PCR技术及其发展和应用

PCR技术简史
• 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • PCR的完善
1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
PCR技术的基本原理
• PCR反应过程 • PCR的特点 • PCR的操作步骤
94
温
n 循环次数
PCR技术简史
• 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • PCR的完善
但测序和引物合成的困难
70年代基因工程技术的发明使克隆 基因成为可能
所 以 ， Khorana 的 设 想 被 人 们 遗 忘 了……
PCR技术简史
• 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • PCR的完善
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等 人发明了聚合酶链反应（PCR）
实现了在试管中模拟细胞内的DNA复制。
然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR， 由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费 力，且易出错
PCR技术简史
• 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • PCR的完善
3.避免形成二级结构：
发夹结构、二聚体。
4.引物的两端：
3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
3’
5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
5.引物的特异性：
引物序列应避免在模板内有较 高相似性的系列，尤其是3’末端。
引物序列同源性比对：
可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较 通过OMIGA、Clustal X等软件进行两两或
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
PC第第12R轮轮的扩扩增增基本原理
第PC3R轮反应扩条增件
PCR过程 PCR的特点
重复30轮后 理想拷贝数=2n n 循环次数
第4轮扩增
23第05=轮1扩,增073,741,第86轮2扩4增 1.8实5X3际平0均拷=效贝1率数,0约3=为(0,1.8+55x)5n 0,417
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
PPCCRR反过应程条件50℃
PCR的特点
Taq
Taq
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
对标本的纯度要求低 血液、体液、洗嗽液、毛发、活组织、细胞、 石蜡包块、古生物标本等的粗提DNA
PCR技术的基本原理
• PCR反应过程 • PCR的特点 • PCR的操作步骤
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR技术的基本原理
• PCR反应过程 • PCR的特点 • PCR的操作步骤
设置反应程序
(1) 94℃变性5min，
重复(2)-(4)30次
(2) 94℃变性1min， (3) 52 ℃退火1min， (4) 72 ℃延伸1min。
(5) 72 ℃延伸10min。
PCR产物的电泳鉴定
PCR结果：1、对照(无模板)； 2－6、PCR产物（5ul样品）
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR， 其扩增的DNA片段很均一，特异性、真实性也较 高，但每循环一次，仍需加入新酶。
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆 菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA
聚合酶。
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪
PCR反应的影响因素 1)反应体系
Lambda DNA，模板量分别为 100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg
（1）模板 单、双链DNA均可，多种来源。 质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、
DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般人基因组100ng DNA模板（100L）。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万ຫໍສະໝຸດ Baidu以上
MOVIE
5
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
引物2
DNA引物
PPCCRR反过应程条件50℃
PCR的特点
引物1
PCR技术的基本原理
• PCR反应过程 • PCR的特点 • PCR的操作步骤
灵敏度高 1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水 平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3. 细菌、病毒检测的灵敏度可达3个拷贝
简便、快速 1. 一次性加好反应液，1～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
PCR技术及其发展 和应用
主要参考书
1. CW迪芬巴赫 、GS德弗克斯勒［美］主 编 。《PCR技术实验指南》
2. 黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方 法及应用》
3. 尹一兵主编。《分子诊断学》
多聚酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）
PCR技术的原理 PCR技术的衍生技术 实时荧光PCR技术 PCR技术的应用
多序列的比较。
（2）引物 引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特
异的寡核苷酸片断。
引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物 序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。
引物设计的原则：
1.引物长度：
以18-24 bp为宜。
2.碱基均衡分布：
四种碱基尽可能随机分布； G+C占40-60%， 上下游引物应基本一致。