转录分析的5种方法
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理
RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。
2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。
深度为10-30 Million reads。
）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。
大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。
我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。
这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。
首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。
接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。
然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。
再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。
对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。
这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。
也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。
因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。
《现代分子生物学》第五章 1 转录
表 12-1 E.coli RNA Pol 的结构和功能 亚基 基因 分子量 数目 组分 可能的功能 （KDa） α rpoA 40 2 核心酶 酶 组 装 及 与 调 节 蛋白作用 β rpoB 155 1 核心酶 和底物（核苷酸） 结合 β ’ rpoC 160 1 核心酶 模板结合 ω 10 1 核心酶 σ rpoD 70 1 σ 因子 和启动子结合， 识 别模板链 参照 B. Lewin:《GENES》Ⅴ.1994, Table 14.1 14.2
转录过程中，DNA双链中的一条链为模板链 （template/antisense strand ），而另一条链为 编码链（coding/sense strand）。
转录起始于RNA聚合酶和启动子(promoter) 结合之后，转录起始的第一个碱基称为转录 起始点(start point) 。在RNA聚合酶的作用下 合成RNA，至终止子(terminator)终止。 由启动子到终止子之间的序列称为转录单位 (transcription unit)。转录起始点前面的序列 称为上游(upstream)，后面的序列称为下游 (downstream)。
亚基可能参与全酶的组装及全酶识别启 动子。另外， 亚基还参与RNA聚合酶与 一些转录调控因子间的作用。 亚基具有与底物（NTP及新生的RNA链） 结合的能力。利福霉素可以阻断转录的起 始，链霉溶菌素可抑制延伸反应，二者均 是通过与亚基的结合而发挥作用的。
’亚基可能与模板结合。 肝素可与’亚基结合而抑制转录，并且可 以和’亚基竞争DNA的结合位点。 亚基和’亚基提供了RNA聚合酶的活性 中心，其一级结构与真核生物RNA聚合酶 大亚基有同源性。 亚基的功能是帮助全酶识别启动子并与之 结合。 亚基也可被看作一种辅助因子，因 此又可称为因子（ Sigma factor）。
第四章 转录
不同点： 不同点：
（1）转录不需要引物。 转录不需要引物。 （2）转录一般只涉及一个短的DNA序列片段； 转录一般只涉及一个短的DNA序列片段； DNA序列片段 编码链（ 即非模板链、 正链、 有意义链） 编码链 （ 即非模板链 、 正链 same sequence as mRNA Coding strand of DNA has the 、 有意义链 ） ， 模板链 . 即负链、无意义链） （即负链、无意义链） 转录是由RNA 聚合酶催化， DNA上的特异序列 RNA聚合酶催化 上的特异序列— （ 3 ） 转录是由 RNA 聚合酶催化 ， 与 DNA 上的特异序列 Transcription is catalyzed 复制是由 DNA 聚合酶开始 ， —启动子结合并开始转录 （by RNA polymerase 启动子结合并开始转录（ DNA聚合酶开始 启动子结合并开始转录 复制是由DNA聚合酶开始， 从复制起始点开始） 从复制起始点开始）。 （4）RNA合成不象DNA有校对机制(Proof reading) 。 RNA合成不象DNA有校对机制(Proof 合成不象DNA有校对机制 转录时，DNA双螺旋一段短距离范围解螺旋形成转 （5） 转录时，DNA双螺旋一段短距离范围解螺旋形成转 录泡(Bubble) RNA在形成后不久被剥离模板 (Bubble)， 在形成后不久被剥离模板。 录泡(Bubble)，RNA在形成后不久被剥离模板。
(二) 功能： 功能：
β、β'：由β和β'亚基组成了聚合酶的催化中心。 、 ： 亚基组成了聚合酶的催化中心。 和 亚基组成了聚合酶的催化中心 β亚基能与模板 亚基能与模板DNA、新生 亚基能与模板 、新生RNA链及核苷酸底物相结 链及核苷酸底物相结 催化磷酸二酯键形成。 亚基为碱性蛋白质， 合，催化磷酸二酯键形成。 （ β'亚基为碱性蛋白质， 亚基为碱性蛋白质 与酸性DNA之间可借静电引力相结合； β亚基也可借 之间可借静电引力相结合； 亚基也可借 与酸性 之间可借静电引力相结合 疏水相互作用与DNA结合 它们在序列上与真核生物 结合,它们在序列上与真核生物 疏水相互作用与 结合 RNA聚合酶的两个大亚基有同源性） 聚合酶的两个大亚基有同源性） 聚合酶的两个大亚基有同源性 α亚基：与核心酶的组装及启动子的识别有关，并参 亚基：与核心酶的组装及启动子的识别有关， RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用 聚合酶和部分调节因子的相互作用。 与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。 ω亚基：功能还不清楚。 亚基：功能还不清楚。
5’-race鉴定转录起始位点的原理
5’-race是一种用于鉴定RNA转录起始位点的实验技术，它可以帮助研究者确定基因的启动子区域和转录调控元件，对于理解基因表达调控机制具有重要意义。
本文将介绍5’-race的原理及其在实验中的应用。
一、什么是5’-race？5’-race是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，翻译为cDNA末端快速扩增。
该技术最早由Frohman等人于1988年提出，并在随后的研究中不断完善和应用。
5’-race主要用于鉴定mRNA的5’端序列，揭示RNA的转录起始位置，并发现新的调控元件。
二、5’-race的原理1. 引物连接：5’-race首先通过连接一个短寡核苷酸引物到RNA的5’端，同时进行逆转录反应以合成cDNA。
这个引物称为内引物。
2. 增大cDNA：在反转录后，通过PCR技术进行cDNA的快速扩增，采用一个外引物和内引物的连接引物结合进行扩增。
3. 清除非特异产物：将PCR产物纯化后，对于其中非特异扩增的产物进行去除，留下特异的5’端cDNA。
4. 提取cDNA：将特异5’端cDNA变性后进行连接进行克隆。
5. 测序：对克隆产物测序，最终得到RNA的转录起始位点。
三、5’-race的应用1. 确定基因启动子区域：通过5’-race技术可以鉴定基因的转录起始位点，从而确定基因的启动子区域，帮助研究者进一步分析基因的转录调控机制。
2. 发现新的转录起始位点：对于未知基因或未知转录本，5’-race可以帮助研究者发现新的转录起始位点，进一步研究其功能及调控机制。
3. 肿瘤基因的研究：在肿瘤基因研究中，通过5’-race技术可以鉴定肿瘤相关基因的启动子区域和转录调控元件，对于肿瘤的发生和发展具有重要意义。
四、5’-race的优势与局限1. 优势：5’-race技术可以在较短的时间内鉴定RNA的转录起始位点，帮助研究者快速了解基因的转录调控机制。
2. 局限：5’-race技术对于RNA的质量和纯度要求较高，同时在设计引物和PCR条件优化上也需要一定的技术经验。
基因转录调控中的转录起始位点鉴定方法研究
基因转录调控中的转录起始位点鉴定方法研究一、引言转录起始位点（Transcription Start Site，TSS）是基因转录的起点，也是基因表达调控的关键节点。
对于生物学家来说，对基因TSS的准确鉴定非常重要，可以帮助我们更好地理解基因表达调控机制。
随着生物信息学和高通量测序技术的发展，不断涌现出新的TSS鉴定方法和工具，下文将介绍几种常见的方法并比较其优缺点。
二、5'RACE5'-Rapid Amplification of cDNA Ends（5'RACE）是一种常见的TSS鉴定方法。
该方法利用逆转录酶合成cDNA，随后用寡核苷酸引物在cDNA的5'端扩增出未知序列。
5'RACE优点是可以精确定位TSS，特别是在低表达的基因中。
但其缺点是需要大量的RNA作为起始材料，因此使用5'RACE时需要处理大量的副产物。
三、CAGE5'-Cap Analysis of Gene Expression（CAGE）是一种高通量测序技术，可以同时检测数千个基因的TSS。
该方法利用核酸酶碎裂RNA分子，在5'端加上CAP结构，随后利用体外加入花生四烯酸羧化酶（Terminal Transferase）把CAP结构上的底物ATP转化为biotin-ATP，形成CAGE标签。
最后把tag测序并比对到基因组上，从而确定TSS。
CAGE的优点是可以高通量鉴定TSS，准确性也比较高。
但其缺点是需要大量的RNA和高熵序列的数据库支持，因此CAGE的数据量比较庞大且需要较高的计算能力。
四、NanoCAGENanoCAGE是CAGE技术的一种改进版本，采用高精度的Illumina测序技术，可以检测TSS和启动子区域的低表达基因，并且能够准确地检测rRNA和tRNA等轻量级RNA。
NanoCAGE的优点是可以检测低表达基因和rRNA、tRNA等非编码RNA，准确度也比较高。
转录组学研究方法
In Situ Oligo Synthesis
Ø Photosynthesis
Ø Ø
原位合成芯片
Ø Oligo Arrays
Planer surface Microfluidics chip
Ø E-field synthesis
Microfluidics
微流体芯片 Ø Plastics Ø Ceramics Ø Silicon Ø Other materials
● Digital Gene Expression Displayer (DGED)
● cDNA xProfil无理想匹配
InterproScan
较好匹配
域的注释
析
无理想匹配
New sequences
基因功能分类
◆
手工分类
大部分以Adams 95年的文章中的采用分类体系为标准。
【Adams. MD, et al. Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature. 1995 377(6547 Suppl):3-174 】
RT-PCR
RT-PCR是将RNA的反 转录（RT）和cDNA的 聚合酶链式扩增（PCR ）相结合的技术。首 先经反转录酶的作用 从RNA合成 cDNA，再 以cDNA为模板，扩增 合成目的片段。
3’ RACE
• 以mRNA的 polyA为锚定
5’ RACE
• 原理上比3’RACE要 稍微复杂 • 要点: 逆转录酶 MMLV合成cDNA具 有加尾特性，即在 合成的cDNA链3’加 上3-4个dCTP，而且 当存在帽子结构时 该酶的加尾活性最 高 • 然后以这段polyC为 锚定
差异表达基因分析5趋势性上调和下调基因分析6基因集功
a、Solexa 测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer）, 单链状态的 DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端固定在芯片上；
b、通过扩增反应使得单链 DNA成为双链 DNA；
c、双链再次变性后成为单链，其一端固定在测序芯片上，另外一端（5’或 3’）随 机和附近的另外一个引物互补，被固定住，形成“桥“(bridge)； d、在测序芯片上同时有上千万 DNA 单分子发生以上的反应；
/2
/2
4.1差异倍数法
• Fold change= log2(A/B)
Fold change = log2(A/B)
A：sampleA表达值 B：sampleB表达值
通常以1和-1为作为差异表达的阈值，判断基因是否差异表 达
• 倍数法是比较常用的一种方法，因为比较简单和直接。 • 但是，这种方法也是有其重大缺陷的。比如，在某个实验中，基 因表达水平的变化不大，如果选择判别阈值为2倍，则有可能找不 到几个差异表达的基因，假阴性率比较高。但如果是主观缩小判 断阈值，又有可能增大假阳性率。 • 这一方法没有考虑到差异表达的统计显著性。
取准确的DNA序列信息。
• 2）工作流程：
3. GS FLX系统的技术优势和限制 1）读长优势：单个序列的读长平均可达到450个碱基左右；2）操作简便高效，不需建库、 克隆挑取、质粒提取等工作；3）分析结果快速、信息高通量，10小时的运行当中可获得
100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息；4）应用广泛且稳定，测序结果一致性较高；5）
MPSS(多重性平行定序)：
对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内 全部基因的表达特征；对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中 的作用机制等发挥了重要作用。 可以侦测到极为罕见的基因表现
转录本检测的方法
转录本检测的方法转录本检测是研究基因表达的重要手段，它可以帮助科学家了解基因的功能和调控机制。
目前，常用的转录本检测方法主要有以下几种：1. 原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）：原位杂交是一种直接在组织或细胞中检测特定RNA序列的方法。
通过将荧光标记的探针与目标RNA序列互补结合，可以在显微镜下观察到荧光信号，从而确定目标RNA的位置和数量。
这种方法适用于研究组织特异性表达的基因。
2. 实时定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative PCR，qRT-PCR）：qRT-PCR是一种基于荧光技术的高灵敏度、高特异性的基因表达分析方法。
通过对目标基因和内参基因进行扩增，然后通过比较两者的Ct值（循环阈值），可以计算出目标基因的相对表达量。
这种方法适用于研究基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达变化。
3. RNA测序（RNA Sequencing，RNA-seq）：RNA-seq 是一种高通量的转录组分析方法，可以全面、准确地测定一个细胞或组织中所有mRNA的表达水平。
通过对RNA样品进行片段化、建库、测序和数据分析，可以得到每个基因的表达量、剪接异构体等信息。
这种方法适用于研究基因表达的整体调控网络和功能模块。
4. 微阵列芯片（Microarray）：微阵列芯片是一种高通量的基因表达分析方法，可以同时检测数千个基因的表达水平。
通过将寡核苷酸探针固定在芯片上，与待测RNA样品进行杂交，然后通过扫描仪读取荧光信号，可以得到每个基因的表达量。
这种方法适用于研究多个基因的同时表达变化和差异表达基因的筛选。
5. 单细胞RNA测序（Single-cell RNA Sequencing，scRNA-seq）：scRNA-seq是一种在单个细胞水平上研究基因表达的技术，可以揭示细胞类型特异性基因表达和稀有细胞群体的特征。
通过对单个细胞进行RNA测序和数据分析，可以得到每个细胞的基因表达谱和细胞间的差异。
转录分析的5种方法
转录分析的5种方法信号通路，只有一个目的：将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。
不管是胰岛素，还是异亮氨酸，抗原还是肾上腺素，它们的终极目的总是如出一则：对转录活性的改变。
这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域：如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。
经典的凝胶迁移滞后试验（the electrophoretic mobility shift assay）已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。
但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特点。
即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或者是蛋白的何种基团负责指导体内转录的变化。
为了弄清楚蛋白与基因序列结合的精确位点，需要利用基于抗体的实验。
目前已经有了一些方便快捷的分析试剂，可以有力的帮助进行转录研究分析，其中有一些适用于发现型（筛选多种因子），有一些用于证实猜想的。
当然这些总是从初期的工作，进入精细进一步的研究工作。
PROTEIN ARRAYS（蛋白芯片）What they are：固定的转录因子阵列，利用标记的基因序列或者蛋白质进行探索。
What to use them for：用于发现和证实转录因子的结合位点或者蛋白－蛋白相互作用。
Pros（优点）：能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子。
Cons（缺点）：可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化。
Things to keep in mind：蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法。
但这种方法缺乏柔韧性，因此只局限于广泛的已研究的因子。
Available kits：Panomics的 TF Protein Array I for DNA-Protein Interactions (48 proteins, Catalog No. MA3505,$863),Active Motif的 TransArray (38 proteins, two membranes, Catalog No. 31400, $580)。
dna-rna相互作用的5种研究方法及原理
dna-rna相互作用的5种研究方法及原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：DNA和RNA是生物体内极其重要的核酸分子，它们在遗传信息的传递和调控过程中起着至关重要的作用。
DNA与RNA之间的相互作用是细胞内的一个关键过程，研究这种相互作用不仅有助于深入了解基因调控的机制，还可以为药物研发和疾病治疗提供新的思路。
在这篇文章中，将介绍关于DNA-RNA相互作用研究的五种常见方法及其原理。
1. RNA兴趣序列捕获（RIP-Seq）RIP-Seq是一种通过免疫沉淀法识别RNA与蛋白质相互作用的方法。
其基本原理是利用特异性抗体对目标RNA进行免疫沉淀，然后通过高通量测序技术对RNA进行分析。
这种方法可以鉴定DNA与RNA 相互作用的结合蛋白，从而揭示DNA-RNA相互作用的机制。
5. 双荧光蛋白互补法（BiFC）BiFC是一种通过蛋白互补的方式研究蛋白质与RNA相互作用的方法。
其基本原理是将两片断裂的荧光蛋白与RNA结合蛋白的两个互补片段连接，当这两个互补片段相互结合时，便会恢复荧光蛋白的活性，从而可以通过荧光显微镜观察RNA结合蛋白的互作情况。
BiFC方法可以直观地展示DNA-RNA相互作用的过程。
第二篇示例：DNA和RNA是生物体内重要的核酸分子，它们之间的相互作用可以在细胞中发挥重要的生物学功能。
研究DNA-RNA相互作用不仅有助于理解细胞内的基因表达调控机制，还可以为相关疾病的治疗提供新的思路。
本文将介绍关于DNA-RNA相互作用的5种研究方法及原理。
1. RNA免疫共沉淀法（RIP）RNA免疫共沉淀法是一种广泛用于研究RNA结合蛋白的方法。
其基本原理是利用抗体特异性识别和结合待研究的RNA结合蛋白，然后通过免疫共沉淀将这些蛋白与RNA一起沉淀下来。
通过对免疫共沉淀物的分析，可以确定RNA与蛋白之间的相互作用，并进一步揭示DNA-RNA相互作用的机制。
2. RNA结合蛋白CLIP-Seq技术CLIP-Seq技术是以cross-linking的方式封存RNA与蛋白质的相互作用，然后通过特定酶切割RNA，并通过测序鉴定蛋白质结合的RNA序列。
高中生物学业水平复习 专题七 遗传的分子基础 考点5 遗传信息的转录和翻译
►多项选择题 7．(2018·深圳模拟)下列关于蛋白质的翻译过程的说 法，正确的是( ) A．以细胞质中游离的氨基酸为原料 B．以核糖体RNA作为遗传信息模板 C．以tRNA为氨基酸运输工具 D．合成具有一定氨基酸序列的蛋白质 解析：蛋白质的翻译过程中以 mRNA 为模板。
答案：ACD
8.在遗传信息的传递过程中，下列叙述正确的是 ()
A．甲是 DNA，乙为 RNA，此过程为转录，酶为 DNA 聚合酶
B．甲是 DNA，乙为 DNA，此过程为复制，原料为 核糖核苷酸
C．甲是 RNA，乙为 DNA，此过程为转录，原料为 脱氧核苷酸
D．甲是 RNA，乙为蛋白质，此过程为翻译，原料 为氨基酸
解析：如果甲是 DNA，乙是 RNA，此过程代表的是 转录，酶是 RNA 聚合酶，A 错误。如果甲为 DNA，乙为 DNA，此过程代表的是 DNA 复制，原料是脱氧核苷酸， B 错误。如果甲为 RNA，乙为 DNA，此过程代表的是逆 转录，C 错误。如果甲为 RNA，乙为蛋白质，此过程代 表的是翻译，原料为氨基酸，D 正确。
D.④
解析：①②③④分别表示DNA复制、转录、翻译和
逆转录。
答案：C
5．tRNA 具有转运氨基酸的功能，图中 tRNA 携带 的氨基酸是(各选项括号中内容为相应氨基酸的密码 子)( )
A．精氨酸(CGC) B．丙氨酸(GCG) C．甘氨酸(GGC) D．脯氨酸(CCG)
解析：tRNA 的作用就是携带氨基酸进入核糖体，按 照 mRNA 上密码子的顺序将氨基酸排列，tRNA 上的反 密码子与 mRNA 蛋白质。 (×) [分析] 核糖体在mRNA上移动翻译出蛋白质。 4．在蛋白质合成过程中密码子都决定氨基酸。(×) [分析] 密码子共有64种，有3种终止密码子，不决 定氨基酸，决定氨基酸的密码子有61种。
dna-rna相互作用的5种研究方法及原理
dna-rna相互作用的5种研究方法及原理dna-rna相互作用是生物体内重要的生物分子间相互作用，包括转录、翻译、调控等过程。
以下是五种研究DNA-RNA相互作用的主要方法和原理：1. Transcriptional Interference（转录干扰）转录干扰是研究DNA-RNA相互作用的一种经典方法。
这种方法利用可以干扰特定基因转录的分子来研究该基因的调控机制。
例如，CR日本理化学研究所的研究小组利用“RADICL-seq”方法，研究了细胞核内RNA和基因组DNA的相互作用，并获得了lncRNA的功能信息。
2. ChIP-seqChIP-seq是一种基于DNA芯片的技术，它利用一种称为“免疫共沉淀”的技术，通过使抗体附着在蛋白质上，捕获与其结合的DNA片段。
通过这种方法，可以确定蛋白质与DNA结合的位置和强度，从而揭示DNA-RNA相互作用的信息。
3. RNA-seqRNA-seq是一种基于测序的技术，它可以揭示DNA转录成RNA的信息。
通过比较对照样本和处理样本的转录谱，可以确定特定基因的表达变化，并揭示DNA-RNA相互作用的信息。
例如，加州理工学院的MitchellGuttman等研究人员开发了RNA&DNASPRITE(RD-SPRITE)技术，实现了全基因组水平同时分析RNA-RNA、DNA-DNA以及RNA-DNA互作。
4. siRNA interference（小干扰RNA）小干扰RNA（siRNA）是一种短的双链RNA分子，可以特异性地降解mRNA，从而干扰基因的表达。
这种方法常用于研究特定基因的功能，特别是在非编码RNA（如lncRNA）的研究中。
日本理化研究所领导的团队开发出的“RADICAL-seq”新技术，也可用于研究lncRNA的作用。
5. Chromatin Immunoprecipitation（染色质免疫沉淀）染色质免疫沉淀（ChIP）是一种基于抗体与特定蛋白质结合的技术，可以捕获与该蛋白质结合的染色质。
rna功能研究方法
rna功能研究方法
RNA是一种重要的生物分子，除了mRNA的编码功能外，还具有多
种非编码RNA的功能，包括lncRNA、miRNA、siRNA等。
为了研
究RNA的功能，科学家们开发了各种各样的研究方法。
1. 基因编辑技术
基因编辑技术已经成为RNA功能研究的一种关键方法。
这些技术包括ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9等。
这些技术可以实现精确的DNA编辑，从而改变RNA的序列和结构，以研究RNA在生物学中的作用。
2. RNA转染
RNA转染可以提供一种有效的方式，在细胞内表达外源的RNA分子，例如siRNA、miRNA和lncRNA。
这些外源RNA的表达，可以用来
研究RNA的功能，以及在细胞生长、分化和信号转导等方面的重要作用。
3. 高通量测序技术
高通量测序技术可以检测RNA的转录水平，确定RNA分子的序列、
表达和剪接等信息。
这些技术可以用来发现新的RNA分子和确定其功能，从而加深对RNA生物学的理解。
4. RNA结构研究技术
对RNA分子的结构和动态变化的研究，有助于揭示RNA功能的机制和作用方式。
这方面的研究技术包括核磁共振（NMR）、X射线晶体学、质谱和化学探针等。
5. RNA互作网络分析
RNA互作网络分析可以帮助我们了解RNA分子之间的交互方式和相互作用的生物学意义。
这些互作网络可以依靠计算方法获得，或者利用高通量测序技术获得。
总之，RNA功能研究是一个快速发展的领域，涉及许多不同的技术和方法。
这些方法可以帮助我们更好地了解RNA的功能和作用机制，为用RNA进行生物制药和农业改良等方面的应用提供基础。
第四章 RNA基因表达：RNA转录
5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand)
3’----TACTCAT----5’ template (antisense strand) 5’----AUGAGUA----3’
在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下，按A＝U、 C≡G配对的原则合成RNA分子 RNA合成的方向是从5′→3′。 不需要引物，可以单独起始链的合成
3、RNA聚合酶亚基
聚合酶中有两个相对分子较大的大亚基和若干小亚基； 最大亚基与 E. coli RNA聚合酶中的β´亚基相似
第二亚基与E. coli 的含有活性位点的β亚基相似
同种生物3类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，至少有5 种小亚基普遍存在于3种酶中。
二、 启动子（Promoter）
大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析
全酶
E. coli RNA polymerase
155 KD 36.5 KD 11 KD 36.5 KD 151 KD 70 KD
只用于起始
用于起始和延伸
（二）真核生物的RNA聚合酶
1、分类
根据对 α-鹅膏覃碱的敏感性不同， 分为3类。
RNA polⅠ RNApol Ⅱ RNApol Ⅲ 最不敏感 最敏感 不同种类的敏感性不同
2、位置和转录产物
不同的RNA聚合酶在细胞核中的位置不同， 负责转录的基因不同。 （1）RNA polⅠ RNA聚合酶Ⅰ位于核仁。
负责rRNA（5.8S、18S和 28S）的转录。
由于 rRNA 占总 RNA 的比例最大，所以 RNA 聚合酶I负责了大部分细胞 RNA的转录。
（2）RNA pol Ⅱ RNA聚合酶Ⅱ位于核质。 负责hnRNA和 snRNA的转录。
重要实验1、RNA酶保护实验RN...
重要实验1、RNA酶保护实验（RNase protection assay）：它在许多方面与S1核酸酶分析方法类似。
它是用人工合成的具35S或32P标记的反义RNA探针同目的mRNA杂交，所形成的双链体分子用只切割单链的RNaseA和RNaseT1消化，之后将仍保留着的RNA做大小分部分离，于是被保护的RNA探针便给出了在样品中存在的目的mRNA的大小数值。
此法同样可鉴定样品中mRNA的数量。
2、DNA酶足迹法（DNase footprinting）：也叫足迹实验（footprinting assay），是一种用来检测被特定蛋白特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构特征的实验方法。
基本原理：当DNA分子中的某一区段同特异蛋白结合之后，便会得到保护而免受DNaseⅠ的切割作用，结果不会产生出相应长度的切割分子，于是在凝胶电泳放射自显影图片上便会出现一个空白区，俗称“足迹”。
通过与没有蛋白保护的对照DNA序列比较，便可得知相应于足迹部位的核苷酸序列结构。
3、S1核酸酶定位法（nuclease S1 mapping）：用于揭示mRNA序列结构特征的一种技术。
将从一个克隆基因分离的经放射性标记的单链DNA片段同其相应的mRNA退火形成双链分子，然后用S1核酸酶消化此杂合分子上未互补配对的单链序列，再用PAGE及放射自显影方法，检测保留下来的DNA片段的分子大小。
此法可测定克隆基因中的内含子数目及大体位置，mRNA分子的5’端位置及mRNA5’端任何不均一性的程度。
4、染色体步移（chromosome walking）：借助反向PCR（inverse PCR）通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向引物，经PCR而使未知序列得到扩增。
重复进行反向PCR，从染色体已知序列出发，逐步扩增出未知序列，称染色体步移。
5、凝胶阻滞实验（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），或条带阻滞实验（band retardation assay）。
5、转录调控
分子机制研究套路（五）转录调控课题：转录因子A对B基因的转录调控1．概念介绍：转录水平的调控是真核生物基因表达调控中重要环节。
真核细胞RNA 聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录，也就是说基因是无活性的。
因此，转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成复杂的转录装置。
在基因转录起始阶段，通用转录因子协助RNA 聚合酶与启动子结合，但其作用很弱，不能高效率地启动转录。
只有在反式作用因子(基因特异性转录因子）的协助下，RNA 聚合酶Ⅱ和TFⅡ才能有效地形成转录起始复合物。
反式作用因子（trans acting factor）在转录调节中具有特殊的重要性。
它是能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件8～12bp 核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。
这类DNA 结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种，正是不同的DNA 结合蛋白与不同的识别序列之间的空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了复杂的基因转录调控机制的基础。
在真核生物中转录因子的调控是最重要，也是研究得最多的。
蛋白质相互作用在转录因子活性的调控方面具有重要的意义。
细胞内的反式作用因子都是处于有活性和无活性两种状态，这两种状态是可以转换的。
反式作用因子处于无活性状态时，与之相应的基因就不能表达；反式作用因子处于有活性状态、并与相应的顺式作用元件结合时，就可以促进RNA 聚合酶和通用转录因子与相应的启动子结合，形成转录起始复合物。
所以，真核基因的表达调控主要是调节反式作用因子的活性，随后反式作用因子调控基因的转录起始。
转录因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子，对基因转录发挥调控作用。
大部分转录因子在激活以后与顺式作用元件结合，但也可能有一些转录因子是先结合DNA，被激活后才发挥调节功能。
增强子和上游启动子元件可以结合一些相同的蛋白质，在不同的基因中，存在着同样的顺式作用元件，这表明一些数量有限的基因调控蛋白控制着真核细胞的基因表达。
无自激活转录因子的研究方法
无自激活转录因子的研究方法无自激活转录因子的研究方法主要包括以下几种：
1. 生物信息学分析：通过计算机算法和数据库检索，分析基因的序列和结构，预测可能的转录因子结合位点，以及识别潜在的转录因子互作蛋白。
这种方法可以帮助研究人员快速筛选出可能的无自激活转录因子候选基因。
2. 基因敲除或敲低技术：利用基因编辑技术（如CRISPR-Cas9系统）或RNA干扰技术，特异性地敲除或敲低某个基因的表达，观察对细胞或生物体性状的影响。
如果某个基因的敲除或敲低导致特定基因的表达水平发生变化，那么这个基因可能就是一个无自激活转录因子。
3. 转录组分析：通过高通量测序技术，检测基因表达谱的变化，分析特定基因敲除或敲低后对其他基因表达的影响。
如果某个基因的敲除或敲低导致一系列基因的表达水平发生变化，那么这个基因可能就是一个无自激活转录因子。
4. 蛋白质互作研究：利用酵母双杂交、免疫共沉淀、质谱分析等技术，研究特定蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用。
如果某个蛋白质能与多个转录因子互作，并且不影响这些转录因子的活性，那么这个蛋白质可能就是一个无自激活转录因子。
5. 功能验证实验：通过构建过表达载体或敲除载体，将特定基因导入细胞或动物模型中，观察对细胞或生物体性状的影响。
如果某个基因的过表达或敲除导致特定表型的变化，并且这种变化与已知的转录因子功能不符，那么这个基因可能是一个无自激活转录因子。
综上所述，无自激活转录因子的研究方法多种多样，需要结合多种技术手段进行综合分析和验证。
一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒
一、概述转录组测序是一种重要的生物学研究手段，可用于揭示基因的表达模式、功能和调控机制。
快速构建转录组测序文库对于研究人员来说是非常重要的，因为文库的构建时间直接影响着后续实验的进展。
试剂盒作为转录组测序的关键材料之一，其质量和效率对文库构建质量有着直接的影响。
本文将介绍一种快速构建转录组测序文库的方法以及相应的试剂盒。
二、快速构建转录组测序文库的方法1. 样品处理样品处理是构建转录组测序文库的第一步，其重要性不言而喻。
在实验前，需要对样品进行RNA提取和纯化，并且需要对RNA的质量进行检测。
常用的RNA提取试剂盒有Trizol试剂盒、RNAprep试剂盒等，这些试剂盒具有操作简便、提取效率高的特点，能够满足快速文库构建的需求。
2. RNA反转录RNA反转录是将RNA转录为cDNA的过程，其质量直接关系到后续测序的准确性和可靠性。
常用的反转录试剂盒有PrimeScript RT试剂盒、SuperScript III反转录试剂盒等，这些试剂盒具有高效、高精度、低假阳性率的特点，能够满足快速文库构建的需求。
3. 文库构建文库构建是整个转录组测序的核心步骤，其质量直接影响后续测序结果的可靠性。
常用的文库构建试剂盒有TruSeq RNA样本准备试剂盒、SMARTer Stranded RNA-Seq试剂盒等，这些试剂盒具有高效、低假阳性率、高覆盖度的特点，能够满足快速文库构建的需求。
4.文库质控文库构建完成后，需要对文库进行质控，以确保其质量符合测序要求。
常用的文库质控试剂盒有Qubit dsDNA HS试剂盒、Agilent Bioanalyzer试剂盒等，这些试剂盒具有操作简便、准确快速的特点，能够满足快速文库构建的需求。
三、试剂盒的选择原则1. 效率试剂盒的效率是评价其优劣的重要指标之一，高效的试剂盒能够显著降低实验时间和成本，提高实验效率。
2. 精度试剂盒的精度直接关系到实验结果的准确性和可靠性，精准的试剂盒能够减少实验误差，提高实验结果的可信度。
单细胞转录组测序表达量的标准化和归一化
单细胞转录组测序表达量的标准化和归一化1. 引言1.1 背景介绍单细胞转录组测序是近年来发展迅猛的一项技术，它允许对单个细胞的基因表达进行高通量测定。
与传统的全细胞RNA测序相比，单细胞转录组测序可以揭示细胞间的差异和异质性，为细胞生物学、发育生物学和疾病研究提供了全新的视角。
单细胞转录组测序的出现使得研究人员可以更深入地理解单个细胞的功能和表型，从而揭示细胞间的多样性和复杂性。
在过去，研究人员通常需要提取大量的细胞并将它们混合在一起进行RNA测序，这样做会掩盖细胞间的差异性和异质性。
单细胞转录组测序的出现填补了这一缺口，为研究者提供了更加全面和准确的数据。
通过单细胞转录组测序，研究人员可以准确地分析不同细胞类型之间的转录组差异，揭示细胞发育和疾病发生的机制。
单细胞转录组测序为细胞生物学和医学研究带来了新的机遇和挑战。
随着技术的不断进步和完善，相信单细胞转录组测序将在未来的研究中发挥越来越重要的作用。
1.2 研究目的研究目的是为了解决单细胞转录组测序数据分析过程中可能存在的表达量的不一致性和偏差，确保数据的准确性和可靠性。
通过对表达量的标准化和归一化处理，可以消除技术因素和生物学因素带来的干扰，使得不同细胞之间的比较更加客观和准确。
标准化和归一化方法的研究也有助于揭示单细胞转录组测序中潜在的数据分析技术瓶颈，推动该领域的发展。
通过本文对单细胞转录组测序表达量的标准化和归一化方法进行系统总结和比较，旨在为研究人员提供数据分析的参考依据，帮助他们更好地理解单细胞转录组测序数据的特点和处理方法，为未来的研究和应用提供支持和指导。
2. 正文2.1 单细胞转录组测序的原理单细胞转录组测序的原理是通过对单个细胞进行RNA测序，揭示每个细胞的基因表达谱，从而了解每个细胞的功能和状态。
在单细胞转录组测序过程中，首先需要将单个细胞孤立并进行RNA提取。
然后，RNA会被逆转录成cDNA，并通过PCR进行扩增。
接着，将扩增后的cDNA进行测序，可以得到每个细胞的基因表达信息。
转录相关信息
转录相关信息
转录是指将DNA上的遗传信息转录为RNA的过程。
它是生物体合成蛋白质的第一步,也是基因表达的关键环节。
转录过程主要由以下几个步骤组成:
1. 启动复合物结合
RNA聚合酶识别并结合到DNA上的启动子区域,与其他蛋白质形成转录前起始复合物。
2. 打开DNA双螺旋
转录前起始复合物使DNA双螺旋在启动子区域打开,暴露出单链DNA模板。
3. RNA合成
RNA聚合酶从启动子下游开始,按照DNA模板的碱基序列合成互补的RNA分子。
4. 终止转录
当RNA聚合酶读到终止序列时,转录终止,RNA分子从DNA模板和RNA聚合酶上释放。
5. RNA加工
原核生物的RNA通常不需要加工,而真核生物的RNA需要进一步加工,如剪切内含子、加尾巴等。
转录过程受多种调控因子的调节,如激活子、抑制子等,从而精确地控制基因表达水平。
转录是生命活动的基础,对维持生物体的正常功能至关重要。
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转录分析的5种方法
信号通路，只有一个目的：将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。
不管是胰岛素，还是异亮氨酸，抗原还是肾上腺素，它们的终极目的总是如出一则：对转录活性的改变。
这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域：如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。
经典的凝胶迁移滞后试验（the electrophoretic mobility shift assay）已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。
但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特点。
即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或者是蛋白的何种基团负责指导体内转录的变化。
为了弄清楚蛋白与基因序列结合的精确位点，需要利用基于抗体的实验。
目前已经有了一些方便快捷的分析试剂，可以有力的帮助进行转录研究分析，其中有一些适用于发现型（筛选多种因子），有一些用于证实猜想的。
当然这些总是从初期的工作，进入精细进一步的研究工作。
PROTEIN ARRAYS（蛋白芯片）
What they are：固定的转录因子阵列，利用标记的基因序列或者蛋白质进行探索。
What to use them for：用于发现和证实转录因子的结合位点或者蛋白－蛋白相互作用。
Pros（优点）：能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子。
Cons（缺点）：可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化。
Things to keep in mind：蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法。
但这种方法缺乏柔韧性，因此只局限于广泛的已研究的因子。
Available kits：
Panomics的 TF Protein Array I for DNA-Protein Interactions (48 proteins, Catalog No. MA3505,
$863),
Active Motif的 TransArray (38 proteins, two membranes, Catalog No. 31400, $580)。
MICROSPHERE ASSAYS（液相芯片）
What they are：一些微磁珠的集合在一起，每一个能与唯一的因子结合位点偶联。
What to use them for：筛选转录因子的表达
Pros（优点）：提供一种广泛相对无偏见的第一次筛选手段，理论上，一次能检测100种不同转录因子。
Cons（缺点）：需要特定的硬件设施（如Luminex reader），不能完全的解释哪一种蛋白与哪一种蛋白结合。
Things to keep in mind：像RNAse保护试验一样，磁珠系统能定量转录因子保护寡核苷酸不被消化的能力。
来自匹兹堡大学医学中心Luminex core facility主任Anna Lokshin就表示：“这种微粒方法能得到意想不到的结果，因为它不会受到假说和初步数据的影响”，“通常你会在自己的知识领域里寻找，但是各自的知识领域是受到限制的。
”
Available kits：
Invitrogen的 BioSource 3-plex Transcription Factor Assays (100 tests, Catalog No. LHF2041, $845),
Marligen Biosciences的 Multiplex Transcription Factor Profiling Kit (20-plex) (96 reactions, Catalog No. 11954-096, Price $2,899).
CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION（染色质免疫沉淀分析）
What they are：来自天然染色质的蛋白质-DNA交联复合物的免疫沉淀，通过PCR或者微阵列来分析。
What to use them for：证实细胞内蛋白质-DNA天然结合的细节。
Pros（优点）：是能在体内进行的唯一分析方法，能详细解释蛋白容量的变化。
Cons（缺点）：需要一种目的转录因子的抗体。
同时ChIP相对于凝胶迁移滞后试验来说，更为复杂和困难。
Things to keep in mind：ChIP不能说明白一种特定结合是否是功能性的。
因此，我们需要利用转录活化分析方法。
ChIP很有用，但是需要与其他技术合用来解决整个难题。
Available kits：
Active Motif的 ChIP-IT (25 reactions, Catalog No. 53001, $395),
Upstate的 EZ ChIP (22 reactions, Catalog No. 17-371, Price $329)。
OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS（寡核苷酸芯片）
What they are：固定的寡核苷酸结合位点阵列，一般用于探测核提取物和研发某种蛋白的抗体。
What to use them for：筛选转录因子的表达物。
Pros（优点）：提供一种相对广泛，无偏见的第一次筛选手段。
Cons（缺点）：定性分析，需要进行研究的转录因子对象的抗体。
Things to keep in mind：不同的实验中存在着差异
Available kits：
Panomics的 Protein/DNA Combo Array (345 sites, Catalog No. MA1215, $1,415),
ArrayIt Transcription Factor Microarrays (expected Fall 2006, estimated price $600-$900)。
ELISA-BASED ASSAYS（ELISA分析）
What they are：基于酶联免疫反应的转录因子结合分析。
What to use them for：定量转录因子的浓度。
Pros（优点）：具有快速，定量和高通量的特点。
Cons（缺点）：需要目的转录因子的一种抗体才能进行试验。
Things to keep in mind：ELISA-based assays可以比传统的凝胶迁移分析容纳更多的蛋白，并且能将信号放大。
具有半定量的特点。
Available kits：
Clontech的 TransFactor STAT3 Colorimetric Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 631953, $583), Panomics的 HIF ELISA Kit (1 x 96 assays, Catalog No. EK1020, $518),
Active Motif的 TransAM CREB Kit (1 x 96 assays, Catalog No. 42096, $585)。