微生物次生代谢产物研究方法1

(2) 摇瓶培养（实验室规模） 适用：细菌、放线菌、真菌 （厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封 瓶一般体积、重量过大） 优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅 速、周期短 缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床， 占用空间大。
(3) 发酵罐培养 通气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌） 厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发 酵生产，次生代谢研究？） 光生物反应器（光合细菌、微藻） 优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、 温度、pH等参数可控，生长迅速， 培养量大 缺点：昂贵
小结 各种天然生物成分溶解性
成分类型 • 游离生物碱 •生物碱盐 •苷类 水 － + + 醇类 + + + 亲脂性有机溶剂 + － －
•苷元
•挥发油 • • •树脂 •氨基酸 •蛋白质、酶 •鞣质 •色素（亲水性） • （亲脂性） •油脂、蜡 （多糖） （小分子）
－
－ ＋ － + － + ± + + － －
相似相溶原理
极性化合物易溶于极性溶剂，非极性化合物易溶于非极性 溶剂，同类分子或官能团相似的彼此互溶。（一条基本原则）
如单糖、寡糖、糖苷易溶于水或醇，酚类化合物易溶于甲醇，长链脂类 化合物易溶于石油醚、氯仿
常用溶剂极性(介电常数) 甲酰胺(109)＞水(80)＞甲酸(58)＞乙腈(36.3)＞甲醇 (33)＞乙醇(24.3)＞丙酮(20.7)＞正丁醇(17.8)＞乙酸乙 酯(6.02)＞乙醚()＞氯仿(5.2)＞二氯甲烷()＞甲苯＞苯 (2.3)＞二氯乙烷()＞四氯化碳(2.24)＞二硫化碳()＞环 己烷()＞正己烷(2.0)≈石油醚()。
(3) 重结晶法

原理
利用目标化合物与杂质在溶剂系统中溶解性的差异来 纯化。目标产物过饱和析出，杂质全部或大部分留在母 液中。
1.
2.
直接从粗提物或粗组分中重结晶对于微生物来说较少见， 植物化学成份研究中常用于高含量组分的初步纯化 分离纯化过程中（难分离）精细组分的重结晶或制备Xray衍射所需单晶（常用手段）
2）溶剂蒸发法（更常用，单一溶剂或混合溶剂）
良溶剂：溶解较好，挥发快 不良溶剂：溶解较差，挥发慢 良溶剂与不良溶剂应互溶
比如一化合物在氯仿中溶解度较高， 而在甲醇中溶解较低，则少量氯仿 配以大量甲醇可能适宜重结晶
方法：良溶剂溶解，小心加入不良溶剂至出现混浊刚好不消失，
再加入少量良溶剂至刚好溶解，滤纸封口，扎小孔，室温或冰箱 放置。或直接以混合溶剂操作。或柱层析试管直接放置。
浓缩富集 原则
1) 2) 3) 4)
时间短； 温度低； pH适中（比较稳妥）； 生物安全（不可忽视）
前处理的一般流程
发酵液 加热（使蛋白质等大分子变性沉淀，慎用/预试验） 调pH（同上，慎用/预试验） 絮凝（使菌体、悬浮物、大分子、粘稠物等沉淀或吸附聚集，有助 滤作用，对于细菌、放线菌、微藻很适用，明矾、硅藻土、纤维素等） 抽滤，过滤，板框式压滤机
(2) 沉淀法



利用有机物的溶解性或与某些试剂产生沉 淀的性质，沉淀反应可逆。 常用：铅盐法（(碱式)乙酸铅使沉淀，通硫 化氢脱铅解离。如蒽醌苷、黄酮）；胆固 醇可沉淀皂甙；苦味酸可沉淀生物碱。 沉淀除杂：用丙酮、乙醇、乙醚等可除去 多糖、蛋白质类杂质。
特点：有一定特异性，可选择性富集某一类目标组分
(4) 色素脱除


植物提取物、光合细菌或微藻发酵产物含较多色素，一般 价值不高且影响分离，可先除去。 方法： 1) 叶绿素易溶于氯仿、乙醚、石油醚等低极性溶剂, 可从水相中萃取除去 2）色素一般分子量较大，可用大孔吸附树脂或凝胶 柱除去 3）色素一般极性也较小，用短C18柱可除去
(5) 膜分离法

含水多，产物含量低； 含菌体及水溶性蛋白； 溶有原来培养基成分； 相当多的副产物和色素； 易被杂菌污染或产物可能会分解； 易起泡，悬浊物及粘性物质（多糖）多。
胞内产物（菌体）
目标产物
胞外产物（发酵液/水相）
1.2.2前处理目的、原则与流程
目的 固液分离
固相（滤渣）：菌体及悬浊物等 水相：胞外次生代谢产物（与部分水溶性大分子）
适合分开生物大分子与小分子化合物
小结：

传统方法主要用于粗分，可对目标组分进行一定 程度的富集； 溶剂分配、沉淀、重结晶等方法的合适运用可以 大大减少工作中的干扰，降低分离难度、减少工 作量；


重结晶方法对于单晶制备非常重要，可用于极复 杂化合物的结构鉴定。
在小试、中试试验中相对更为重要

胞 外 产 物
用水、醇的 水溶液、丙酮 等梯度洗脱
比较/合并？
胞内产物
通用性好，可 按极性实现初 步分段，条件 简易；但费时 、易喷溅、有 机溶剂用量大、 乳化现象严重
大大减少工作量， 且可按分子量、极 性等实现较好的 初步分离，但通用 性不及溶剂萃取法
二、分离与纯化
活性引导的分离
两种分离纯化策略 系统分离
常用的重结晶混合溶剂系统：
水一乙醇 甲醇一水 石油醚一苯 氯仿一醇 苯一无水乙醇 水一丙醇 甲醇一乙醚 石油醚一丙酮 乙醇乙醚一乙酸乙醋 苯一环己烷 水-乙酸 甲醇一二氯乙烷 氯仿一醚 乙醚一丙酮
规律：
静大动小，浓快稀慢，快小慢大，快杂慢纯
促结晶方法：
晶种（不太适用微量天然产物分离） 玻棒擦壁
+
+ ± ± + + + + ± + + + +
+
+ － － + － + － － － － + +
±：单糖：无水醇难溶； 多糖：对醇60%以上难溶。 蛋白质、酶：对水热水沉淀； 对醇60%以上沉淀。
•糖类（单糖低聚糖） + •有机酸（大分子）
特点：通过合适的萃取方法，能 有效地富集目标成分；但 一般只是粗分

活性引导的分离
对于显示有特定生物活性的粗提物，在分离纯化过程中每一步都用 该筛选模型跟踪分离有活性的组分，直至分离得到具有活性的纯化合物。 特别适用于主要对活性成分感兴趣的研究。 优点：是天然产物化学研究的一个重要的新趋势； 能集中精力，有目的性的分离想要得到的活性物质； 分离和结构解析的工作量相对都较小； 有清晰的研究思路，对于文章写作有一定好处。 弊端：不能保证有活性的化合物一定为新化合物，有一定风险；有可能 会漏掉在该筛选模型中无活性，但有可能具有其他潜在生物活性 的新化合物；活性跟踪有时受限于“协同效应”；不方便同时跟 踪

系统分离
对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在分离纯化过程中不 经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析 结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文 献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的 天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性 的研究。 优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物， 有利于专利申请、文章撰写， 也能兼顾各种生物活性。 弊端：目的性不明确/有一定盲目性； 分离纯化与结构解析的工作量巨大； 波谱测试费用比较大
(4) 固态发酵 适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造， 豆豉生产等，酶制剂、维生素、生 物毒素、抗生素），现在细菌上也 有应用 优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、 成本低，下游处理方便 缺点：过程控制、大型化等方面有待改进
1.2发酵液的前处理
1.2.1 发酵液的复杂组成/特点

基本流程
菌种
发酵培养 菌体
发酵液
前处理、富集提取
粗提物
活性 评价、 构效 关系
分离纯化
单体化合物
结构鉴定
传统方法 色谱方法
活性引导分离 或系统分离
波谱学手段 单晶衍射 化学反应
课程安排


源自文库
第一讲：发酵、前处理与传统分离方法 第二讲：色谱学原理与实际应用（1） 第三讲：色谱学原理与实际应用（2） 第四讲：波谱分析概论及紫外、红外、质谱 第五讲：一维与二维核磁共振谱 第六讲：核磁共振谱解析实例 第七讲：其他结构鉴定常用（波谱）方法 第八讲：化合物波谱综合解析实例
两种方法相结合，以活性引导为主线，兼顾系统分离
基本原则

尽量快速 低温
旋转蒸发（一般低于50摄氏度）；冷冻干燥；样品低温保存


避光 防氧化
旋转蒸发；有些样品需氮气保护

溶剂尽量不破坏天然成分
丙酮（与二醇反应成缩酮）；乙酸乙酯（成酯）；氯仿（酸性）
2.1 传统的分离方法
(1)萃取/溶剂分配法
OH
O
OCOCH3

实例
皂甙类： 植物粉碎，乙醇提取，分散于水中，依次用低极性的 （石油醚、）氯仿、乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分（色素、 类脂等），以正丁醇萃取富集皂甙类成分
生物碱类： 水相调pH碱化,使天然存在的生物碱的有机酸盐转化为 游离生物碱，有机溶剂萃取；有机相再用酸水萃取使再转 化为盐溶于酸水，色素等杂质残留在有机相中；酸水相再 不同程度的碱化，以有机溶剂萃取得到碱性强弱不同的总 碱组分。
第一讲 发酵、前处理与传统分离方法
一、发酵培养与提取
培养基：碳源/能源、氮源、生长因子、无机盐、水 生长曲线及其与次生代谢关系
迟滞期、指数期、稳定期、衰亡期
种子对发酵的影响
1.1微生物大规模发酵培养的方式
(1) 液体静置培养（实验室规模） 适用：丝状真菌（三角烧瓶，好氧） 厌氧细菌（密封瓶） 优点：经济，无需专门设备 缺点：生长相对缓慢
预处理
固液分离
微滤截菌及 悬浮杂物
水相
滤渣（菌体及杂物） 大孔吸附树 脂、活性炭 、亲和柱等 甲醇、丙酮、 氯仿－甲醇等
超滤除蛋 白、多糖 等大分子
经减压浓缩 或不浓缩
吸附富集/ 固相萃取
溶剂萃取
也可索氏提取
反渗透除 盐、单糖 、氨基酸 等过小分 子并除水 浓缩 效率很高 的新思路
有机溶剂 萃取（按 极性递增 的顺序）

重结晶方法（达到过饱和方法） 1）加热－冷却法（单一溶剂或混合溶剂，对于天然产物不宜过热）
选溶剂：取少量产物放人一支试管中，滴人约10倍体积/质量比的溶剂，
震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解 度太大，不适合作此产物重结晶的溶剂;若加热还不溶解，可补加溶剂，当 溶剂量大于40倍一产物仍不溶解，则说明此溶剂也不适宜。如所选择的溶 剂能在10~40倍体积加热的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较 多晶体，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。 方法：热溶饱和再加20％溶剂，(预热漏斗抽滤除杂)，冷却结晶，抽滤，尽量 少量溶剂洗涤
影响化合物极性的因素： (1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳 数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。 (2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况 下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。 常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞ 酮＞酯＞醚＞烯＞烷。 举例：判断下列各组化合物极性大小。