琼脂打孔法抑菌圈试验
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究作者：潘晓倩等来源：《肉类研究》2014年第12期摘要：目的：比较5种抗菌肽活性测定方法。
方法：以金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌株，研究牛津杯法、打孔法、滤纸片法、酶标比浊法和活菌计数法对不同质量浓度的抗菌肽抑菌活性评价的比较。
结果：3 种琼脂扩散定性抑菌实验中，打孔法灵敏度高，抑菌圈清晰规则，效果最好；2 种定量抑菌实验中，活菌计数法结果判定更直观，灵敏度高，效果最好。
结论：抗菌肽抑菌活性研究过程中，选用打孔法定性与活菌计数法定量相结合的方法，能够更全面、准确地反应其抑菌活性。
关键词：抗菌肽；抑菌活性；测定方法Abstract： Objective： To comparatively evaluate the performance of several antimicrobial peptide activity assays. Methods： Using Staphylococcus aureus， Staphylococcus haemolyticus and Bacillus subtilis as experimental strains， the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide nisin at different concentrations was determined by Oxford cup method， punching method， filter paper method， microtiter plate assay and viable count method， respectively. Results： Among three agar-diffusion methods， punching method was the most sensitive， which provided clear and regular inhibition rings. Our comparison of two quantitative activity assays indicated that viable count method， showing high sensitivity and intuitive results， was better than microtiter plate assay. Conclusion： Combined application of punching method and viable count method allows comprehensive and accurate measurement of antimicrobial peptide activity.Key words： antimicrobial peptide； antimicrobial activity； assay中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）12-0017-04抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸组成与结构可以破坏细菌细胞膜结构，导致其死亡[1-2]。
打孔法抑菌试验操作流程
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8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验_向双云
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8 种中草药对大肠杆菌的体外 MIC 测定结果 黄芩 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄连 － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 黄柏 + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 鱼腥草 穿心莲 五味子 － + － － － + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ － － － + + ++ +++ ++++ ++++ ++++ 连翘 － + ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 艾草 － － － － + + + ++ +++ ++++ ++++
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
抑菌效果的检测方法
抑菌效果的检测方法
另外，我们还可以从化学角度来考虑。
常见的抑菌效果检测方法包括最小抑菌浓度法和扩散法。
最小抑菌浓度法是将不同浓度的待测物溶液与一定数量的细菌接种在琼脂培养基上，培养一段时间后观察最低浓度的待测物能够抑制细菌生长。
扩散法是将待测物溶液加在琼脂培养基上，待其凝固后在琼脂上打孔，然后在孔中加入一定数量的细菌液，培养一段时间后观察抑菌圈的直径来评价抑菌效果。
此外，还可以从临床角度考虑。
在医药领域，抑菌效果的检测方法包括在体外和体内实验。
在体外实验中，可以使用培养皿法或微量稀释法来评价抗菌药物的抑菌效果。
在体内实验中，可以通过动物模型来评价抗菌药物的疗效和抑菌效果。
综上所述，抑菌效果的检测方法涉及微生物学、化学和临床等多个领域，不同的方法各有优劣，选择合适的方法取决于具体的实验要求和研究目的。
希望以上信息能够对你有所帮助。
琼脂扩散试验的实验报告
琼脂扩散试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过琼脂扩散试验来研究不同浓度的抗生素对细菌生长的影响，以及评估抗生素的抗菌活性。
实验原理：琼脂扩散试验是一种常用的抗菌活性测定方法。
在该试验中，细菌被接种到琼脂平板上，随后在平板上打孔并加入不同浓度的抗生素。
随着抗生素在琼脂中扩散，其周围的细菌生长受到抑制，形成透明或半透明的抑菌圈。
抑菌圈的直径可以作为抗生素抗菌活性的指标。
实验材料：1. 细菌培养物（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）2. 抗生素溶液（如青霉素、链霉素等）3. 琼脂培养基4. 培养皿5. 打孔器6. 移液枪7. 无菌操作器材实验步骤：1. 制备琼脂培养基，并在培养皿中倒入适量的培养基，待其凝固。
2. 将细菌培养物稀释至适当的浓度，然后均匀涂抹在琼脂平板上。
3. 使用打孔器在琼脂平板上打孔，孔的间距应保持一致。
4. 使用移液枪将不同浓度的抗生素溶液加入到孔中。
5. 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中培养24-48小时。
6. 观察并记录抑菌圈的直径。
实验结果：实验结果显示，随着抗生素浓度的增加，抑菌圈的直径也相应增大。
这表明高浓度的抗生素具有更强的抗菌活性。
此外，不同种类的抗生素对同一细菌的抗菌效果也存在差异。
实验讨论：本实验结果与预期相符，说明琼脂扩散试验是一种有效的抗菌活性测定方法。
然而，实验中也存在一些局限性，例如抗生素的扩散速率可能受到琼脂厚度和孔间距的影响。
因此，在进行实验设计时，需要考虑这些因素以确保结果的准确性。
结论：通过本次琼脂扩散试验，我们成功地评估了不同浓度抗生素的抗菌活性，并观察到抑菌圈直径与抗生素浓度之间的正相关关系。
本实验为抗生素的筛选和抗菌效果评估提供了一种简单而有效的方法。
参考文献：[1] 张三. 微生物学实验技术[M]. 北京：科学出版社，2010.[2] 李四. 抗生素的抗菌活性测定方法[J]. 微生物学报，2015,55(3): 345-350.注：以上内容为示例文本，实际实验报告应根据实验结果和具体实验过程进行撰写。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
琼脂打孔法抑菌圈试验
琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）一、试验原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌三、试验步骤1、实验工器具准备及灭菌在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
不同植物精油体外抑菌效果的研究
50 | 2014年第34卷第4期 总206期 |植物精油(Essential Oil，EO)是植物体内的次生代谢物质，一般以植物的花、叶、枝、根、皮、树胶、全草和果实等为原料，通过蒸汽蒸馏、压榨等方式方法萃取出的植物挥发性芳香物质(Casamiglia，2007)。
近年来大量的研究发现从香辛料等植物中提取的植物精油具有很好的抗真菌、细菌及其它微生物的活性(Friedman，2004)。
天然植物精油作为天然饲料防腐剂和胃肠道微生物的调控剂已成为目前的研发热点。
本文根据相关的文献资料选择含有抗菌活性的肉桂醛(Singh，2007)、丁香酚(吕世明，2008)、香芹酚和百里香酚(胡艳芬，2010)等植物精油，比较不同来源及不同稀释浓度下精油对常见有害菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的抑菌效果，为实际生产提供参考。
1 材料和方法1.1 试验材料原料：市场上出售的不同厂家的含有肉桂醛、香芹酚、百里香酚和丁香酚的精油及原料，棕榈油、载体、琼脂糖培养基(MHA)。
仪器：电子天平(感量0.0 001 g)、培养皿、试管、移液枪、接种环、立式压力蒸汽灭菌器(上海申安科学仪器厂)、LRH 系列生化培养箱(上海一恒仪器厂)、生物安全柜、标尺等。
试验菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli )、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium )、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )、乳酸杆菌( Lactobacillus )，以上菌种均由安佑集团研究院微生物研究所提供。
1.2 试验设计1.2.1 单方精油抑菌试验先对市场上各种精油原料进行抑菌筛选，确定抑菌效果较好的原料。
再采用无抑菌效果的棕榈油对目标精油进行1:4比例的稀释，观测其抑菌效果的变化。
1.2.2 复方精油抑菌试验根据1.2.1的试验结果，对4种精油进行定比例复方配制，制成成品后，测定热处理前后复方精油的抑菌效果。
抑菌实验双层平板打孔法
抑菌实验双层平板打孔法抑菌实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细菌生长的影响。
其中，双层平板打孔法是一种常见的抑菌实验方法。
下面将详细介绍双层平板打孔法的步骤和原理。
一、实验材料和设备1. 细菌培养物：需要选择适当的细菌株，如大肠杆菌（Escherichia coli）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。
2. 培养基：可选择适当的培养基，如营养琼脂（Nutrient Agar）或大肠杆菌选择性琼脂（MacConkey Agar）等。
3. 实验物质：需要测试不同物质对细菌生长的影响，如抗生素、消毒剂、植物提取物等。
4. 双层琼脂平板：由两层琼脂制成，上层为较低浓度的琼脂，下层为较高浓度的琼脂。
5. 打孔器具：用于在平板上制作孔洞，可使用钢筒或无菌针头等。
二、实验步骤1. 准备双层琼脂平板：将上层琼脂和下层琼脂分别制备好，并在无菌条件下将两层平板叠加在一起。
2. 制作孔洞：使用打孔器具在平板上制作孔洞，通常可以按照一定的排列方式进行，如网格状、对角线状等。
3. 接种细菌：将需要测试的细菌培养物均匀涂布在整个平板表面上，确保每个孔洞都有细菌接种。
4. 施加实验物质：将待测试的实验物质滴入不同的孔洞中，控制组仅滴加无处理物质。
5. 孵育培养：将接种好实验物质的平板倒置放置在恒温培养箱中，通常在37℃下孵育24-48小时。
6. 观察结果：观察各个孔洞周围是否出现抑菌圈，抑菌圈直径大小可用来评估抗菌活性。
三、实验原理双层平板打孔法利用了两层琼脂的特性。
上层琼脂浓度较低，细菌能够较好地生长；下层琼脂浓度较高，细菌生长受到限制。
当实验物质滴入孔洞中时，会逐渐扩散到上下两层琼脂中。
如果实验物质具有抑菌活性，它会扩散到周围的琼脂中，抑制细菌生长。
在孵育过程中，抑菌圈会逐渐形成，并且其直径大小与实验物质的抗菌活性有关。
如果实验物质没有抑菌活性，则细菌在整个平板上均能生长，孔洞周围不会出现抑菌圈。
微生物 实验五 牛津杯(琼脂孔洞法)
实验五牛津杯（琼脂孔洞法）测定抗菌剂的抑菌效果一、目的：观察抗菌剂抗菌的作用效果，熟练掌握牛津杯法（琼脂孔洞法）体外测定抗菌物质的抗菌活性。
二、原理：抗菌物质从孔洞向琼脂培养基扩散渗透，通过对试验菌的抑杀作用而影响细菌生长繁殖，使菌落形成抑菌圈，依抑菌圈的大小确定抗菌物质抗菌能力的强弱。
三、材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌，用营养肉汤培养16~18 h得到的菌液。
2. 药品：氨苄青霉素，肉汤培养基。
3. 器材：生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、灭菌肉汤琼脂培养基、酒精灯、平皿、吸管、0.5 cm 纸片、镊子、记号笔、尺子等。
四、实验步骤1.按照实验一（培养基的配制）的方法步骤配制好肉汤培养基，并在121℃，灭菌20 min后，放在60 ℃水浴锅中保温，注意温度恒定，不要让培养基凝固。
2. 将用于试验的防腐剂（抑菌物质）配制成2个所需的浓度（见表1）。
3.将已经培养好的菌制成一定浓度（106cfu/mL）的悬浮液，用移液管移取1 mL该菌悬液至灭过菌的（121℃，20分钟）培养皿中，倒入15 mL已灭菌的培养基（温度约45℃，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
4.将凝固后的平板用灭菌后的打孔器在平板上打孔（4个孔洞），并挑出培养基。
（或将已灭菌的牛津杯依次轻轻放置在平板上）5.按照顺时针方向依次在每个孔洞（或牛津杯）中加入抑菌剂，以无菌水做空白对照，每种抑菌剂的浓度做三个平行样。
6.在37 ℃下培养24 h观察，用尺子测量抑菌圈的大小。
五、注意事项1.应在无菌条件下操作，试验完毕后及时灭菌处理。
2.添加抑菌剂的时候注意滴到其他地方，以免影响观察。
六、实验结果表测定抗菌剂的抑菌效果思考题：如何判定防腐剂或抑菌物质的抑菌效果，说明其食品应用的指导意义。
附：1. 药敏试验判定标准表 抗菌药物的抑菌效果判定标准抑菌圈直径（mm ）敏感性 <9 耐药 9~11 低度敏感 12~17 中度敏感 >18高度敏感菌株 药物浓度（µg/mL ） 抑菌圈直径（mm ）抑菌圈平均数判定结果金黄色葡萄球菌氨苄青霉素101010 3030 30。
抑菌性能考察实验方案
纳米材料抑菌性能实验方案纳米银和纳米金的抑菌作用是其环境效应表现的一部分。
本研究将对生物合成的银和金纳米颗粒进行详细的抑菌能力性能测试。
本实验拟采用革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli）和革兰氏阳性菌金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为模型菌进行抗菌实验。
实验采用通用的扩散法进行测定。
固体培养基组成（或LB培养基）：1L去离子水中加入蛋白胨5g，酵母提取物2g，氯化钠5g，牛肉膏1g，琼脂15g。
抑菌性能考察实验方案（1琼脂纸片扩散法，又称琼脂扩散法）取100µL细菌培养液（104cell/mL）平铺在固体培养基上，取新鲜合成的纳米颗粒50µL滴加在直径为5.5mm的圆形滤纸上，并放入固体培养基表面。
没有加入硝酸银进行纳米银合成的植物提取液作为空白样品同样进行抗菌实验。
样品最开始被放在4°C条件下进行扩散，然后在37°C条件下培养24h。
同时，采用广谱抗菌剂-庆大霉素或链霉素进行阳性实验对照。
根据抑菌圈的大小对抑菌效果进行评价。
图1 琼脂纸片扩散法抑菌性能考察实验方案（1琼脂井化扩散法，又称琼脂打孔扩散法）取1mL新鲜细菌培养液（细菌浓度为1×107 CFU）16-18h细菌培养液（刚过对数增长期）平铺在琼脂培养皿上。
自然干燥5min以后，使用无菌打孔器在琼脂板上开凿直径约5mm的孔，每个培养皿开凿4个孔，分别位于培养皿对称四个角上，如图所示。
然后用移液枪分别向各孔中滴加50µL不同浓度的提取液和生物合成纳米颗粒胶体溶液。
然后，将培养皿在37°C下培养24h。
在实验过程中，采用链霉素或庆大霉素作为阳性对照实验。
经过培养以后，细菌的生长抑制可以通过测定井化抑菌圈尺寸来进行考察。
实验需要平行三组样品。
图2 琼脂井化抑菌实验图3.6. Silver nanoparticle immobilization on cloth and disk diffusion studiesThe cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles did not show much difference in texture, wherea the cloth immobilized with PVDF containing silver nanoparticles turned slightly rigid. This change in texture is due to PVDF occupying the interface area of the fiber and forming a membrane-like structure upon drying. PVDF was selected based on its hydrophobic property, stability at wider range of temperatures and inertness to many chemicals. Fig. 5 shows the disk diffusion studies at various concentrations of silver nanoparticles. The cloth sprayed with sterile water and PVDF devoid of silver nanoparticles served as controls for respective plates. There was totally no inhibition by the cloth sprayed with only sterile water, whereas cloth sprayed with only PVDF showed mild inhibition of bacterial growth. From the Fig. 6, it was clear that increase in silver nanoparticle concentration increased the inhibition zone area on the plate, which directly represents the increase in toxicity. The cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles showed larger inhibition zone than cloth immobilized with PVDF. This may be attributed to the free availability of the silver nanoparticles in cloth immobilized with sterile water. In cloth immobilized with PVDF, a coat of the polymer might slightly inhibit the availability of the silver nanoparticles and thereby its toxicity. But the inhibition zone around the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles decreased vastly in consecutive cyclesafter washing compared to cloth immobilized with PVDF (Fig. 6). The purpose of using PVDF in the present study is to bind the silver nanoparticles to the cotton cloth, which will decrease the loss of the silver nanoparticles in consecutive washing. Thus as expected the loss of silver nanoparticles was lesser in cloth immobilized with PVDF compared to cloth immobilized with sterile water. In case of the cloth immobilized with sterile water containing silver nanoparticles,Fig. 5. Image of Petri plates showing the growth inhibition of E. coli by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) cloth immobilized with silver nanoparticles using PVDF.Fig. 6. Growth inhibition of E. coli in consecutive cycles by (A) cloth immobilized with silver nanoparticles using sterile water and (B) clothimmobilized with silver nanoparticles using PVDF.。
药物的体外抗菌试验
滤纸片法： 滤纸片法： 制成含菌平板后， 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置 于平板上，培养后观察结果， 于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 用于新药的初筛及临床的药敏试验。 新药的初筛及临床的药敏试验
在实际工作中， 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物， 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。 有的药物毒性很大也不能用于临床。
抗菌试验的影响因素
3、抗菌药物 、 药物的浓度、 及含有的其他成分均可 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可 影响试验结果， 影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有 色素、杂质和鞣质等， 色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结 果，应加注意。 应加注意。
抗菌试验的影响因素
4、对照试验： 、对照试验： 为精确判断实验结果， 为精确判断实验结果，试验时应设各种对 照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂 包括试验菌对照、 和稀释液对照等。 和稀释液对照等。
抗菌试验的影响因素
2、培养基 、 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制， 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球 菌常用含血清的肉汤培养基， 菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用 沙氏培养基。 沙氏培养基。 培养基的酸碱度、电解质、 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响 试验结果， 试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果 因素的掺入。 因素的掺入。 经无菌检查合格。 经无菌检查合格。
液体连续稀释法
1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药 在一系列的试管中用液体培养基将试验药 物作连续对倍稀释， 物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺 序成倍递减。 序成倍递减。 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 、再于各管中加入等量的实验菌， ～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 培养后， 培养后 观察。 观察。 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 、将未长细菌的培养液取出， 平皿。如培养后重新长出试验菌， 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。 物有杀菌作用。
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琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）
一、试验原理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。
试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。
本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。
二、试验器材、化学试剂及菌种
培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。
菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌
三、试验步骤
1、实验工器具准备及灭菌
在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。
将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。
实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。
2、倒培养皿
将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。
3、菌悬液的制备
从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。
吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌
悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。
4、试验菌的接种
用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。
5、抑菌剂的配置
用分析天平准确称量1g样品于灭菌后的15mL离心管内，加入10mL溶剂（无菌纯水、95%乙醇等），摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解）。
溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释6～10次。
若样品是液体，可直接对倍稀释。
6、添加抑菌剂
6.1在培养皿上打三个孔，用10～100uL的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌）。
各孔中心之间相距 25mm以上，与培养皿的周缘相距 15mm 以上。
用微量移液器吸取抑菌剂20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组），盖好培养皿。
6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。
7、培养培养皿并观察抑菌效果
于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h 观察结果。
用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。
注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。
测量其直径应以抑菌圈外沿为界。
四、试验结果
各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）
阳性对照结果：
阴性对照结果：
五、评价规定
1、抑菌作用的判断:
抑菌圈直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。
抑菌圈直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。
大于7mm小于10mm判为钝敏；大于10mm小于20mm判为中敏；大于20mm为高敏。
2、3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。
3、注意事项
(1)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。
浓度过低，接种菌量少，抑菌圈常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌圈则可减小。
(2)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌圈的大小。
(3)培养时间不得超过 18h。
培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌圈变小。
(4)抑菌圈直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。
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