内生菌的分离.
植物内生菌的分离
植物内生菌的分离钱昆121140041一、实验目的1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。
2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。
3、了解微生物分子实验的基本操作流程。
二、实验原理在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。
对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。
但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。
因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。
植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。
内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。
其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。
直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。
植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。
内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。
这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。
真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。
与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。
对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。
根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。
分离植物内生真菌操作流程
分离植物内生真菌操作流程1.材料准备：植物样本、剪刀、镊子、70%乙醇、3%次氯酸钠（本实验用4?）、酒精灯、计时器、平板、锥形瓶，无菌水，离心管（带盖，灭菌）、打开无菌操作台灭菌30min。
（1）植物样本的采集：选取生长状态良好，不要有病斑或者枯枝烂叶，每种植物实行三株标本，必须具有叶子、叶柄和枝条及其他部位，将样本名字写下在小纸条上放到上装标本的袋子里，檀香的标本与写著名字的纸条一同偷拍，样本上存有脏东西时，恳请用纸轻轻盖住，若不确切植物名字，恳请将整棵植物偷拍领用作鉴别，并搞好有关记录。
（2）制作pda固体培养基，在无菌操作台中倒平板，每瓶250ml的培养基大概倒15个板，等待其凝结后用作注射。
2.清洗：认真用清水将标本洗净，洗去标本表面的灰尘，去除枯叶，备用。
3.取样：（1）在叶片的左上、右上、左下，右下和正中五个部位展开采样，穗序5mm*5mm的叶片，如果是叶柄或枝干，则剪取5~10mm，若是比较粗的枝干或圆圆的果实之类的，总之比较大的，则将它切开，再剪取样本，样本不要剪的太大或太小。
（2）每种植物的叶子，叶柄，枝干等其他部位，每种部位注射两块板，小板每个要接种五个样本即左上、右上、左下，右下和正中，小板每个接种四个样本即左上、右上、左下，右下，计算好所要剪的样本数，尽量多剪几个，以免后面的表面灭菌中冲洗时被冲掉。
（3）若植物标本存有余下，且是没烧完的，再次上装不好，放在冰箱里，水泵，洗过的扔掉。
（4）每种植物标本所剪的样本放到一个50ml的离心管中，放到试管架上，并且每个离心管上要标好所对应的植物标本。
4.表面杀菌：在无菌操作台中展开（1）先向各离心管内倒入适量（10~20ml）70%乙醇，拧紧盖子，用计时器已经开始计时1min,每10秒钟摇晃离心管几次，并使其充份杀菌。
（2）1min后，拧松盖子，将乙醇倒入事先准备的锥形瓶中，注意不要将管中样本好像出来，盛满的样本不要再放进其中，也不要用手遇到样本，样本不可以碰触至除了离心管以外的东西。
植物内生菌分离处理方法汇总
d植物内生菌分离处理方法刘明志。
南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。
热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。
用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。
每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。
幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA固体培养基上培养。
红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。
1刘金花。
黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。
２０１１，３３（４）：２７～３０黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的VA培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。
待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。
2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗 2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用 2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入 75%酒精中浸泡 30 s,接着用无菌水漂洗 3 次, 平放于 NA 平板上, 28 °C培养 2?3 d。
取最后一次漂洗液涂布 NA 平板作为对照。
内生菌分离和纯化。
将 NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1-2 次直到获得纯培养3孙传伯。
苹果内生菌的分离纯化及发酵产物分析
苹果内生菌的分离纯化及发酵产物分析苹果含丰富的碳水化合物、维生素和微量元素、苹果酸、柠檬酸、水溶性膳食纤维（果胶等，在储藏过程或运条件不当的情况下易受微生物性的病害而引起腐败变质，其中酵母菌是常见的病害。
目前对苹果中酵母菌的分离、鉴定研究报道很少，本试验旨在分离和初步鉴定苹果中的酵母菌，并对其进行抑制试验研究，为研究苹果的保鲜和贮藏提供理论依据。
酵母菌分离及其抑菌试验用豆芽汁蔗糖培养基，生化鉴定试验用淀粉培养基、明胶培养基、蛋白陈水培养基、糖发酵培养基、石蕊牛奶培养基。
苹果中酵母菌的分离培养＂采用涂布平板法对样品菌悬液中酵母菌进行分离。
即将苹果菌悬液10倍级进行。
培养特征和形态特征观察：对所分离纯化菌株平板培养后进行培养特征的观察。
取典型菌落涂片，染色后进行显微镜形态观察。
生化鉴定试验：淀粉水解试验、明胶水解试验、石蕊牛乳试验、糖发酵试验、过氧化氢酶试验。
菌种初步鉴定4根据培养特征和形态特征及生化鉴定结果，对典型菌落进行初步菌种鉴定。
抑菌试验肉，取不同浓度的山梨酸和苯甲酸钠溶液，在120℃高压灭菌20min后添加于查氏培养基，然后从腐败部分体积占整体1/2的苹果中分离培养酵母菌，将分离后的酵母菌接种于添加了山梨酸及苯甲酸钠的查氏培养基上，另将酵母菌接种于未添加抑菌剂的查氏培养基作空白对照，培养24 h 后进行活菌菌落记数，计算抑菌率，研究山梨酸和苯甲酸钠对酵母菌的抑制效果。
本试验从苹果中分离到酵母菌4株，初步鉴定为酿酒酵母、出芽短梗霉、产假丝酵母、皮状丝孢酵母。
引起苹果腐败的主要酵母菌是否为此4株，还需进一步研究。
山梨酸和苯甲酸钠对本试验分离4株菌都有很好的抑制效果，其最适抑菌浓度均为0.08%，此浓度在食品安全要求范围之内。
动物内生真菌的分离
动物内生真菌的分离背景介绍动物体内存在着丰富的微生物群落，包括细菌、病毒和真菌等。
其中，真菌是一类具有很高多样性的微生物。
在过去的研究中，我们发现了一些动物体内的内生真菌，它们存在于动物的肠道、皮肤、毛发等部位。
这些内生真菌与我们的身体健康密切相关，可能对宿主的免疫、代谢和生理功能起着重要的调控作用。
因此，分离和研究这些内生真菌对于揭示其在动物体内的功能和潜在应用具有重要意义。
实验设计样本采集首先，我们需要选择合适的动物作为实验对象。
常见的实验动物可以包括小鼠、大鼠、猪等。
在选择动物之前，我们需要考虑动物对于我们研究的真菌的宿主潜力、繁殖能力和实验操作的可行性等因素。
为了保证实验的准确性和可重复性，采集样本时需要严格按照操作流程进行。
在采集样本时，应选择动物体内的特定部位，如肠道、皮肤等，避免对外界环境的干扰。
样本处理样本采集后，需要进行样本处理。
首先，将样本放入无菌离心管中，并加入适量的缓冲液，如PBS。
然后，使用无菌的刀具将样本切碎，以增加真菌与培养基的接触面积。
接下来，将样本搅拌均匀，并使用离心机离心，将真菌与细胞碎片分离。
真菌分离样本处理后，我们需要将真菌分离出来。
可以使用不同的培养基来进行真菌的分离。
常用的培养基有马铃薯葡萄糖琼脂、大豆琼脂等。
将样品取一定量涂抹在培养基上，然后在恒温培养箱中进行孵育。
在培养过程中，需要进行定期观察，记录并观察真菌的生长情况。
可以根据真菌的形态、颜色、生长速度等特征来初步判断真菌的种类。
鉴定和保存对于分离出来的真菌，我们可以进行鉴定和保存。
鉴定可以使用传统的形态学鉴定、生物化学鉴定和分子生物学鉴定等方法。
形态学鉴定包括观察真菌的菌丝、孢子和菌落等形态特征。
生物化学鉴定则通过检测真菌的代谢产物和生理特征来进行鉴定。
分子生物学鉴定可以通过扩增和测序真菌特定的基因或基因片段来确定真菌的种属。
对于已鉴定的真菌，我们可以将其保存在冷冻保存液中，并储存在低温冷冻箱中，以便后续研究的开展。
植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用
生命科学Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８卷 第１期２００６年２月Ｖｏｌ． １８， Ｎｏ． １Ｆｅｂ．， ２００６植物内生细菌的分离冯永君＊植物内生细菌已成为国内外的研究热点其中有的具有促生与防治病害等对宿主植物有利的作用发现了有意义的定殖规律目前但它在农业上的巨大应用潜力业已彰显内生细菌； 共生定殖； 生物防治中图分类号２００５－０８－０１国家自然科学基金（Ｎｏ．３０４００００２）作者简介男杨新芳本科冯永君（１９７３男副教授１００４－０３７４（２００６）０１－００９０－０５人们已认识到化肥和农药在农业应用中的弊端而存在于土壤中或植物体内的具有控制病害与促生增产潜力的微生物将可能成为一个有效选择能够定殖在健康植物细胞间隙或细胞内绝大部分内生细菌对植物不造成实质性危害植物内生细菌在自然界中广泛存在它们在植物体中的数量很大而且它们的生物学功能多种多样［２￣６］国内外有关研究报道不断增加生物学功能以及定殖过程鉴定与分类自２０世纪中叶起９１第１期卢镇岳植物内生细菌的分离国内虽起步较晚富贵竹马尾松主要有以下几个属假单孢菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）其中属于芽孢杆菌属的菌株数在多种植物中都为最多一般在植物根部与种子中内生细菌的含量比较高有的根部最多马冠华例如一些地区常下酸雨体内内生细菌的总数以及各组织内的内生细菌数会有所变化内生细菌分离与鉴定的方法一般都依赖于传统的平板培养方法也容易普及因而不能准确判断植物内生细菌的数量与种类利用非培养方法检测微生物种群的技术应用于植物内生细菌研究对于现已分离得到的植物内生细菌后者指能在植物根际与土壤中分离得到而且种类居多第一类对植物的作用是中性的第二类对植物生长发育有促进作用或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等但需要注意的是了解这些关系不仅有利于认识植物内生细菌在自然生态环境中的地位能抑制宿主植物病原菌生长的内生细菌王万能和肖崇刚［２４］从烟草根部分离的内生细菌１１８菌株能防治烟草黑胫病［２４］； 龙良鲲等［１１］从番茄健康植株根内分离获得的２３９株内生细菌中有１８株能在平板培养中拮抗番茄青枯病菌国内外对棉花内生细菌的研究相对较多其中包括能拮抗根腐菌的假单胞菌属一些菌株和拮抗黄曲霉菌的洋葱假单胞菌（Ｐｓ． Ｃｅｐａｃｉａ）辣椒与哈密瓜等植物中也分离到多株具有防治病原菌能力的内生细菌２．２植物内生细菌对宿主植物有直接促生作用细菌定殖于宿主植物体内便能获得独特的微生态环境进行生长繁殖［２８］固氮细菌定殖于植物体内的独特微生态环境中能免受氧气等不利因素的影响并已从多种非豆科植物中分离到具有固氮能力的内生细菌Ｋａｌｌａｒ草以及多种谷类与能形成块茎的植物其固氮酶活性能达到一种典型根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）的２５％ ［３０］固氮基因ｎｉｆ在根瘤菌与这些固氮内生菌中是保守的然而不同固氮内生细菌采取不同的调控方式控制固氮酶的活性［３１￣３４］Ｅｇｅｎｅｒ等［３１］研究结果证明其中包括利用菌落的结构笔者研究表明并万方数据92生命科学第１８卷发现在该结构下ＹＳ１９会诱导表达出单体菌不具有的蛋白Ｐａｎ和Ｖｅｓｓｅｙ［３０］报道指出沈德龙等［３５］已证明水稻内生成团泛菌ＹＳ１９能分泌四种不同的植物生长激素一些固氮内生细菌同时具备分泌具有促生作用激素的能力［３３］具备收留有抗病促生作用的细菌作为内生细菌能力的植物由于植物内生细菌是普遍存在的袁红旭等［１２］从四个品种富贵竹茎叶中分离出６４个内生细菌谈家金等［３６］从健康马尾松茎部分离到一株内生细菌坚强芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ） ＧＤ２能诱发松材线虫病３植物内生细菌对宿主植物的侵染与定殖利用植物内生细菌作为生物制剂对植物进行生物预处理的确存在广阔的应用前景他们在实验中发现证明内生细菌能定殖在处于发育早期的植物中而是能在植物体内不同部位转移的研究了该菌对水稻的定殖情况在新根与根尖部分定殖的量比较高国内一些研究人员采用抗性基因标记的植物内生细菌也进行了类似的研究该菌对小麦纹枯病有明显的防治效果并能向茎基部用Ｂ９４６菌悬液浸种处理还发现细菌能定殖于根细胞间也能定殖于根细胞内而且对特定部位有所偏好该菌对番茄的青枯病具有防治作用且在根内的定殖能力大于茎内其定殖数量动态在根茎内均有一个但其在根内的数量变化明显较茎内平缓其对宿主的选择存在一定的专一性其结果表明并有明显的固氮能力其定殖能力之间也有区别他们使用ｇｆｐ基因对研究用细菌进行标记该泛菌与该苍白杆菌都能在植物胞间进行定殖内生细菌定殖不仅仅受植物品种与另一而且还受Ｒｅｍｕｓ等［４４］利用酶联免疫吸附的方法进行观察在植物液体培养的情况下内生细菌对植物的定殖能发生在发育的早期并且定殖的细菌在不同组织之间具有一定的流动性利用了不同的内生细菌标记与检测方法是一种传统而实用的方法９３第１期卢镇岳植物内生细菌的分离精度很低即把能使细菌发色的基因或常用的绿色荧光蛋白基因导入菌体冯永君和宋未［４５］已证明ＧＦＰ能在成团泛菌ＹＳ１９中稳定表达使用绿色荧光蛋白时需要使用特别波长激发的荧光蛋白［３７］人们越来越多意识到一个新的问题这些化学物质能诱导细菌发生特定的行为植物接受反馈信息后会再次产生新的信号通常对根际微生物与植物信号交流的深入研究会对揭示内生细菌定殖的起始步骤有重要作用植物内生细菌应用于农作物的病害防治与促生有明显的效果［１￣７］早在１９８６年已证明在水稻等５０多种植物上有增产抗旱成团泛菌 ＣＰＡ－２最初分离自苹果表面ＣＰＡ－２作为生物制剂的研究比较成熟其中包括温度认为竞争营养物是其中一种防治机制Ｔｅｉｘｉｄó等［５０］研究ＣＰＡ－２与碳酸盐联用作为防治手段的效果而且此浓度下的碳酸盐并不影响ＣＰＡ－２的生长是否能在合适的条件下进行培养可否与现有的安全可靠的防治手段联用分离内生细菌时所使用的植物体表灭菌方法对分离效果的影响内生细菌可能诱导宿主植物产生对人畜不利的性状还应该充分了解该菌的侵染因为一些内生细菌对于某些植物是有益或是无害的限制其传播是十分必要的而微生物的情况会更严重得多把一种微生物引入一个新的生态系统有可能影响很多土著微生物的生长内生菌的分离再回接我们对植物与微生物之间的关系不再是简单理解为生产者与分解者还可能帮助我们揭开植物研究中的某些谜团认识的持续提高ｇｅｎｅｔｉｃ， ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ． ＦＥＭＳ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ， ２０００， ２４： ４８７￣５０６万方数据94生命科学第１８卷［９］Ｓｔｕｒｚ Ａ Ｖ， Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｂ Ｒ， Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｂ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｈｉｃｈ ｃｏｌｏｎｉｚｅ ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ ｎｏｄｕｌｅｓ，ｒｏｏｔｓ， ｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｆｏｌｉａｇｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｈｏｓｔ ｇｒｏｗｔｈ．Ｂｉｏｌ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｏｉｌｓ， １９９７， ２５： １３￣１９［１０］Ｄｏｎｇ Ｚ Ｍ， Ｃａｎｎｙ Ｍ Ｊ， ＭｃＣｕｌｌｙ Ｍ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ ｏｆ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｓｔｅｍｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９４，１０５： １１３９￣１１４７［１１］龙良鲲， 肖崇刚， 窦彦霞． 防治番茄青枯病内生细菌的分离与筛选． 中国蔬菜， ２００３， ２： １９￣２１［１２］袁红旭， 周立赖， 周锦兰， 等． 富贵竹内生细菌群落的生物效应研究． 中国生态农业学报， ２００５， １３（１）： ９５￣９７［１３］芦云， 罗明． 哈密瓜内生细菌的分离及拮抗菌的筛选．石河子大学学报， ２００４， ２２：１０４￣１０９［１４］邱思鑫， 何红， 阮宏椿， 等． 具有抑菌促生作用的植物内生细菌的筛选． 应用与环境生物学报， ２００４， １０（５）：６５５￣６５９［１５］何红， 蔡学清， 洪永聪， 等． 辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选． 中国生物防治， ２００２， １８（４）： １７１￣１７５［１６］崔林， 孙振， 孙福在， 等． 马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定． 植物病理学报， ２００３， ３３（４）：３５３￣３５８［１７］罗明， 芦云， 张祥林． 棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选． 新疆农业科学， ２００４， ４１（５）： ２７７￣２８２［１８］兰海燕， 王长海， 宋荣． 棉花内生细菌及其研究进展． 棉花学报， ２００３， １２（２）： １０５￣１０８［１９］高增贵， 庄敬华， 陈捷， 等． 玉米根系内生细菌种群及动态分析． 应用生态学报， ２００４， １５（８）： １３４４￣１３４８［２０］李庚花鉴定及其分布特性． 植物学报， １９９９， ４１（９）：９２７￣９３１［２３］刘云霞， 张青文． 周明牂． 水稻体内细菌的动态研究． 应用生态学报， １９９９， １０（６）： ７３５￣７３８［２４］王万能， 肖崇刚． 烟草内生细菌１１８防治黑胫病的机理研究． 西南农业大学学报， ２００３， ２５（１）： ２８￣３１［２５］吴加志， Ｐｌｅｂａｎ Ｓ， Ｃｈｅｒｎｉｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． 植物土传ｓｗｉｔｃｈ－ｏｆｆ－ｌｉｋｅ ｓｉｇ－ｎａｌ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｏｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｍｔＢ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｆ ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｎｉｔｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉ－ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮｉｆＨ ｉｎ Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＢＨ７２． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ，２００２， １８４（８）： ２２５１￣２２５９［３３］Ｈｕｒｅｋ Ｔ， Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－Ｈｕｒｅｋ Ｂ， Ｔｕｒｎｅｒ Ｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｇｍｅｎｔｅｄｒａｔｅｓ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｔ ｎａｎｏｍｏｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏ２ ｉｎ ｈｙｐｅｒｉｎｄｕｃｅｄ Ａｚｏａｒｃｕｓｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＢＨ７２． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １９９４， １７６（１５）： ４７２６￣４７３３［３４］Ｍｏｎｔｅｉｒｏ Ｒ Ａ， ｄｅ Ｓｏｕｚａ Ｅ Ｍ， Ｙａｔｅ Ｍ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｆｎｒ ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅＮ－ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＮｉｆＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｂｉｏｌ， ２００３， ６９（３）： １５２７￣１５３１［３５］沈德龙， 冯永君， 宋未． 内生成团泛菌ＹＳ１９对水稻乳熟期光合产物在旗叶植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用作者：卢镇岳， 杨新芳， 冯永君， LU Zhen-Yue， YANG Xin-Fang， FENG Yong-Jun作者单位：北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081刊名：生命科学英文刊名：CHINESE BULLETIN OF LIFE SCIENCES年，卷(期)：2006,18(1)被引用次数：24次1.冯永君;宋未植物内生细菌[期刊论文]-自然杂志 2001(05)2.杨海莲;孙晓璐;宋未植物内生细菌的研究 1998(04)3.韩继刚;宋未植物内生细菌研究进展及其应用潜力[期刊论文]-自然科学进展 2004(04)4.刘云霞植物内生细菌的研究与应用 1994(05)5.文才艺;吴元华;田秀玲植物内生菌研究进展及其存在的问题[期刊论文]-生态学杂志 2004(02)6.孔庆科;丁爱云内生细菌作为生防因子的研究进展[期刊论文]-山东农业大学学报(自然科学版) 2003(02)7.阎孟红;蔡正求;韩继刚植物内生细菌在防治植物病害中的应用研究[期刊论文]-生物技术通报 2004(3)8.Steenhoudt O;Vanderleyden J Azospirillum,a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated withgrasses:genetic,biochemical and ecological aspects[外文期刊] 2000(4)9.Sturz A V;Christie B R;Matheson B G Biodiversity of endophytic bacteria which colonize red clover nodules,roots,stems and foliage and their influence on host growth[外文期刊] 1997(1)10.Dong Z M;Canny M J;McCully M E A nitrogenfixing endophyte of sugarcane stems 199411.龙良鲲;肖崇刚;窦彦霞防治番茄青枯病内生细菌的分离与筛选[期刊论文]-中国蔬菜 2003(02)12.袁红旭;周立赖;周锦兰富贵竹内生细菌群落的生物效应研究[期刊论文]-中国生态农业学报 2005(01)13.芦云;罗明哈密瓜内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[期刊论文]-石河子大学学报（自然科学版） 2004(z1)14.邱思鑫;何红;阮宏椿具有抑菌促生作用的植物内生细菌的筛选[期刊论文]-应用与环境生物学报 2004(05)15.何红;蔡学清;洪永聪辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[期刊论文]-中国生物防治 2002(04)16.崔林;孙振;孙福在马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定[期刊论文]-植物病理学报 2003(04)17.罗明;芦云;张祥林棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选[期刊论文]-新疆农业科学 2004(05)18.兰海燕;王长海;宋荣棉花内生细菌及其研究进展[期刊论文]-棉花学报 2003(02)19.高增贵;庄敬华;陈捷玉米根系内生细菌种群及动态分析[期刊论文]-应用生态学报 2004(08)20.李庚花;杨民和;蒋军喜茄科植物内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[期刊论文]-江西植保 2005(01)21.马冠华;肖崇刚烟草内生细菌种群动态研究[期刊论文]-微生物学杂志 2004(01)22.杨海莲;孙晓璐;宋未水稻内生联合固氮细菌的筛选、鉴定及其分布特性[期刊论文]-植物学报 1999(09)23.刘云霞;张青文;周明牂水稻体内细菌的动态研究 1999(06)24.王万能;肖崇刚烟草内生细菌118防治黑胫病的机理研究[期刊论文]-西南农业大学学报(自然科学版) 2003(01)25.吴加志;Pleban S;Chernin L植物土传、根际和内生细菌用于植物病害生物防治潜力的研究 1996(03)26.杨海莲;孙晓璐;宋未植物根际促生细菌和内生细菌的诱导抗病性的研究进展[期刊论文]-植物病理学报 2000(02)27.苗则彦;赵奎华;刘长远我国植物内生细菌对病虫害防治研究现状[期刊论文]-辽宁农业科学 2003(6)28.王万能;全学军;谢应宇植物病害生物防治与微生态学[期刊论文]-中国植保导刊 2005(03)29.Baldani J I;Vera L C;Baldani L D Recent advances in BNF with non-legume plants[外文期刊] 1997(05)30.Pan B;Vessey J K Response of the endophytic diazotroph Gluconacetobacter diazotrophicus on solid media to changes in atmospheric partial O2 pressure 2001(10)31.Egener T;Martin D E;Sarkar A Role of a ferredoxin gene cotranscribed with the nifHDK operon in N2 fixation and nitrogenase:"switch-off" of Azoarcus sp.strain BH72[外文期刊] 2001(12)32.Martin D E;Reinhold-Hurek B Distinct roles P Ⅱ-like signal transmitter oroteins and amtB in regulation of nifgene expression,nitrogenase activity,and posttranslational modification of NifH in Azoarcus sp.strain BH72[外文期刊]2002(08)33.Hurek T;Reinhold-Hurek B;Turner G L Augmented rates of respiration and efficient nitrogen fixation at nanomolar concentrations of dissolved O2 in hyperinduced Azoarcus sp.strain BH72 1994(15)34.Monteiro R A;de Souza E M;Yate M G Fnr is involved in oxygen control of Herbaspirillum seropedicae N-truncated NifA protein activity in Escherichia coli[外文期刊] 2003(03)35.沈德龙;冯永君;宋未内生成团泛菌YS19对水稻乳熟期光合产物在旗叶、穗分配中的影响[期刊论文]-自然科学进展-国家重点实验室通讯 2002(08)36.谈家金;向红琼;冯志新马尾松内生细菌与松材线虫病关系的初步研究[期刊论文]-植物病理学报 2003(05)37.Coombs J T;Franco C M M Visualization of an endophytic Streptomyces species in wheat seed[外文期刊] 2003(07)38.Gyaneshwar P;James E K;Mathan N Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens[外文期刊] 2001(08)39.刘忠梅;王霞;赵金焕有益内生细菌B946在小麦体内的定殖规律[期刊论文]-中国生物防治 2005(02)40.杨海莲;孙晓璐;宋未水稻内生阴沟肠杆菌的定殖研究[期刊论文]-自然科学进展 1999(12)41.龙良鲲;肖崇刚内生细菌01-144在番茄根茎内定殖的初步研究[期刊论文]-微生物学通报 2003(05)42.Elbeltagy A;Nishioka K;Sato T Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillumsp.isolated from wild rice species[外文期刊] 2001(11)43.Verma S C;Singh A;Chowdhury S P Endophytic colonization ability of two deep-water rice endophytes,Pantoea sp.and Ochrobactrum ing green fluorescent protein reporter[外文期刊] 2004(5)44.Remus R;Ruppel S;Jacob H J Colonization behaviour of two enterobacterial strains on cereals[外文期刊] 200045.冯永君;宋未水稻内生优势成团泛菌GFP标记菌株的性质与标记丢失动力学[期刊论文]-中国生物化学与分子生物学报 2002(01)46.Sabaratnam S;Beattie G A Differences between Pseudomonas syringae pv.syringae B728a and Pantoea agglomerans BRT98 in epiphytic and endophytic colonization of leaves[外文期刊] 2003(02)47.Bais H P;Park S W;Weir T L How plants communticate using the underground information superhighway[外文期刊] 2004(01)48.Costa E;Usall J;Teixidó N Water activity,temperature,and pH effects on growth of the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA-2[外文期刊] 2002(12)49.Poppe L;Vanhoutte S;Hofte M Modes of action of Pantoea agglomerans CPA-2,an antagonist of postharvest pathogens on fruits[外文期刊] 2003(9)50.Teixidó N;Usall J;Palou L Improving control of green and blue molds of oranges by combining Pantoea agglomerans (CPA-2) and sodium bicarbonate[外文期刊] 2001(7)1.韩继刚.宋未植物内生细菌研究进展及其应用潜力[期刊论文]-自然科学进展2004,14(4)2.冯永君.宋未植物内生细菌[期刊论文]-自然杂志2001,23(5)3.罗明.芦云.张祥林棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选[期刊论文]-新疆农业科学2004,41(5)1.游玲.魏琴.郭华.张云山苍子（Litsea cubeba）可培养内生细菌的多样性[期刊论文]-西北农林科技大学学报：自然科学版 2012(4)2.易婷.缪煜轩.冯永君内生菌与植物的相互作用:促生与生物薄膜的形成[期刊论文]-微生物学通报 2008(11)3.冯永君.何晴植物内生细菌的生物薄膜(biofilm)[期刊论文]-生命的化学 2007(1)4.陈宜涛.王伟剑植物内生菌的研究进展[期刊论文]-现代生物医学进展 2009(16)5.王涛.游玲.崔晓龙.田文.黄乃耀.李欣龙油樟内生芽孢细菌的系统发育多样性[期刊论文]-微生物学报 2009(5)6.张淑卿.李剑峰.师尚礼苜蓿生育过程中植株体内内生根瘤菌的运移动态[期刊论文]-农业科学与技术（英文版） 2009(4)7.张淑卿.李剑峰.师尚礼苜蓿繁殖器官发育过程与内生根瘤菌侵染数量的关系[期刊论文]-江苏农业学报 2009(5)8.王涛.游玲.魏琴.崔晓龙油樟内生细菌的多样性及抑制植物病原茵初步研究[期刊论文]-西北林学院学报 2009(2)9.王振跃.汪敏.高书锋.张猛.袁虹霞.李洪连温室黄瓜叶部微生物区系[期刊论文]-生态学杂志 2008(3)10.王振跃.刘延红.高书锋.袁虹霞.李洪连黄瓜叶围放线菌的分离及其对灰霉菌抑菌效果测定[期刊论文]-河南农业科学 2007(11)11.许乐.阮小蕾.李冬丽.李华平对枯萎病不同抗性的香蕉品种的内生细菌多样性及群落结构[期刊论文]-微生物学通报 2012(9)12.王玉凤.宋艳祥.张汀.刘大群.冉隆贤小麦叶锈病生防菌株的筛选[期刊论文]-河北农业大学学报 2011(3)13.王靖.黄云.张艳.姚佳油菜根肿病菌拮抗微生物的筛选及其防治效果测定[期刊论文]-中国油料作物学报 2011(2)14.张铎.解莉.张丽萍.赵宝华棉花黄萎病生物防治研究[期刊论文]-安徽农业科学 2007(11)15.李剑峰.张淑卿.师尚礼.霍平慧苜蓿内生根瘤菌分布部位与数量变化动态[期刊论文]-中国生态农业学报 2009(6)16.李欣龙.王涛.游玲.杨学贵.黄乃耀香樟内生细菌抑制植物病原真菌及对纤维素利用初步研究[期刊论文]-西南大学学报(自然科学版) 2009(2)17.张巍波.缪煜轩.冯永君成团泛菌YS19 symplasmata结构对菌体抵抗逆境的作用[期刊论文]-微生物学杂志 2009(1)18.王松.游玲.李涛.魏琴.王涛香樟产芽孢内生细菌的系统发育多样性[期刊论文]-微生物学通报 2010(8)19.孙侨南.李进才小麦内生细菌对全蚀病发生的影响[期刊论文]-天津农业科学 2008(5)20.常慧萍植物内生细菌及其开发与应用[期刊论文]-濮阳职业技术学院学报 2008(1)21.管珺.胡永红.杨文革.倪珏萍.马海军蜡样芽孢杆菌防治植物病虫害的研究进展[期刊论文]-现代农药 2007(4)22.刘姮.李银姣.邓汉斌棉花黄萎病的综合防治[期刊论文]-湖北植保 2011(6)23.卡依尔·玉素甫.谢仁娜依·甫拉提.玛丽帕·吐达洪1.马丽艳木·阿木东.艾尼江·尔斯曼.祖母拉提·阿布都热依木.艾尔肯·热合曼Ugan古河道胡杨可培养内生细菌的多样性[期刊论文]-微生物学报 2011(2)24.马元武.陈翠翠.何晴.冯永君周质空间蛋白的抗逆机制[期刊论文]-自然科学进展 2008(8)本文链接：/Periodical_smkx200601020.aspx。
水果内生真菌的分离
水果内生真菌的分离1.研究背景水果是人们日常饮食中不可或缺的一部分，但水果内生真菌对人体健康构成潜在的威胁。
因此，对水果内生真菌进行分离和鉴定具有重要意义。
研究水果内生真菌的分离方法和过程，有助于了解水果贮藏、运输、销售中的安全性，并提供科学依据和控制策略。
2.分离方法2.1 样本选择为了获得准确的结果，样本选择是非常关键的。
样品应该选择有一定病害和腐败现象的水果，以增加内生真菌分离成功的概率。
2.2 分离培养基的制备制备适合分离水果内生真菌的培养基是成功分离的前提。
通常可以选择富含碳水化合物、氮源、矿物质和微量元素的琼脂、玉米粉、葡萄糖、酵母浸膏等成分制作培养基。
2.3 分离方法分离方法的步骤如下：1.将样品表面进行消毒处理，可以使用75%酒精或10%次氯酸钠溶液进行消毒。
2.将消毒后的样品切割成均匀大小的块状，将其置于分离培养基中。
3.孵育培养皿于适宜的温度下，通常在25-30摄氏度的条件下培养。
4.观察培养皿中是否出现真菌菌丝。
5.通过分离菌丝，单独分离出水果内生真菌。
2.4 真菌鉴定成功分离出水果内生真菌后，需要进行鉴定，以确定其属于哪种真菌。
鉴定可以采用形态学观察和分子生物学方法，如PCR技术、基因测序等。
3.结果分析通过对不同水果样品进行分离和鉴定，可以得到以下结果：1.不同种类的水果中存在多种内生真菌。
2.水果的贮藏条件和存放时间对内生真菌分离率和种类有一定影响。
3.水果内生真菌的种类和数量与水果的品质和健康有关，对水果安全的评估起着重要的作用。
4.意义与应用水果内生真菌的分离和鉴定研究对水果贮藏、运输和销售具有重要意义和应用价值：1.为水果种植和贮藏提供科学指导，减少内生真菌的滋生。
2.为消费者提供更安全的水果选择，增加消费者信心。
3.为水果贸易提供技术支持，推动水果贸易发展。
5.结论水果内生真菌的分离和鉴定是一项具有重要意义的研究，可以提供为水果贮藏、运输和销售提供指导，并保障消费者的健康和安全。
内生菌的分离方法及其次级代谢产物研究
其 生活史 的一 定 阶段或全 部 阶段 生 活于健 康植物各
种 组织 和器官 内部 或 细 胞 间 隙 的真 菌或 细 菌 ， 被感 染 的宿 主植物 （ 至少 是暂 时 ） 不表 现 出外 在症 状 。 内生菌 一般会 产 生一些 在 微生 物 一宿主关 系 中发 挥
为 人们所 忽 视 。最 初 内生 菌 （ ｎ ｏ ｈ ｔ） 概 念 是 Ｅ ｄｐ ｙｅ 的
针 对病原 菌 （ ａｈｇｎ 提 出 来 的 。１ ３ Ｐ ｔｏｅ ） ８ ３年 ， 们 人 发 现从小 麦 叶片 中可 长一 种 性 质 不 明 的锈 状 物 ， 将 它形 象地 称为 Ｏ ｔ ｏ ｓ ｕ ｒｗ 。经进 一 步研 究 ， １４ ｇ 到 ６年 ８ Ｌ ｖｉｅ 定 ， ｅｅｌ确 ｌ 这种 Ｏ ｔ ｏ ｓ 真菌 的一 种 结 构 ， ｕｇ ｗ 是 ｒ 即 现 在所说 的锈菌 夏 孢子 ， 是 最 早 的植 物 内生 菌 报 这
菌 ， 针 叶类 植物 的树 皮 、 叶 内分离 和鉴定 出多种 从 枝
内生 真菌 ， 多种 草本 植 物 、 培 植物 、 树 和蕨类 在 栽 果 植物 中也发现 了多种 内生真菌类 群 。 。本 实验室 也从 苔藓类 植物 中分离 到多株 内生 菌 。
１２ 植 物 内生菌 的分离 ．
生菌 一般采用平 板分 离法 。
鉴定 了其 中一株是 Ａ ｐｒｉｕ ｉｕ ｎ ， ｓｅ ｌ ｓｎ ｌ ｓ 另外 一株 为 ｇｌ ｄ ａ Ａ ｐ ｒｉｕ ｔＺｅ ｓｅｇ ｌ Ｏｆａ 。巴西 学 者 Ｌ Ｄ Ｓ ｔ ｌｓ ｎ ． ． ｅ ｅ等¨ ｔ 用 分 子生物学 手 段 对 巴西 环境 和工 业微 生 物 保 藏 中心 （ Ｂ Ｉ 的咖 啡 树 内生 丝 状真 菌 进 行 了分类 及 抗 Ｃ ＭＡ ）
内生菌分离与鉴定
内生菌分离与鉴定内生菌是人体和动物体内与其共存的一类细菌，它们与宿主有着千丝万缕的联系，并且对宿主的健康有着显著的影响。
然而，因为人们对内生菌的认知非常有限，因此，内生菌的分离和鉴定就变得尤为重要和迫切。
分离内生菌包括众多步骤，如分离、萃取、纯化、活性测试、形态特征测定、抗菌试验、荧光打印等。
最先进的技术通常采用热抽提液体状菌株（LRS），并且可以在室温和限制的湿度条件下分离获得最纯的样品。
抽提液体菌能够有效地避免细菌传播，同时也能够有效增加细菌的丰度。
在传统的鉴定方法中，最常采用的是质萃取，它能够增加培养基的密度以及细菌的分离效率，从而可以有效地提高内生菌的收集率。
此外，质萃取还能够抑制情报细菌的生长，从而有助于内生菌的纯度。
另外，细菌的分离和鉴定也可以通过细菌杂交、PCR（聚合酶链反应）和荧光原位杂交（FISH）来实现。
细菌杂交是一种早期被开发出来的技术，可以有效地为研究者找出不同细菌中的特定DNA序列。
而PCR是一种形式丰富的技术，能够检测细菌的基因组组成，以及细菌的基因序列。
而FISH是一种有效地检测和分类细菌的有用技术，它可以有效地从其他细菌中隔离内生菌株。
最近的技术正在发展出可以有效检测细菌的分子克隆技术。
这项技术可以分析细菌的基因组，从而可以更准确地识别和鉴定目标样品中的内生菌。
此外，分子克隆技术还能够有效构建微生物群落，以便更客观地评估内生菌的群落结构，并且它还可以有效地分析内生菌的变化情况。
总之，分离和鉴定内生菌是一个复杂的过程，它可以有效地帮助研究者了解动物和人体内部的内生菌组成，以及它们如何影响宿主的健康状况。
因此，未来在内生菌分离和鉴定方面的研究将越来越受到重视，以深化我们对内生菌的认识和理解。
植物内生真菌分离培养的研究方法
王利娟等： 植物内生真菌分离培养的研究方法
: 8
水冲洗表面残留的消毒剂。家庭用的 ! " # $ %漂 白剂用水稀释至& ’! ( ) ’ 就是最常用的表面消
［ ］ & 毒剂 ， 由于商业次氯酸盐溶液浓度、 可用有效
有时将表面活性剂 （如 ; ） 和消毒剂结合 < 2 2 . = > ) 使用， 消毒后将组织在无菌水或 8 ) ’! 9 : ’ 的乙 醇中浸泡(? 6 .以除去残留的消毒剂。其他的消 毒剂在内生菌研究中并不常用， 包括硝酸银、 氯化 汞 （升汞） 、 福尔马林 （甲醛水溶液） 、 乙醇或丙烯氧 化物。由于升汞的毒性残留以及对自然环境的破 坏作用， 现在国外很少使用， 而是使用一些具有相
高等植物是复杂多样的， 它为各种各样的微 生物提供生存环境。这些微生物中主要是真菌， 有的生活在叶和嫩枝等的表面 （称为表生菌） ， 有 的生活在叶内部组织中 （称为叶内生菌） ， 有的则 生活在树皮中 （称为树皮内生菌） ， 还有的生活在 木材中 （如木质部内生菌和木材腐生菌） 。健康植 物内部组织的内生菌引起越来越多科学家的兴 趣， 从目前己经研究过的植物来看， 可以推断内生 真菌在植物体内是普遍存在的。通过对内生真菌 和宿主专一性分析， 平均每种宿主有! * 种专性 内生真菌， 按地球上有 " 内生真 * 万种植物计算， 菌总数可能超过 # $ $
［ ］ ’ 根菌和假菌根菌） 应属于内生菌 。目前， 关于内
等植物很可能是隐匿着未知真菌的宝库。本文主 要从! 个方面对内生真菌的研究方法进行了简要 综述。
> 植物内生真菌的定义
要弄清内生真菌的定义， 首先要明白内生菌
生菌的概念范畴仍有很大的争议， R = A @ 2 7 2提出的 ［ ］ ’ 内生菌概念被广泛接受 。 植物内生菌包括内生细菌、 内生放线菌和内 生真 菌 。 然而， 过 去’ $ 6中 ， = 7 F G < A =和= 7 F G 3 J K
内生菌分离与鉴定
内生菌分离与鉴定内生菌是一类重要的细菌，在人体内有着重要的生物学作用，如参与营养、抗疾病、维持生理功能等，可以改善人体健康状况，从而为人类提供有益的服务。
然而，在不同的环境和条件下，内生菌存在着差异性。
因此，有必要通过内生菌的分离和鉴定，来掌握这些细菌的生物学特性，以便依此应用于相应的生物领域。
内生菌的分离与鉴定包括多种步骤，在此过程中，必须使用大量的实验工具和技术，以确保分离过程的高效性和准确性。
首先，根据不同的细菌种类，对病原微生物进行预处理，包括萃取、培养、分离和清洗等。
其次，使用膜过滤法将目标微生物从其他杂质中分离出来，以节约实验时间，提高实验效率。
再次，通过检测膜的细菌学特性，进行细菌的组织型判断。
最后，结合实验室技术检测手段，如血清学、发酵学、酶学等，进行内生菌的有效鉴定，以全面掌握病原菌的形态、营养特性、生物活性、药物敏感性等特征，从而为临床诊断和治疗提供依据。
此外，内生菌分离与鉴定是一个复杂的过程，其关键是高效分离。
因此，在培养过程中，需要采用单菌特异性培养基，以便于避免其他非目标菌的阻碍，从而更有效地分离出理想的菌株。
此外，内生菌在培养过程中，也要求有足够的氧气，以满足微生物的生长和发酵，特别是对于大量杂质较多或高温环境下会影响微生物的发酵，显微法拍摄时也要给予足够的补光，以减少影响。
最后，内生菌的分离与鉴定需要采用大量的实验技术和技术，同时要求严格控制实验过程，以确保实验数据的准确性和可靠性。
只有在这种前提下，才能充分发掘内生菌的生物学特性，并有效应用于相关的生物学研究和应用中，从而为人类健康服务。
总之，内生菌分离与鉴定是一个需要仔细规划，精密操作，以达到更高效，更准确的目的的过程。
它依赖于实验技术和设备，精确检测细菌的生物性质，从而为有效分离和辨认病原菌提供科学依据，为增强人体免疫力和抗疾病提供可靠的药物和技术支持，从而起到促进健康的重要作用。
春兰内生菌的分离和纯化
春兰以其色雅 味甜、形美气清而深受人们的青 睐 ，江 浙 等地 已将 此 作为 产业 化发 展 和经 济增 长 的
基 金 项 目： 南 通 市农 业科 技 创 新 项 目（ Ｉ － Ｉ Ｌ ２ ０ １ １ ０ ３ １ ） 。
Ｅ－ ｍａ ｌ： ｒ ｗｗ ｗ ｙ ｚ ｕ ＠１ ２ ６ ． ｃ ｏ ｉ ｎ 。
重要支 撑点 。 普通 老 百姓虽 然 喜爱 兰花 ， 但 面对高 昂
的价格 ， 只 能望 兰兴 叹 。随着 现代科 学技术 的发展 ， 运 用科 学栽 培管理 技 术养 兰花 ，提高 了兰花 的 自然 繁殖率 ，使 得更多 的人 可 以在 家里欣 赏到喜 爱的兰 花， 尤其 是 现代 生物技 术 的发 展 ， 兰 花的组织 培养获
上 海蔬 菜
・
Ｓ ＨＡ ＮＧ ＨＡ Ｉ ＶＢ ＧＥ ＴＡ Ｂ Ｌ Ｅ Ｓ
２ ０ １ ３ （ ５ ） ： ７ ８ ￣ ７ ９
瓜 果 花草 ・
春 兰 内 生 菌 的 分 离 和 纯 化 水
吴 雯 雯 ，
（ 江苏省南通农业 职业技术学 院
陆 兵 ，
张 小 强
２ ２ ６ ０ ０ ７ ； 南通农业生物技术重点实验室 ； 扬州大学实验农 牧场 ）
植 物 内生菌是 指 整个 生 活史 或生 活史 的某 一 阶 段 生长 在植 物组 织细 胞 间隙 或细 胞 内而不 引起 明 显
病 害症状 的微 生物 。植 物 内 生菌是 一 个多 样性 十分 丰富 的微生 物类 群 ， 大量研 究 结果 表 明 ， 内生菌 在植 物 体 内 占据 有利 生 防的生 态位 ， 具 有抗 病 虫害 、 植物
内生菌的分离
三、实验材料
1. 植物
黄瓜(Cucumis sativus) 、甘蓝 (Brassica0leracea)、百慕大草(Bermuda grass)的茎、小麦、番茄、辣椒、油菜、杂草， 花生(Archis hypogaea)果仁、已从黄瓜、甜菜
新途径，具有极大的应用价值和开发潜力。
二、实验原理
本实验采用组织块法和组织悬液稀释 法分离内生菌，通过改良的培养基筛选内 生真菌，其中部分内生真菌能够产生与宿 主相同或相似的药用活性成分。 内生菌系统地分布于植物体根、茎、叶、 花、果实和种子等器官、组织的细胞或细
胞间隙。内生真菌（endophytic fungi）菌
2．分离方法: ⑴内生细菌
表面灭菌: 将块茎用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用 75%的乙醇和次氯酸钠（有效cl-10%）分别进行表面消毒五分钟， 再用无菌水漂洗块茎三次。为了检验表面灭菌的效果，用灭菌过的 镊子夹住块茎,使其表面与固体平板接触3～5 min，然后将培养皿 放在22℃～25℃的温箱中培养3～5d。若发现皿中无菌落出现，证 明该块茎表明灭菌彻底，否则，该分离结果不能使用。
4 . 内生菌放线菌的分离
4 . 内生菌的分离
植物组织内部表面消毒方法包括用次 氯酸钠、环氧丙烷气、过氧乙酸、升汞、硝 酸银等消毒剂清洗，还有人用乙醇烧或者直
内生放线菌的选择性分离主要通过在植物材料表面消
毒后，使用不同的培养基和在培养基中添加不同的抗生素
来实现。这些选择剂的添加是必要的。因为内生真菌的生
（3）高氏 1 号培养基（可溶性淀粉 20g，KNO3 1.0g ，K2HPO4 0.5g ，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水 1000mL，琼脂 15g，pH 7.2～7.4）。
薄荷内生细菌和内生真菌的分离
菌， 需要对消毒效果进行 验证， 本研 究采用 了组织印迹检查法 和最 后一次漂洗液检查法来验证所采用的消毒条件是否合理 。另外， 在
１ ． １ 材料来源 。 薄荷 ， 采 自重庆市涪 陵区， 选取地上生长健康的 内生菌 的分离过程 中， 所 用培养基均为常规分离 用的培养基 ， 因而 薄荷菌株 ， 全株取样 后放入塑料袋 中 ， 带回实验室 冲洗干净 ， １ ２小 不 能保证 所有生活在薄荷组织 内的微 生物 全被分离 出来 ，可能有
薄荷 内生细菌 和 内生真菌 的分离
李 玲玲
（ 重庆工贸职业技术学院 生物化学工程 系）
【 摘要 】 选取健 康的 薄荷 植株 用流水 冲洗表面 灭菌 ， 从 叶和 茎 中分 养 结 果 。 离出内生茵，用牛肉膏蛋 白胨培 养基 、 Ｐ Ｄ Ａ培养基分 离出薄荷 叶、 ２ ． ２ ． ２组织 印迹检查 。 用灭菌镊子夹住 以消毒灭菌 的供试植物
纯化 ， 直 至 得 到 纯化 的 典 型 菌 落 。将 已纯 化 的 菌 株 分 抗逆性 的作用 之外，一些植物 中的内生菌还 可以产生 同植物 宿主 反 复 的 分 离 、 ＂ Ｃ 保 藏。 相 同或者相似 的活性物质 ， 是潜在 的微生物药物开发 资源 。随着抗 别转 移 置斜 面 培 养 基 上 待 菌 株 生 长 旺 盛 时 。取 出置 ４
使其表 面与相应 固体培养基接触及 分钟后取 出， 分别做 茎的 内生 菌， 待 平板上 茵落长 出， 根据其 颜 色、 形 态透明度 等特征 组织小片 ， 将牛 肉膏蛋 白胨平板倒 放于 ３ ５ ￣ Ｃ培养箱 培养 ３天 ， Ｐ Ｄ Ａ平 判 断 分 离 出的 菌 落种 类 ， 用平板 划线分 离纯化方 法 ， 反 复 的 分 离、 好标记 ， ８ ￣ Ｃ培养箱培养 ７ ｄ ，观察培养 基上是否有菌 落生长 ， 良 纯化 ， 得到纯化的典型 茵落。本研究共从 薄荷植株体 内分 离到 了 ４ 板倒放于 ２ 株 内生菌 ， 其 中内生细菌和 凉感 ， 主要用 于牙膏 、 食 品、 烟草、 酒、 清凉饮 料、 化妆 品、 间对 最终分离到 的内生 菌的数量和种类都具有重要 作用 。消毒 时 香皂 的加香 ； 在医药 上广泛用 于可驱风 、 防腐 、 消炎 、 镇痛 、 健 胃等 间过短 ，植物材料表面 微生物会造成污染 ，导致 内生菌分离不 成 药 品中 。全草 入药 ， 有发 汗、 散风热和 止痒等功 效 ， 适用于 感 冒发 功 ； 消毒时 间过长 ， 可 以使 消毒彻底 ， 但有可 能将部分 内生菌也 杀 热、 头痛 、 咽喉肿痛 、 无汗 、 风火赤眼、 风疹 、 皮肤发痒 、 疝痛 、 下痢 及 死 ，从而使分 离到的 内生菌数量偏少 。为 了保 证分离到 的是 内生 瘰疬 等症 ， 外用有轻微的止痛作用 ， 用于神经痛等 。
内生菌研究方法
内生菌研究方法1. 内生菌鉴定方法：内生菌的鉴定通常使用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，通过与数据库比对确定内生菌的亲缘关系。
详细描述：内生菌鉴定的第一步是提取内生菌的基因组DNA或RNA。
常用的提取方法包括CTAB法、酚/氯仿法等。
提取的DNA或RNA可以被用于进行下一步的分子生物学分析。
鉴定内生菌的常用方法是通过对内生菌的16S rRNA序列进行分析。
16S rRNA在细菌中广泛存在，并且具有高度的保守性和进化慢的特点，因此可以用于鉴定和比较不同细菌之间的亲缘关系。
通过PCR反应扩增16S rRNA基因片段，并对扩增产物进行测序。
然后将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，以确定内生菌的亲缘关系。
2. 内生菌定量方法：内生菌定量可以通过菌落计数、实时荧光定量PCR等方法进行。
详细描述：菌落计数是一种常用的内生菌定量方法。
它通过将样品均匀涂布在含有适宜培养基的琼脂平板上，然后将平板在适宜的温度下孵育一段时间。
善生长的内生菌会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量可以间接估计内生菌的含量。
实时荧光定量PCR是一种准确且高灵敏度的内生菌定量方法。
它利用了PCR反应的指数增长特性，通过测量反应体系中荧光信号的增加来实现对内生菌数量的定量。
内生菌的数量可以通过与已知浓度的标准曲线进行比较得出。
3. 内生菌培养方法：内生菌的培养方法主要有直接法和间接法两种。
详细描述：直接法是将内生菌从宿主组织中直接分离出来，利用含有适宜营养物质的培养基对菌株进行培养。
该方法可以获得与宿主组织中内生菌具有相似生理特性的纯培养菌株，但存在着很大的困难，因为内生菌通常不能在人工培养条件下生长。
间接法是通过将宿主组织进行处理，如消毒、切碎等，然后将处理后的组织置于含有营养物的培养基中进行培养。
内生菌在处理后的组织中可以继续生长，并在培养基上形成菌落。
间接法相对直接法容易操作且成功率较高，但获得的菌株可能受到宿主组织中其他微生物的污染。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4 . 内生放线菌
植物内生放线菌有根部结瘤的弗兰克 氏菌（Frankia），一个放线菌新属 （Actinosynemma）。玉米根叶中分离出放 线菌主要为小双孢菌、链霉菌和链孢囊菌。 链霉菌最多(n=482)，链轮丝菌(n=2), 诺卡 氏菌(n=4),小单孢菌(n=1) 链孢囊(n=1)。
4 . 内生菌放线菌的分离
心叶烟种子由实验室提供。
烟草种植：先在盆中垫好筛过的细土，把适量烟草种子与细土混匀，均匀洒在土壤表面，并在盆底下垫上大盘，从大盘中把水浇透，盖上纱网即可；
烟草移植：一盆一株，先在小花盆中装入适量筛过的细土，盆底小孔处垫上小石块等物，再把烟草从大盆中挖出，注意根部带土，移入小花盆中，把土压实，
并在盆底下垫上大盘，从大盘中把水浇透，盖上纱网即可。
4 . 内生菌的分离
植物组织内部表面消毒方法包括用次 氯酸钠、环氧丙烷气、过氧乙酸、升汞、硝 酸银等消毒剂清洗，还有人用乙醇烧或者直
内生放线菌的选择性分离主要通过在植物材料表面消
毒后，使用不同的培养基和在培养基中添加不同的抗生素
来实现。这些选择剂的添加是必要的。因为内生真菌的生
长一般比内生放线菌快，容易在分离培养皿中过量生长，
1.2.1 实验准备
培养皿清洗，包皿；培养基配制，分装
灭菌：干热灭菌（160℃～170℃，1～2h，不能超过180℃）包括：培养皿，研钵，石英砂，滤纸等；
高压蒸汽灭菌（0.1Mpa,121℃,30min）包括：培养基，无菌水，移液枪枪头
倒平板：遵循稳，轻，快原则倒皿，置于28℃条件下培养三天，无菌生长方可使用
萄糖10.0 g，琼脂 18.0～20.0 g, 蒸馏水 1000.0 ml。以上不加琼脂即 为肉汁胨液体培养基。 b. 采用PDA培养基分离真菌
c采用高氏1号培养基、YCED 培养基、YCED 培养基初筛固体培养 基TWYE 培养基YIM-2 培养基HVA 培养基分离放线菌。初筛培养基抑制 剂浓度为每L 培养基中含有250U 的链霉素和50mg 的重铬酸钾。
2．分离方法: ⑴内生细菌 表面灭菌: 将块茎用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用
75%的乙醇和次氯酸钠（有效cl-10%）分别进行表面消毒五分钟， 再用无菌水漂洗块茎三次。为了检验表面灭菌的效果，用灭菌过的 镊子夹住块茎,使其表面与固体平板接触3～5 min，然后将培养皿 放在22℃～25℃的温箱中培养3～5d。若发现皿中无菌落出现，证 明该块茎表明灭菌彻底，否则，该分离结果不能使用。 ⑵取样: 用打孔器（d＝10 mm）从茎基部插入薯块，取出样品， 用灭菌的手术刀切取10 mm（包括维管束环），置于研钵中(De Boer,1974)。 ⑶样品处理: 研磨样品，加无菌水定容至10ｍl，静置30 min后，梯 度稀释到浓度为10-1～10-4，取0.2ml涂布于BPA平板上，每浓度 涂平皿一个，重复三次，置于２２℃～２５℃温箱中培养。 ⑷纯化和保存: 培养3～5d后，挑取不同形态的菌落重新于固体平 板上划线纯化，然后，真空冷冻干燥保存，备用。
根、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、 棉铃和水稻叶子及其它植物储藏器官内分离到大 量内生细菌 。 2. 皿内筛选靶标菌
苹果腐烂病菌、小麦全蚀病菌、油菜菌核病 菌、猕猴桃溃疡病菌等30多种真菌和细菌。 3. 生测及防病试验
小麦白粉病、小麦条锈病、小麦纹枯病、油 菜菌核病、西葫芦白粉病、苹果腐烂病等。
1.小麦内生菌
菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用
菌株的革兰氏染色情况（G-）
2.黄瓜内生菌
分 离 病菌 菌株 的对 抑棉 制花 效枯 果萎
分 离 菌病 株菌 对的 苹抑 果制 腐效 烂果
菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果
菌株对小麦赤霉病菌的抑制效果
菌株对苹果腐烂病菌液培菌丝生长的抑制作用
(上方: 对照 下方: 三次重复)
基平板上,同上第四次无菌水涂抹平板做对照。27 ℃黑暗培养,细菌培养3～7天后，放线菌培养7～14天后，若相应对照无污染，则可根据菌落形态、颜色等挑
取单菌落,纯化后保存于斜面中。
2 抗病毒活性分析及筛选
将内生菌进行液体培养，提取上清液，而后采用半叶法在心叶烟寄主上进行治疗试验测定其相对防治率，初步筛选出一部分有较好抗病毒活性的菌株。
菌水涂抹平板做对照。3－7天后，可见断面边缘长出菌丝。若相应对照无污染，则可挑取前端菌丝转入分离培养基。采用此方法，不断对分离得到的菌株进
行纯化，纯化好后保存在斜面中漆茎、叶、花、根样品各1.5g，每样品加10ml 无菌水碾碎静置15min 后,各取80μl涂在牛肉蛋白胨培养基、高氏一号培养
实验七 内生菌的分离、鉴定
一 、实验的目
本实验以植物组织为材料从中分离内生菌， 其目的是筛选活性内生菌菌株，掌握鉴定种类、 液体培养、次生代谢产物提取和活性测定的方法， 为生物防治提供优良菌株材料。
植物内生菌次生代谢产物的多样性为人类突
破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制，
利用植物内生菌工业发酵生产重要的药物开辟了
子型
表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布更容易浸润到要灭菌的材料 表面
蔬菜内生放线菌的分离和生物活性，加吐温或Triton X 后灭菌剂活力 大为提高所以在清洗液中加入了Triton-100表面消毒的检验将表面消 毒后的组织块在培养基表面滚动并轻轻印记取出组织块用玻璃涂棒涂 布均匀在培养箱内28 下培养36 天 取无病株或种子，先用水冲洗干净，然后在0.1%十二烷基苯磺酸钠 中浸泡30min，再用水冲洗干净，然后随机称取根、茎、叶各5g，纱 布包裹，以下工作在超净工作台上进行。包裹好的材料浸入0.1%的 HgCl2中消毒18min，再用无菌水冲洗3～4次。
2.2 抗病毒活性分析
四、实验方法
1. 材料的表面消毒。 方法1 用75%乙醇浸泡3min 然后用0.1%HgCl2 中浸泡15min 无菌水磁 力搅拌下浸洗5 次每次5min 以上所有清洗溶液中均加入1 Triton-100。 方法2 用75%乙醇浸泡3min 然后20% NaClO 中浸泡5 min 无菌水磁力 搅拌下浸洗5 次每次5min 以上所有清洗溶剂中均加入1 Triton-100 近年来普遍提倡在灭菌溶液中加添吐温-80 或Triton X 这是一些非离
材料与方法
1 内生菌的分离与纯化
1.1 供试材料
供试植物：采集于陕西不同地区处于生长期的泽漆健康植株。
供试培养基：
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水 1000mL，琼脂15g，pH 7.2～7.4）；
（2）PDA 培养基（葡萄糖 20g，马铃薯 200g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL）；
丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最多， 而叶片和根中含量极少。
三、实验材料
1. 植物
黄瓜(Cucumis sativus) 、甘蓝 (Brassica0leracea)、百慕大草(Bermuda grass)的茎、小麦、番茄、辣椒、油菜、杂草， 花生(Archis hypogaea)果仁、已从黄瓜、甜菜
泽漆、大戟 不同部分内生菌分离纯化
活性菌株
发酵液和菌丝体
抗病毒活性测定
提取物生物活性测
活性最高的菌株
菌株鉴定
活性成分分离
活性成分鉴定
1. 供试品种 采集不同地区、不同品种的苗期、开花期、
荚果膨大期的无病株和种子。采集新鲜材料后立即使用。 2. 分离培养基
a. 采用牛肉膏蛋白胨固体培养基、肉汁胨培养基(BPA)分离细菌 肉汁胨培养基(BPA)：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母膏1.0 g，葡
图13 E1R-J 菌株对小麦全蚀病的防治效果
左: 健康对照 中: 喷菌悬液 右: 发病对照
（3）高氏 1 号培养基（可溶性淀粉 20g，KNO3 1.0g ，K2HPO4 0.5g ，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO40.01g，蒸馏水 1000mL，琼脂 15g，pH 7.2～7.4）。
分别用于内生细菌、内生真菌和内生放线菌的分离培养。
1.2 分离与纯化
真菌采用组织分离法，细菌及放线菌采用稀释涂抹法进行分离，分离出后挑取形态颜色相似的菌落，纯化后于斜面中保存备用。
表面消毒效果的常用检验方法：有两种。
(1) 漂洗液检验法，即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸取0.2～0.3ml涂布 于固体平板上。每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产生。
(2) 组织印迹法，即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置于固体平板上保留几分 钟，然后移去样品。于28℃培养48小时，检查表面消毒是否彻底。据此验证此 消毒方法是否能全部杀死供试材料。表面消毒检验方法的评价标准为表面消毒 检验培养皿中菌落数量越多菌落出现的时间越早说明该表面消毒检验方法的灵 敏度越高
选择性培养基主要是以淀粉为碳源，酪蛋白为氮源，加以
制霉菌素、放线菌酮等抗真菌化合物以促进放线菌的生长，
但是多数研究是为了了解内生放线菌的群落生态组成因此
只选用一种或几种分离培养基，干热等用于提高土壤中放
线菌分离数量，预处理方法也可以用于植物组织。
内生放线菌的分离 弗兰克氏放线菌的离体培养非常困难，主要原因在于： （1）一般离体培养需要2～3 周或更长时间 （2）土壤中含有快生型的微生物如细菌腐生放线菌或真菌
菌株放线菌的菌丝形态光镜照片
3.产酶内生菌
菌株对油菜菌核病菌的抑制效果
菌株对油菜菌核病菌菌丝的影响
菌株产β-1,3葡聚糖酶的皿内情况
菌株对油菜菌核病菌的抑制效果
二、植物内生菌的活体测定