40pm。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
(2)点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
、(3>展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。
水平展开用专用的水平展开槽。
(釣显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸溃显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
(5)检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。
暗箱光源应有足够的光照度《(6)薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法(1)薄层板制备市售薄层提临用前一般应在110°C活化30分钟。
聚■■■■_IM_I-—*酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。
薄层色谱法
检查活性的方法：（1）把青靛酚、苏丹红G、甲基黄等染料 等量混合，溶于苯中，点放到板上，用正己烷展开，所有染 料应不动，用苯展开应依次得到三个染料的圆形斑点；（2） 用苯展开时，溶剂上升10cm，应在30min左右，不应超过 45min；（3）薄层厚度应均匀，并具有一定的机械强度，板 的活性对Rf值的大小影响很大。 活化后的薄层板最好放储存于氢氧化钾（3~10毫米汞柱）干 燥器中备用。注意尽量避免吸收水分，降低活性。使用前最 好重新活化。
3、显色剂法 —— 通用显色剂50%H2SO4，喷洒，Δ110~120º C， 显斑；酸碱指示剂，遇酸或碱显色；0.05%KMnO4，氧化性，使 淡红色薄板背景呈黄斑；5%磷钼酸，遇到还原性物质，呈兰色 显示斑。要根据实际情况选择显色指示剂。
（四）应用 定性分析 —— 薄层色谱中Rf值较纸色谱差，须严格控制实验条 件，可通过作对照实验，获得可靠结果。 定量分析 ——直接法和间接法 直接法：
特点：波长范围宽、扫描 速度快、自动化程度高及 操作简便。
C10269薄层色谱扫描仪
间接法 利用测定Rf值进行定性分析 薄层色谱的定量方法：
将样组分斑点显色后，将被测组分用小刀刮下或用特 制的斑点吸取装置将斑点吸到收集器中，将被测组分 用溶液洗脱，溶液用其他方法定量测定
淀粉 —— 机械强度高，但不能在含有碘蒸气中显色。
羧甲基纤维素 —— 机械强度高，耐腐蚀性差。
5、展开剂的选择
要考虑被分离物质的极性、吸附剂的活性及展开剂的极性 这三者之间的关系来选择合适的展开剂。
B A
例如：
极性
非极性 被分离物质
Ⅰ Ⅴ
非极性物质B，选用 吸附剂的活性为Ⅰ~Ⅱ级， 展开剂应为非极性的。
5、层吸缸中溶剂饱和度 不饱和层吸缸中展时Rf较大
0502-薄层色谱法
0502 薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层色谱扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料（1）薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。
固定相中可加入黏合剂、荧光剂。
硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、G、H表示含或不含石膏黏合剂。
F254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。
按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40μm）和高效薄层板（5～10μm）。
在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。
固定相颗粒大小一般要求粒径为10～40μm。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
、（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。
水平展开用专用的水平展开槽。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。
暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法（1）薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。
薄层色谱法(TLC)
254nm和256呈现荧光背景
二薄层色谱操作过程
1.薄层制备（铺板） 1份吸附剂（硅胶/氧化铝）+3份粘合剂+水→硫 钵中搅拌均匀条糊状（无气泡和板结）→均匀涂 布薄层板 硅胶G：自含粘和剂（含5%-10%的煅石膏），仅 加水 硅胶H：不含粘和剂，需另加CMC(0.4%-1%）的水 溶液，需放置沉降纤维)
3.点样——成功分离和精确定量的关键
点样要求： 点样原点应小而圆，距板边缘2cm， 需要可多次点样（每次挥干后），防止边缘效应 点样量勿超载，防止拖尾 点样勿伤及薄层表面
点样装置：容量毛细血管
自动薄层色谱点样仪
4.展开
展开原理：差速迁移 展开方式：上行展开，75°夹角 展开过程： 展开室预先用展开剂饱和，平衡系统→点样薄板一端 浸展开剂展开（距边缘0.5~1cm）→挥尽溶剂
3.载板
具一定机械强度，化学惰性，耐一定温度，表
面平整，厚度均匀，价格便宜
玻板：5cm×10cm ,10cm×20cm ,20cm×20cm
光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥
4.粘结剂
作用：加强固定相颗粒的附着力，增加薄层板润湿性改善 色谱分离 1）无机粘结剂：煅石膏 含粘结剂固定相：硅胶G——含13~ 15%煅石膏G——
2溶解、样品溶 液稀释和浓缩、均相溶液制备、化学衍生化。
HPLC:预处理复杂而严格
TLC:样品预处理较简单
3.进样
HPLC:对溶样溶剂和样品浓度要求严格 可自动进样，每次一个样品 TLC：溶样溶剂可以任意选择，点样体积是唯一需准 确控制的参数. 可自动进样，每次多个样品
4.色谱分离
HPLC: 每次进样一个，分析和平衡时间长 恒组分洗脱适于极性范围窄的样品 梯度洗脱适于极性范围宽的样品并需要更多的时间 若组分吸附则无法检测且污染柱子 反相色谱常用 使用相同固定相和流动相的R较高 TLC： 同时分析多样品，方便灵活 适于各类物质分离 正相色谱占主导 对复杂样品分离能力好
薄层色谱法
4
检验步骤
药品检验技术 Drug Quality Control
点样
取出制好的薄层板，分别在距一端1cm处用铅笔轻轻 划一横线作为起始线 取管口平整的毛细管插入样品溶液中，在板的起点线 上点混合液及未知物A/B两个样点，样点间相距约 1.5cm左右 如果样点的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须 待前次样点干燥后进行。样点直径不应超过2mm
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药品检验技术 Drug Quality Control
要得到一个较为清晰的色谱，样品提取物经预处理，使供试品溶液得以净化，往 往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。
（1）单一溶剂提取法 根据被测物质的化学特性，有选择性地采用某种溶剂直接提取制备。（如浙贝母、
平贝母、华山参、洋金花等）
（2）分段提取法 被检测样品不同极性部位分别提取后制成相应供试液，分别检测分析（如丹参）
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检验步骤
药品检验技术 Drug Quality Control
展开 在层析缸中放约15mL的展开剂，把薄层板小心放入层 析缸内，点样一端应浸入展开剂约0.5cm，盖上盖子使 容器被展开剂蒸汽饱和
盖好盖子，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取 出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干 后观察分离的情况，比较三者Rf值的大小，并根据Rf判 断所含的组分。
3
样品预处理
药品检验技术 Drug Quality Control
（4）液-液萃取法 利用样品与杂质在两相（水相和有机相）中溶解度的不同，达到净化目的。特别 适合合剂、口服液、糖浆剂、注射剂等的处理
（5）固-液萃取法 固相小柱萃取基本上是基于吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换 原理富集待测成分，去除部分杂质
薄层色谱法概述
展开方式
多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。
多次展开——一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。
分步展开——混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。
02
01
薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例： 硅胶板（粒度10 ～40um） 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制0.2% ～ 0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。
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点样
01
添加标题
要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。
添加标题
手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。
04
添加标题
采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。
02
03
添加标题
点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。
薄层色谱参数
原点
Lr
L。
W
参比
样品
前沿
保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。， S R 原点
同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。 在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n 。
注意：
Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。
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薄层色谱法
薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料
（1）薄层板
按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。
固定相中可加入黏合剂、荧光剂。
硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254，G、H表示含或不含石膏黏合剂。
F254为在紫外光254nm 波长下显绿色背景的荧光剂。
按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40µm）和高效薄层板（5～10µm）.
在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。
固定相颗粒大小一般要求粒径为10～40µm。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。
水平展开用专用的水平展开缸。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或
经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法
（1）薄层板制备
市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。
如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。
自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。
使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。
（2）点样除另有规定外，在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线离底边8～10mm。
圆点状直径一般不大于4mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。
条带状宽度一般为5～10mm。
高效板条带宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。
点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。
（3）展开将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。
除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上
行展开5～8cm 。
溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。
展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30分钟。
溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。
如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内壁贴于展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂中，密闭一定时间，使溶剂蒸气达到饱再如法展开
（4）显色与检视 有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。
有荧光的物质或显色后可激发产生荧光的物质可在紫外光灯（365nm 或254nm ）下观察荧光斑点。
对于在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶GF254板），在紫外光灯254nm 下观察荧光板面上的荧光物质猝灭形成的斑点。
（5）记录 薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。
也可用薄层扫描仪扫描或其他适宜的方式记录相应的色谱图。
3.系统适用性试验
按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和标准物质对实验条件进行试验和调整，应符合规定的要求。
（1）比移值（R f ）系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
离
基线至展开剂前沿的距距离基线至展开斑点中心的 f R 除另有规定外，杂质检查时，各杂质斑点的比移值R f 以在0.2~0.8之间为宜。
（2）检出限 系指限量检查或杂质检查时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低浓度或量。
一般采用已知浓度的供试品溶液或对照标准溶液，与稀释
若干倍的自身对照标准溶液在规定的色谱条件下，在同一薄层板上点样、展开、检视，后者显清晰可辨斑点的浓度或量作为检出限。
（3）分离度（或称分离效能）鉴别时，供试品与标准物质色谱中斑点均应清晰分离。
当薄层色谱扫描法用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：
R =2（d2-d1）/（W1=W2）
式中d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；
d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；
W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。
除另有规定外，分离度应大于1.0。
在化学药品杂质检查的方法选择时，可将杂质对照品用供试品自身稀释的对照溶液溶解制成混合对照溶液，也可将杂质对照品用待测组分的对照溶液溶解制成混合对照标准溶液，还可采用供试品以适当的降解方法获得的溶液，上述溶液点样展开后的色谱图中，应显示清晰分离的斑点。
（4）相对标准偏差薄层扫描含量测定时，同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值得相对标准偏差应不大于5.0%；需显色后测定的或者异板的相对标准偏差应不大于10.0%。
4. 测定法
（1）鉴别按各品种项下的方法，制备供试品溶液和对照标准溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品色谱图中所显斑点的位置和颜色（荧光）应与取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。
（2）限度检查采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。
供试品溶
液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。
必要时应规定检查的斑点数和限量值。
（3）含量测定照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。
5.薄层色谱扫描法
系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。
测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。
除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。
扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。
如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。
薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描、测定和计算。
薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。
供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。
扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。