琼脂打孔法抑菌圈试验

琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验）

一、试验原理

利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

二、试验器材、化学试剂及菌种

培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。

菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌

三、试验步骤

1、实验工器具准备及灭菌

在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。

2、倒培养皿

将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。

3、菌悬液的制备

从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌

悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。

4、试验菌的接种

用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。

5、抑菌剂的配置

用分析天平准确称量1g样品于灭菌后的15mL离心管内，加入10mL溶剂（无菌纯水、95%乙醇等），摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解）。溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释6～10次。若样品是液体，可直接对倍稀释。

6、添加抑菌剂

6.1在培养皿上打三个孔，用10～100uL的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌）。各孔中心之间相距 25mm以上，与培养皿的周缘相距 15mm 以上。用微量移液器吸取抑菌剂20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组），盖好培养皿。

6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。

7、培养培养皿并观察抑菌效果

于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。测量其直径应以抑菌圈外沿为界。

四、试验结果

各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）

阳性对照结果：

阴性对照结果：

五、评价规定

1、抑菌作用的判断:

抑菌圈直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。

抑菌圈直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。

大于7mm小于10mm判为钝敏；大于10mm小于20mm判为中敏；大于20mm为高敏。

2、3次重复试验均有抑菌作用结果者，判为合格。

3、注意事项

(1)接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌圈常因之增大; 浓度过高，接种量过多，抑菌圈则可减小。

(2)应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌圈的大小。

(3)培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌圈变小。

(4)抑菌圈直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。

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