PI染色检测细胞周期

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流式细胞术检测细胞周期

流式细胞术检测细胞周期

流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期(PI染色)操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。

4、离心,弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室温避光孵育30min。

9、混匀,过300目筛网,置流式管中,4℃冰箱保存,待测。

10、用流式细胞仪检测细胞周期
11、用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据,并导出细胞周期分析结果
备注:
1、RNase A:贮液浓度:1mg/ml ;
工作液配制:加1 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为20ug/ml。

2、PI:贮液浓度:2.5mg/ml;
工作液配制:加2.5 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为50ug/ml。

4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。

2014-5-6 PI法细胞周期检测

2014-5-6 PI法细胞周期检测

细胞周期检测(PI法)一、实验方法原理细胞周期(cell cycle):是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期:细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。

S期:DNA开始合成,这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时,细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。

因此,单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,这两个细胞或者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此,整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析,可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1%、S%、G2/M%,了解增殖能力,在肿瘤病理学研究中,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理:是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理:PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如(图一)所示(图一)二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶(无EDTA)贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方(0.1MPBS pH 7.4)以1L量为例:NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g(十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠)加双蒸水900mL 左右,用HCl/NaOH 调pH至7.4,最后定容为1000mL。

PI染色法检测细胞周期

PI染色法检测细胞周期

PI染色法检测细胞周期一.实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭,可以与细胞内DNA 和RNA 结合,采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此,通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期,S 期和G 2/ M 期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

2.试剂配制RNase A,注意分装保存,防止反复冻融。

PI 购自Sigma公司货号P-4170,通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用,细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。

二.实验步骤1.细胞的收集:将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液,DMEM+10%FBS终止消化后,200g离心3min沉淀细胞。

2.细胞的固定:将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起,200g离心3min沉淀细胞,弃上清,以充分去除残留的FBS和胰酶;加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞,于4℃固定30min或-20℃固定过夜。

(此处,加乙醇时应注意边加入变吹起细胞,放置固定时细胞结成团,难以吹散而影响后续的检测)3.RNA的去除:将固定好的细胞,200g离心5min沉淀细胞弃去上清液;500μL预冷的PBS悬浮细胞,200g离心3min沉淀细胞,弃去上清液;用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程,通常可以通过PI(propidium iodide)染色来检测。

PI是一种DNA结合染料,能够与DNA结合形成荧光化合物,通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤:材料和试剂:1.培养皿:可容纳细胞的培养皿。

2.培养基:细胞所需的培养基。

3. Propidium iodide(PI):DNA结合染料。

4. RNase A:消化RNA的酶,可用于将RNA从细胞样品中降解。

5.细胞刮板:用于收集细胞。

6.离心管:用于离心细胞样品。

7.显微镜幻灯片:用于观察染色后的细胞。

步骤:1.准备培养皿:在培养皿中加入适量的培养基,使其能够完全覆盖细胞。

2.培养细胞:将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中,按照细胞的培养要求进行培养,培养至细胞密度适合进行实验。

3.收集细胞:用细胞刮板或其他方法,将细胞从培养皿中收集到离心管中。

4.细胞固定:将收集到的细胞进行固定,可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理,固定时间通常为30分钟。

5.细胞孵育:将固定的细胞在4℃下孵育过夜,以保证细胞完全固定。

6. 细胞溶解:在离心管中加入RNase A(最终浓度一般为1mg/ml),以降解细胞中的RNA,避免对细胞周期分析结果的干扰。

7. 细胞染色:在离心管中加入适量的PI溶液(一般最终浓度为50μg/ml),将PI与DNA结合,产生荧光信号。

8.染色孵育:将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时,使PI完全结合到DNA上。

9.细胞分析:将染色后的细胞用离心机离心,去除上清液,保留细胞沉淀。

10.流式细胞仪分析:将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中,使用流式细胞仪进行细胞周期分析,记录和分析PI的荧光信号的强度。

11.显微镜观察:将细胞沉淀取出,在显微镜幻灯片上制备细胞悬液,并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤

P I染色检测细胞周期实
验步骤
标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]
p r o t o c o l:P I染色检测细胞周期1、收集细胞:胰酶(含EDTA)消化收集对数生长期细胞(加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个),吸取旧培养基到一个新离心管里;少量常温PBS(根据培养皿大小决定量,PBS洗可以保证消化效率)洗2次,清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】;然后胰酶消化(注意一定要消化完全,显微镜下观察细胞呈单个,而不是成片脱落)后利用旧培养基中和胰酶;离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。

2、用预冷的PBS清洗细胞两次。

3、固定细胞:用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀,使细胞充分悬浮成单细胞,再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%),吹打混匀以免细胞团聚,4℃固定2H至过夜。

4、细胞染色:离心(1000r/300g5min)收集固定的细胞,以1.8mL 的PBS洗细胞一次,离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来,但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入100μlRNaseA于37℃水浴30min,最后加入400μlPI避光染色30min (常温或4℃均可)
【有的试剂盒说明是:每个样本加入500uL染色剂(据样本数,用PBS临时配好总量,其中PI50ug/ml、RNaseA100ug/mL、TritonX-10 00.2%)4℃避光染色30分钟】
5、流式分析
以标准程序用检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时,使用FL2-w和FL2-A显示,去除联体细胞。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是指细胞从一个开始时期,经过一系列的生长、分裂和分化过程后,再次回到原点开始的一个完整周期。

细胞周期是细胞生物学中一个重要的研究领域,对于理解细胞生物学的基本规律以及细胞增殖和分化过程具有重要意义。

其中,PI染色是一种常用来检测细胞周期的方法,下面将详细介绍PI染色检测细胞周期的实验步骤。

实验所需材料和仪器:1.细胞培养液2.细胞培养器具(细胞培养板、培养瓶等)3.离心机4. PI染色溶液(含有荧光染料Propidium Iodide的溶液)5.双色流式细胞仪6.PBS缓冲液实验步骤:1.细胞培养及处理a.选择需要研究的目标细胞,并进行适当的处理。

b.将目标细胞培养在合适的培养液中,并在37摄氏度、5%CO2的恒温培养箱中培养至所需的状态。

2.细胞收获和处理a.将细胞培养液转入培养细胞的容器中(如培养板、培养瓶等),通过离心机低速离心收集细胞。

b.将细胞沉淀在PBS缓冲液中,然后再次进行离心,去除上清液,并将细胞沉淀用PBS缓冲液进行重悬。

3.细胞固定a.用PBS缓冲液溶解适量的细胞固定剂(如乙醛或甲醛)制备1%细胞固定液。

b.向细胞悬液中加入1%细胞固定液并充分混合,使细胞固定。

4.细胞染色a.将固定的细胞用PBS缓冲液进行洗涤,去除细胞固定剂。

b.向细胞悬液中加入适量的PI染色溶液,并在暗处孵育30分钟。

5.流式细胞仪检测a.将染色后的细胞用PBS缓冲液进行洗涤,去除多余的染色剂。

b.将洗涤后的细胞悬液用PBS缓冲液进行重悬。

c.将细胞悬液转移到流式细胞仪的样品管中。

d.使用流式细胞仪进行细胞周期的检测,记录细胞的荧光强度和数量,得到细胞的周期分布。

6.数据分析a.使用流式细胞仪软件分析细胞周期的数据。

b.统计不同细胞周期阶段的细胞数量,并绘制相应的细胞周期分布图。

c.分析细胞周期分布的差异,并进一步探究细胞周期调控的机制。

需要注意的事项:1.在实验过程中,要保持实验环境的洁净和无菌,以避免细胞污染和结果失真。

PI染色法测细胞周期

PI染色法测细胞周期

PI染料与DNA结合
PI染料能够选择性地结合DNA,通过 荧光显微镜可以观察到染色后的细胞 核。
数据分析
通过特定的软件对数据进行处理和分 析,可以获得细胞周期的分布情况。
细胞周期分析
通过对染色后的细胞核进行荧光强度 和面积的测量,可以分析细胞的细胞 周期状态。
PI染色法的应用
肿瘤研究
通过PI染色法可以研究肿 瘤细胞的细胞周期变化, 为肿瘤的诊断和治疗提供 依据。
05
注意事项
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中进行,以减少有毒气体的吸入。
02
实验过程中应佩戴实验服和化学防护眼镜,以防止试剂溅到皮
肤或眼睛。
实验后应将废液倒入指定的废液收集容器中,不要随意倾倒。
03
实验操作注意事项
确保细胞浓度适中, 以保证计数准确性。
在洗涤过程中要彻底 去除多余的染料,以 免影响计数结果。
02
PI染色法原理
PI染料的特性
01
02
03
高荧光强度
PI染料具有高荧光强度, 能够有效地与DNA结合, 发出强烈的荧光信号。
专一性
PI染料只与DNA结合,不 与其他细胞成分结合,具 有专一性。
细胞膜通透性
PI染料能够透过细胞膜, 与细胞核中的DNA结合, 实现对细胞核的染色。
PI染色法的原理
干燥细胞
让涂片自然干燥,以便更好地观察染色效果。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察涂片,记录不同时期细胞的 染色情况。
04
结果分析
细胞周期各期的划分
G1期
细胞开始生长,DNA合成前期 ,细胞体积逐渐增大。
S期
DNA复制期,细胞核内DNA含 量加倍。

PI染色法测细胞周期

PI染色法测细胞周期

进入S期后,DNA开始合成,这时细胞核内DNA 的含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成 为4倍体时,细胞进入G2期,G2期细胞继续合 成RNA及蛋白质,直到进入M期,因此,单纯从 DNA含量无法区分G2期和M期;一旦有丝分裂发 生,细胞分裂成两个子细胞,这两个子细胞或 者进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0 期),而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。 因 此 , 整 个 复 制 周 期 可 以 描 述 为 G0/G1 , S , G2/M期。
流式细胞术的应用cba细胞生理学研究细胞活力增殖能力的检测荧光信号的面积和宽度所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量一般对dna倍体测量时采用面积如fl2a这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映dna的含量当形状差异较大而dna含量相等的二个细胞得到的荧光脉冲高度是不等的经过对荧光信号积分后所得到的信号值就相等
3、荧光染料浓度:染料太少,结合不完 全。染料过多,又会出现浓度淬灭现象。
4、固定剂:醛类固定剂会干扰插入性染 料与核酸分子的结合,造成荧光发射强 度减弱。
什么是流式细胞仪
流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM) 是一项集激光技术﹑电子物理技术﹑光 电测量技术﹑计算机技术以及细胞荧光 化学技术﹑单克隆抗体技术为一体的新 型高科技仪器。
什么是流式细胞术
简单说就是自动化的萤光显微镜 测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激
光束时发出的光学信号的一个系统
流式细胞仪特点及检测标本
特异性强,灵敏度高,速度快,并能实 现多参数分析;
可检测的样本种类多样
(1)外周血,骨髓,细针穿刺,洗脱液,实 体组织,培养细胞
(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液

PI标记法检测细胞周期

PI标记法检测细胞周期

PI标记法检测细胞周期1.实验原理:PI染料即碘化丙啶,是流式检测细胞周期应荣最为广泛的荧光染料。

PI能与细胞内的双链DNA和RNA结合,被488nm激光激发后发射红荧光,与核酸结合后其发射荧光信号的能力会提高20~30倍。

PI染料不能自由穿过活细胞完整的细胞膜,标记时需先用乙醇固定细胞,使细胞膜的通透性增加,这样PI染料就能通过细胞膜进入细胞内与核酸结合,标记时需同时加入RNA酶消化细胞内的RNA,使PI只能与细胞内的DNA 结合,反映细胞内DNA的含量,继而通过细胞内DNA的含量确定细胞周期。

后来发展了用低渗的柠檬酸溶液一步标记PI燃料法,细胞在低渗的条件下其细胞膜的通透性增加,PI染料就可以进入细胞膜如细胞内的DNA结合,此法简便,快捷,应用更为广泛。

2.试验步骤PI标记方法一(乙醇固定法):(1)将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液,取2x106细胞,离心沉淀,弃上清。

(2)200μl PBS重悬沉淀于1.5mlEppendorf管中,缓慢加入1ml预冷的(保存于4℃)的70%乙醇固定目标细胞。

充分混匀,4℃静置30min。

(3)离心沉淀,弃上清,200μl适当浓度的PI染液重悬细胞,同时加入RNA酶,充分混匀,4℃静置30min。

(4)离心沉淀,弃上清,200μl流式PBS重悬沉淀,流式上样分析。

PI标记方法二(低渗法)(1)低渗柠檬酸标记液配制:柠檬酸三钠0.25g,TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)0.75ml,PI 0.025g,RNA酶0.005g,用双蒸水补足至250ml。

(2)将需要分析的目标细胞制成单细胞悬液,取2x106细胞,离心沉淀,弃上清(3)1ml低渗柠檬酸标记液重悬沉淀,充分混匀,4℃静置30min.(4)离心沉淀,弃上清,200μl流式PBS重悬沉淀,流式上样分析。

3.注意事项检测细胞内DNA含量时必须保证样品内的细胞都是处于单细胞状态,但是在实际样品中经常会出现粘连的双细胞和多细胞团块,而流式细胞仪可能会将粘连在一起的两个二倍体细胞当作是一个四倍体的细胞,如果粘连的细胞较多而没有在分析时排除流式分析时就会得到比实际情况高很多的G2/M期细胞的比例,得到的流式结果就不准确。

5 6 PI法细胞周期检测

5 6 PI法细胞周期检测

货号
PBS
自配
2. 试剂配制 10XPBS 液体配方(0.1MPBS pH 7.4) 以 1L 量为例: NaCl 80g Na2HPO4·12H2O 32.3g NaH2PO4·2H2O 4.5g (十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠) 加双蒸水 900mL 左右,用 HCl/NaOH 调 pH 至 7.4,最后定容为 1000mL。 使用时用去离子水稀释成 1XPBS 3.仪器设备
注意事项
对全部高中资料试卷电气设备,在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验;通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关,通系电1,力过根保管据护线生高0不产中仅工资2艺料22高试2可中卷以资配解料置决试技吊卷术顶要是层求指配,机置对组不电在规气进范设行高备继中进电资行保料空护试载高卷与中问带资题负料2荷试2,下卷而高总且中体可资配保料置障试时2卷,32调需3各控要类试在管验最路;大习对限题设度到备内位进来。行确在调保管整机路使组敷其高设在中过正资程常料1工试中况卷,下安要与全加过,强度并看工且25作尽52下可22都能护可地1关以缩于正小管常故路工障高作高中;中资对资料于料试继试卷电卷连保破接护坏管进范口行围处整,理核或高对者中定对资值某料,些试审异卷核常弯与高扁校中度对资固图料定纸试盒,卷位编工置写况.复进保杂行护设自层备动防与处腐装理跨置,接高尤地中其线资要弯料避曲试免半卷错径调误标试高方中等案资,,料要编试求5写、卷技重电保术要气护交设设装底备备置。4高调、动管中试电作线资高气,敷料中课并设3试资件且、技卷料中拒管术试试调绝路中验卷试动敷包方技作设含案术,技线以来术槽及避、系免管统不架启必等动要多方高项案中方;资式对料,整试为套卷解启突决动然高过停中程机语中。文高因电中此气资,课料电件试力中卷高管电中壁气资薄设料、备试接进卷口行保不调护严试装等工置问作调题并试,且技合进术理行,利过要用关求管运电线行力敷高保设中护技资装术料置。试做线卷到缆技准敷术确设指灵原导活则。。:对对在于于分调差线试动盒过保处程护,中装当高置不中高同资中电料资压试料回卷试路技卷交术调叉问试时题技,,术应作是采为指用调发金试电属人机隔员一板,变进需压行要器隔在组开事在处前发理掌生;握内同图部一纸故线资障槽料时内、,设需强备要电制进回造行路厂外须家部同出电时具源切高高断中中习资资题料料电试试源卷卷,试切线验除缆报从敷告而设与采完相用毕关高,技中要术资进资料行料试检,卷查并主和且要检了保测解护处现装理场置。设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况,然后根据规范与规程规定,制定设备调试高中资料试卷方案。

PI染色检测细胞周期

PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜,或-20℃长期固定(4℃过夜一般隔天就进行检测,如果想推迟几天测,那就保存在-20℃,有资料说-20℃可以保存一个月,个人建议尽量在最短时间内检测,有些实验是在不同时间点上收细胞,这时我就等最后一次固定完了一块测,基本上也多在一周内检测完毕,没有特地去比较保存时间对检测结果的影响)。

3、细胞染色离心收集细胞,以1mL的PBS洗细胞一次,加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭(PI),100ug/mL RNase A,0.2% Triton X-100,4℃避光孵育30分钟(PI我是直接用PBS配成工作浓度,然后加入细胞沉淀混匀,RNA酶现加,但有时不加发现对实验结果也没太大的影响)。

4、流式分析以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时,使用FL2-w和FL2-A显示,去除联体细胞,具体如下图。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份,如果有凋亡,在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好,可能在最前面还有细胞碎片峰。

结果解读G0/G1期细胞占总的61.2%,峰位于横座标的45.76G2/M期占13.07,峰位于横座标的91.43S期占25.73G2/G1为2.0(即G2期为4倍体细胞,而G1期为2倍体细胞,比值为2)峰的变异系数为4.54%(好)细胞碎片为0.48%,细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数(仪器检测到的)为17525个,在细胞周期中分析的细胞数为17431个(即排除了碎片及聚集体后)CV是变异系数。

一般CV越小,峰形越好,越尖锐。

能控制在5%左右是比较好的结果,一般小于10%就可以认可了。

PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI(碘化丙啶)染色特点:一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合,二是不能通过功能正常的完整细胞膜。

PI单染检测细胞周期

PI单染检测细胞周期

PI单染检测细胞周期原理:碘化丙啶(Propidium ,简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。

碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光,并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。

细胞内的DNA被碘化丙啶染色后,可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定,然后根据DNA含量的分布情况,可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

操作步骤:1、对于悬浮细胞,直接离心收集细胞,弃上清,在4 ℃、1200rmp下用预冷的PBS洗细胞两次;对于贴壁细胞,先用不含EDTA的0.25%的胰酶消化再离心收集细胞;2、加入预冷的70%乙醇(PBS配制),于4℃固定过夜,或-20℃长期固定;3、离心收集细胞,以1 mL预冷的PBS洗细胞一次,加入预冷的PBS重悬细胞,调整细胞浓度为1.0×106,取出100 ul细胞悬液,加入RNase A酶,使RNase A终浓度为1 mg/ml,混匀后37 ℃水浴30 min;4、加入PI综合染色液,使PI终浓度为50 ug/mL,混匀,4℃冰箱避光保存;5、300目尼龙网过滤后,上机检测。

注意事项:1、细胞浓度一定要≧1×106/ml,特别是阴性对照管细胞量要大一些,以便样品电压调节;2、必须保证被检测样品为单细胞悬液;3、如果样品细胞为培养的贴壁细胞,将上清转入离心管(其中含有脱落的凋亡细胞),与不含EDTA的胰酶消化的细胞合并后离心收集细胞;4、在细胞固定时一定要将细胞吹开,吹成单细胞悬液;5、RNAse与PI综合染液分开的原因是RNAse的作用最适温度是37℃,而不是4℃,所以与教材有所不同;6、PI综合染液不能用蒸馏水配,否则细胞全部溶解,造成结果不可靠;7、4℃过夜一般隔天就进行检测,如果想推迟几天测,那就保存在-20℃,有资料显示-20℃可以至少保存一个月;8、70%~75%的酒精都可以用于PI单染固定。

PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)

PI单染细胞周期检测-protocol(mo--new)

PI单染检测细胞周期操作步骤:1、铺板:5×105 cells/ml,六孔板,每孔1ml。

2、血清饥饿法进行细胞同步化处理:无血清培养基培养8-12h,然后才加药。

注意:实验细胞应处于对数生长期,而不能是完全长满,一般在50~80%比较好。

自然状态下,不增殖的细胞应该处于G0/G1期。

周期特异性药物阻滞哪一期,哪一期就升高,不会使其他阶段细胞增多。

3、收集细胞悬浮细胞:直接离心收集细胞,弃上清,在4 ℃、1200rpm用预冷的PBS洗细胞2次;贴壁细胞:a.将上清转入离心管(其中含有脱落的凋亡细胞)b.PBS冲洗液c.不含EDTA的0.25%的胰酶消化1-5min后,将细胞吹打成单细胞悬液将a、b、c合并后1200rpm离心5min;弃上清;用PBS清洗一次,再次弃上清,加入1.5ml PBS重悬细胞;注:为了既保持初始条件相同,又可搜集到足够的细胞,可选用多孔培养板;在搜集细胞时,浓度大、抑制强的组可多搜集些孔,以保证检测的细胞数量。

4、固定:将细胞悬液加入预冷(-20℃)无水乙醇3.5ml,使乙醇终浓度为70%,4℃固定过夜。

注意:(1)加入无水乙醇的时候要逐滴、慢速;(2)不是向细胞中加70%乙醇,而是向细胞悬液中加无水乙醇,这样是为了减少细胞聚集;(3)在染色之前细胞4 ℃固定可保存3周;5、离心收集细胞:以预冷(4℃)PBS洗细胞一次,调整细胞浓度≧1.0×106;6、PI综合染液:弃上清,在106细胞中加入0.5ml综合染液,重悬细胞后37 ℃水浴30 min。

PI stocking solution:5mg PI+5ml PBS--------混匀于15ml避光离心管RNase A stocking solution: 10mg +1ml PBS--------混匀于1.5ml避光离心管Triton X-100:0.5ml+25ml PBS--------混匀于50ml避光离心管注:(1)RNase A于-20 ℃保存,其它4℃保存并避光;(2)Triton-X-100(曲拉通)主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核,提前两小时配,难溶;(3)在测细胞周期时,因为已经在细胞膜打孔了,PI易透过细胞膜和核酸结合,为避免干扰染色前需用RNAse A降解RNA。

PI染色检测细胞周期试验步骤

PI染色检测细胞周期试验步骤

.
染色检测细胞周期:protocolPI)消化收集对数生长期细胞(加热处含EDTA1、收集细胞:胰酶(*6个),吸取旧10理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×(根据培养皿大小决定量,PBS培养基到一个新离心管里;少量常温也要收集到上述离PBSPBS洗可以保证消化效率)洗2次,清洗的然后胰酶消化心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】;而不是成片脱落)显微镜下观察细胞呈单个,(注意一定要消化完全,后利用旧培养基中和胰酶;离心(1000r/300g 5min)收集细胞沉淀。

PBS清洗细胞两次。

2、用预冷的重悬细胞沉淀,使细胞充分悬浮预冷的PBS3、固定细胞:用0.5ml乙醇终无水乙醇(1.2ml预冷的99.7%成单细胞,再将重悬细胞加入浓度70%),吹打混匀以免细胞团聚,4℃固定至过夜。

2H1.84、细胞染色:离心(1000r/300g)收集固定的细胞,以5min才把细胞离mL的7000rpm(第一次实验时用PBS 洗细胞一次,离心1再次获取细胞沉淀后加入但最后流式结果显示细胞没有碎)心下来,30避光染色lPI,最后加入400μ30minlRNaseA00μ于37℃水浴℃均可)min(常温或4P用染色剂(据样本数,500uL 【有的试剂盒说明是:每个样本加入Triton 、A PI BS临时配好总量,其中50ug/ml、RNase 100ug/mL 染色30分钟】避光4)X-100
0.2% ℃、流式分析52
/ 1
.
结果用细胞万个细胞,2-3以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数
去FL2-A显示,和使用分析。

周期拟和软件ModFit分析时,FL2-w 除联体细胞。

2
/ 2。

PI染色检测细胞周期

PI染色检测细胞周期

PI染色检测细胞周期1)细胞样品的准备:(1)对于贴壁细胞:小心收集细胞培养液到一离心管内备用。

用胰酶消化细胞,至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。

再次收集到离心管内。

1000g左右离心3-5分钟,沉淀细胞。

对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清,可以残留约50微升左右的培养液,以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS,重悬细胞,并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50微升左右的PBS,以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

(2)对于悬浮细胞:1000g左右离心3-5分钟,沉淀细胞。

对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清,可以残留约50微升左右的培养液,以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS,重悬细胞,并转移到1.5毫升离心管内。

再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50微升左右的PBS,以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

2)细胞固定:将细胞加入到1毫升冰浴预冷70%乙醇中,快速轻轻吹打混匀,4℃固定2小时或更长时间。

固定12-24小时可能效果更佳。

1000g左右离心3-5分钟,沉淀细胞。

对于特定的细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清,可以残留约50微升左右的70%乙醇,以避免吸走细胞。

加入约1毫升冰浴预冷的PBS,重悬细胞。

再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50微升左右的PBS,以避免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

3)碘化丙啶染色液的配制4)染色:每管细胞样品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37℃避光温浴30分钟。

随后可以4℃或冰浴避光存放。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤PI(Propidium Iodide)染色是一种常用的细胞周期分析方法,可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。

下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤:实验步骤:1.细胞培养:将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期,并确保细胞数目足够。

2.细胞收获:将培养皿中的细胞用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤2次,以去除残留的培养基和衰老细胞。

然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。

3.细胞计数:采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。

确保每个实验条件下的细胞数相似。

4. 固定细胞:用70%(体积比)的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。

将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中,一般细胞浓度为1×10^6/ml。

放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。

5.染色:将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。

制备PI染色液,可以选择适当的PI浓度(如50μg/mL)然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中,使之均匀包涵。

在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。

6.流式细胞仪检测:使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。

在流式细胞仪前,将细胞过滤,以去除聚团的细胞。

7.数据分析:使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。

基于DNA含量,细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段,通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。

注意事项:1.实验要在无菌条件下进行,以避免细胞污染。

2.在染色时,应在黑暗的环境中操作,以避免PI受光照的影响。

3.使用流式细胞仪时,要注意正确设置仪器参数,以获取准确的测量结果。

4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备,以防止交叉污染。

以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤,根据实验的需求和细胞类型的不同,还可以对实验步骤进行适当的调整。

PI染色法测细胞周期

PI染色法测细胞周期

2. 凋亡研究
在G0/G1峰前出现一个 亚二倍体峰,即凋亡 峰。
检测调亡,可进行抗 肿瘤药物研究和某些 因素对细胞的损伤机 理的研究。
Annexin V Assay
R1
Fil e: 4
Acq ui si tion Date: 06- Mar -03
Quad Events % Gated X M ean Y M ean
正常人静止体细胞有46条染色体,相当于7.10-12 pg DNA/细胞核,我们称之为二倍体细胞,而正常增 殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期(G0,G1, S,G2 ,M)的各个时期,DNA含量随各时相呈现出周 期性的变化:在G1期,细胞开始RNA和蛋白质的合成, 但DNA含量仍保持二倍体;
通过核酸染料标记DNA,并由流式细胞仪进行分析, 可以得到细胞各个时期的分布状态,计算出G0/G1, S及G2/M的百分含量,了解细胞的增殖能力;结合 DNA指数分析,还可进行凋亡、异倍体等检测。
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
胞是否聚集或过多的碎片。
染料的选择取决于流式激光的配置。488nm的激光下 应用PI(碘化丙啶),由于PI也与RNA结合,所以分析 前样本应用Rnase处理.。重要的是染料要足够,以 保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少20ug/106 个细 胞。其最佳浓度为50ug/106 个细胞。
操作步骤
DNA细胞周期分析
G2 M
G0
G1

s
胞 数

细胞周期
DNA分析
G0G1
s G2 M
2N

PI染色法测细胞周期 ppt课件

PI染色法测细胞周期  ppt课件

ppt课件
16

正常人静止体细胞有46条染色体,相当 于7.10-12 pg DNA/细胞核,我们称之为 二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不 同的DNA含量。在细胞周期(G0,G1,S, G2 ,M)的各个时期,DNA含量随各时相 呈现出周期性的变化:在G1期,细胞开 始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保 持二倍体;
G1 G0
DNA Analysis
s
C o u n t
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800 1000
4N 2N DNA content
ppt课件 21
细胞浓度及质量要求


单细胞和核的上机浓度应约 106/ml 。浓 度太低,上机时样本的流速不得不提高, 这样就会影响检测的 CV 。浓度太高,则 可能导致染料的相对不足,最终使染色 不饱和,同样影响CV和检测结果。 制备完成后的标本应用光学显微镜检查 其质量:细胞是否聚集或过多的碎片。
ppt课件 17

进入 S 期后, DNA 开始合成,这时细胞核内 DNA 的 含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成为4倍 体时,细胞进入 G2 期, G2 期细胞继续合成 RNA 及 蛋白质,直到进入M期,因此,单纯从DNA含量无 法区分 G2 期和 M 期;一旦有丝分裂发生,细胞分 裂成两个子细胞,这两个子细胞或者进入下一个 细胞周期,或者进入静止期 (G0 期 ) ,而 G0 期从 DNA 含量上同样无法与 G1 期区分。因此,整个复 制周期可以描述为G0/G1,S,G2/M期。
ppt课件 23
操作步骤



取一瓶生长期的A549细胞,倒掉瓶中旧的培 养液,加入3mlPBS,细胞生长面在下轻轻晃 动细胞瓶,然后去掉液体,加入1ml胰蛋白酶 消化1~5分钟(以镜下观察决定) 加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面,制成细胞 悬液,将细胞悬液移至15ml离心管中 1500rpm离心5min,去上清。 加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液, 在旋涡状态下逐滴加入2ml-20℃95%冷乙醇, 混匀后固定30min。

细胞周期:PI染色

细胞周期:PI染色

细胞周期:PI染色
荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测,英文全称是PropidiumIodide。

它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。

尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。

PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm 和615nm。

实验方法:
取生长期的XXX细胞,加入3mL PBS,去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。

加入5mL PBS制成细胞悬液,移至15mL离心管中1500rpm离心5min,去上清液。

加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液,在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃95%冷乙醇,混匀后固定30 min。

加入5mL PBS,1500 rpm离心5min,去上清液。

加入5mL PBS重悬细胞,1500rpm离心5min,去上清液。

加入800μL PI染液,用枪轻轻吹打细胞团,混匀,室温避光染色30min。

用流式细胞仪上机检测。

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1、离心收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇,于4℃固定过夜,或-20℃长期固定(4℃过夜一般隔天就进行检测,如果想推迟几天测,那就保存在-20℃,有资料说-20℃可以保存一个月,个人建议尽量在最短时间内检测,有些实验是在不同时间点上收细胞,这时我就等最后一次固定完了一块测,基本上也多在一周内检测完毕,没有特地去比较保存时间对检测结果的影响)。

3、细胞染色
离心收集细胞,以1mL的PBS洗细胞一次,加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭(PI),100ug/mL RNase A,0.2% Triton X-100,4℃避光孵育30分钟(PI我是直接用PBS配成工作浓度,然后加入细胞沉淀混匀,RNA酶现加,但有时不加发现对实验结果也没太大的影响)。

4、流式分析
以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时,使用FL2-w和FL2-A显示,去除联体细胞,具体如下图。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份,如果有凋亡,在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好,可能在最前面还有细胞碎片峰。

结果解读
G0/G1期细胞占总的61.2%,峰位于横座标的45.76
G2/M期占13.07,峰位于横座标的91.43
S期占25.73
G2/G1为2.0(即G2期为4倍体细胞,而G1期为2倍体细胞,比值为2)
峰的变异系数为4.54%(好)
细胞碎片为0.48%,细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数(仪器检测到的)为17525个,
在细胞周期中分析的细胞数为17431个(即排除了碎片及聚集体后)
CV是变异系数。

一般CV越小,峰形越好,越尖锐。

能控制在5%左右是比较好的结果,一般小于10%就可以认可了。

PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
PI(碘化丙啶)染色特点:一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合,二是不能通过功能正常的完整细胞膜。

基于以上特性,目前主要有两大方面的应用,配方也不同:
一方面的应用是检测细胞周期,检测细胞周期时,为了保证所有的细胞都能染上PI,因此要将细胞用乙醇固定,并加入Triton X-100 ,以增加膜的通透性;同时由于DNA使细胞的粘附性增大,加入EDTA以降低细胞粘附性;为了消除RNA的干扰,要加RNAase。

由于要鉴定DNA含量,因此PI染料必须过饱和,所以PI 终浓度很高,一般50ug/mL。

由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰,因此可同时检测凋亡。

另一方面的应用是检测膜通透性(凋亡),由于PI不能进入完整的活细胞膜,因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。

Annexin V/PI凋亡检测试剂盒中就是这种染液,它的作用是鉴定死细胞,从而与凋亡细胞区分开来。

它的配制就是将PI溶于PBS,终浓度较低,一般2.5ug/mL。

所需试剂:
1、PI染液:
用于检测细胞周期的PI配制如下:
方法一:10×PI配制方法, 用时用PBS稀释至工作液:
5mg-----PI
0.1ml---Triton X-100
3.7mg--EDTA
10ml----PBS
2、RNaseA——2mg
方法二, 直接配制PI工作液:
PI -----5mg
RNaseA——2mg
1.0%Trition X-100——0.25ml
枸椽酸钠——100mg
生理盐水——65ml
调pH值至7.2-7.5
加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装,保存在4℃
操作步骤
1.细胞培养
铺细胞至6孔板或者35mm 培养皿,约4-5*10e5 cells/well, 如果要加药物,在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。

流式侧细胞周期对细胞的种板密度非常讲究,如果密度过高就会出现接触抑制,所以建议刚开始做预试验时可以种个细胞密度梯度。

2细胞收集,细胞培养至一定时间后,如果是贴壁培养的细胞,常规胰酶消化,PBS洗2-3次,制成单细胞悬液,并调整细胞数量至1-5*106 cells/ml。

3.细胞固定
3.1.加入3ml 预冷PBS重悬细胞,800 rpm×5 min,吸净上清。

3.2.加入500ul PBS,轻轻重悬细胞,使细胞分离为单个,逐滴加入预冷的100% 乙醇(-20℃)1.5 ml,使其终浓度为75% ,-20℃放置过夜固定,最长可以放置1周左右。

注意:固定细胞时,确保PBS悬浮细胞为单个,加入无水乙醇的时候要慢速,保证逐滴。

细胞保存在4℃也可以。

4.细胞标记
4.1.取出固定的样品,800 rpm×5 min,弃上清。

4.2.加入3 ml预冷PBS重悬细胞,800 rpm×5 min,离心收细胞。

注意:可重复1-2次,以除去乙醇
4.3.加入150 ul RNaseA(250-500 ug/ml PBS稀释)重悬细胞,37℃消化30分钟。

注意:做细胞周期时,RNaseA加与否对结果影响不大;如果要同时测凋亡,尽
量加入RNaseA。

另外,在做这步之前,可用200目滤网过滤
4.4.加入150 ul PI工作液,4℃避光染色30分钟。

注意:如果用方法二配制的直接PI工作液,其已含有RNaseA,因此4.3步应省略。

PI染液的量可根据细胞的多少来加,比如说有的人喜欢加500ul或1ml,其实只要和细胞完全孵育就可以,量多量少对结果不会影响太大。

4.5.转至流式检测管,上机检测,PI用488nm氩离子激光器激发,由630带通滤光片接收,通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞,采用设门技术排除粘连细胞和在碎片,分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率。

5、细胞周期分析:
正常人静止体细胞有46条染色体,为二倍体细胞,而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。

在细胞周期的各个时期(G0、G1、S、G2、M)中DNA含量随各时相呈现出周期性变化,在G1期细胞开始合成RNA和蛋白质,但DNA含量仍保持二倍体,进入S期后开始合成DNA,此时细胞核内DNA的含量介于G1和
G2期之间。

当DNA复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质,直到进入M期,因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期,一旦有丝分裂分裂成2个细胞,同样G0和G1期的DNA含量也无法区分。

PI荧光染料与DNA结合,其结合量与DNA含量成正比。

因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时将细胞周期各时相区分为G1 /G0期,S期和G2 /M期。

G1 /G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

如何看这个图:横坐标表示荧光强度,纵坐标表示细胞数量。

在每个图的旁边都会配有一些这个图的相关说明,如此图中我们看到Dip G1: 57.46 % at 48.73,表示G1/0期的细胞占总细胞的57.46,荧光强度在48.73;Dip G2: 10.49 % at 94.96同理表示:G2/M0期的细胞占总细胞的10.49%,荧光强度在94.96;大家可以算一下,二者之间荧光强度的比94.96/ 48.73应该是约等于2的,这就是说G2/M 期DNA含量为G1/0期的2倍,又验证了理论的推断。

同样S期所占百分比也会体现出来。

在肿瘤病理学中,通常以S期细胞数量来判断肿瘤增殖状态。

细胞增殖指数是指S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的百分比,它反映细胞的增殖能力。

6、调亡的结果判定
在FSC/SSC散点图上显示凋亡细胞比正常细胞小(FSC小),在PI荧光图上,G0/G1期峰前出现亚二倍体峰。

从这个图,我们可以看到在G0/G1期峰前出现了亚二倍体峰(绿色),右边有各项参数,其意义上文我已讲述过,大家可以仔细看一下,上文没讲过的地方,相信大家一看就明白了。

比如在右侧最后一行,写了Apoptosis:36.76% Mean:34.12,就指的是凋亡细胞占36.76%,其荧光强度在34.12。

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