五聚赖氨酸β-羰基酞菁锌：光动力疗法中一种有效的肿瘤靶向光敏剂

五聚赖氨酸β-羰基酞菁锌：光动力疗法中一种有效的肿瘤靶向光敏剂

介绍

作为一种潜在的抗癌方法，光动力学疗法正日益受到人们的关注。在各种光敏剂中，酞菁由于它优越光敏特点而被广泛的研究：在670nm处的强吸收（此处光的组织穿透深度是卟吩姆钠630nm处的两倍)，选择性地被肿瘤细胞摄取，具有低毒性，高化学和光化学稳定性的特点。然而，未被取代的酞菁是疏水的，在体液中难溶。在一些实验研究中发现，大部分的两亲性光敏剂比相同类型的疏水或亲水分子具有更高的光学动力。酞菁外周的磺基取代是个很好的方法增加酞菁的水溶性，因而它们更适合在生理系统中使用，CAUCHON等人发现将酞菁用三个磺酸集团和一个疏水的乙炔基取代大大增加了细胞摄取，优先定位在线粒体膜，对emt-6L老鼠乳腺的肿瘤细胞产生光学动力效应。邻二磺酸酞菁比对二磺酸酞菁有更好的活性。他们在培养的细胞和实验动物的肿瘤细胞中可以有效的穿透细胞并显示出高效的光动力学效应。新近的研究表明ZnPc-S2P2可在体外有效杀灭肿瘤细胞，而体内使肿瘤凋亡。此种两性光敏剂的临床一期实验正在进行。另一种二磺酸盐衍生物，AlPcS2，也证实主要通过杀灭肿瘤细胞而非损害血管来引起肿瘤衰亡。

在光敏剂中引入正电荷取代基不仅可增加酞菁环的极性和溶解性，还可以增加细胞摄取并提高对肿瘤细胞及细胞内位点的靶向性。观察发现，阳离子吡啶酞菁锌比阴离子及中性酞菁锌有更强的细菌光毒性。另外，研究还发现，N-甲基吡啶氧基酞菁和多聚L-精氨酸氯e6？可使革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌失活。

将取代酞菁纯化为单一异构体面临着很大困难。非对称性取代酞菁则由于存在多种异构体难度更大。我们开发了一种可实现大规模制备单取代β-羰基酞菁锌的合成与纯化方案。在此化合物的基础上，我们合成了一非对称酞菁锌共轭体系，ZnPc-(Lys)5。该共轭化合物的定量细胞摄取及光毒性都与ZnPc-S2P2及ZnPc-S4做了比较。光动力活性评估方面，体外引入三种细胞株（人源胃癌细胞，人源慢性髓性白血病细胞及人胚肺成纤维细胞），而体内实验对象为昆明鼠皮下植入的S180肿瘤。我们还进行了该多聚赖氨酸酞菁锌的药代动力学及生物分布方面的研究。我们的研究表明，ZnPc-(Lys)5在体内外具有优良的光动力学效应。这表明ZnPc-(Lys)5可能成为一个有价值的临床前研究的候选药物。

结果和讨论

在癌症的光动力疗法中，酞菁是一种强效的光敏剂。人们也常解析酞菁衍生物的水溶性及肿瘤靶向性等生物学性质。尽管如此，取代酞菁，尤其是非对称取代物的大规模纯化为单一异构体始终有不小的挑战。我们认为ZnPc-(Lys)5为高纯度，水溶性的酞菁锌光敏剂。由于，肿瘤细胞比正常细胞有着更多的净负电荷，因此光敏剂中荷正电的五聚赖氨酸基团可具备肿瘤靶向性。此外，由于内吞作用，细胞对带正电荷的物质（尤其大分子量物质）有着比中性或负电荷分子更大的摄取量。

ZnPc-(Lys)5的性质

ZnPc-(Lys)5大量制备，通过反相高效液相色谱纯化（图1），纯度为99%。通过核磁共振及质谱对ZnPc-(Lys)5的结构进行了确认(calculated for C63H76N18O7Zn m/z: 1262.80,found: 1263.9)。在DMSO中，ZnPc-(Lys)5的紫外可见吸收图谱对于ZnPc是典型的，最大吸收峰位于678 nm (e=118380 Lmol1cm1)。在DMSO中，ZnPc-(Lys)5的单线态氧的量子产率为0.64，这与ZnPc的0.67相似，这表明五聚赖氨酸基团并未严重改变单线态氧的产生。

光敏剂的细胞摄取

ZnPc-(Lys)5及其他两种阴离子ZnPcs的细胞摄取皆为剂量依赖性，即ZnPc浓度越高，细胞摄取越多（图2）。在三种细胞株（BGC-823, K562, and HELF）中，ZnPc-(Lys)5比其他两种阴离子ZnPcs的细胞摄取高出许多。这有可能是五聚赖氨酸带正电荷之故。另外，在2小时的培养时间内，肿瘤细胞（BGC-823,图2a;K562的摄取曲线与BGC-823相似）对ZnPc-(Lys)5的摄取显著高于正常细胞（HELF,图2b）。五聚赖氨酸的细胞摄取增多与带正电荷的ZnPc-(Lys)5和因过度表达多聚唾液酸残留物而带负电的肿瘤细胞表面之间的离子作用有关。

光敏剂的亚细胞定位

图2c表明在经过2个小时的培养后，ZnPc-(Lys)5进入K562细胞内部。而对于阴离子的ZnPc-S2P2及ZnPc-S4,此时段细胞内部并未积聚。这些发现与上文讨论的ZnPc-(Lys)5的细胞摄取量更高相符。光敏剂的亚细胞定位有过很多报道，研究发现，这与光敏剂及多肽或配体的性质均有关系。Lo等人报道经过2小时培养后，1,3-二甲氨基-2-丙氧基取代ZnPc定位于人HT29大肠癌细胞膜。然而，经过24小时培养后，对称阳离子，中央Si原子被两个基团取代的3 - 吡啶氧基硅酞菁优先定位至人HEp2细胞溶酶体。一系列带阳离子的酞菁-多肽共聚物优先定位溶酶体。一些PEG取代的卟啉衍生物及一些阳离子卟啉亦可定位溶酶体。阴离子，如磺酸或羧酸盐取代的光敏剂优先定位溶酶体，而光照后则定位细胞核。而阳离子取代的亲脂性光敏剂则可穿过线粒体膜并在线粒体内部积聚。线粒体这一亚细胞器是细胞凋亡的关键组件，是PDT中细胞死亡的通路。这些多种研究结果提示对于亚细胞定位，细胞摄取动力学，以及酞菁光敏剂之间关系的进一步研究十分必要。

酞菁锌的光毒性及暗毒性

在K562细胞的2小时培养中（图3a），比起ZnPc-S2P2或ZnPc-S4，ZnPc-(Lys)5都剂量依赖地呈现出更强的光毒性，这与其更高的细胞摄取一致。在K562细胞中，ZnPc-(Lys)5的IC50为10μm，而ZnPc-S2P2则>30um。光毒性与培养时间紧密相关。图3b显示，如增加为24小时，ZnPc-(Lys)5与ZnPc-S2P2的IC50分别降至0.2um和4.3um。而对于阴离子的ZnPc-S4，光毒性微乎其微，且增加培养时间并不提高对K562的光毒性：图3b显示，2小时及24小时两种不同的培养时间下IC50值无异。BGC-823也观察到了类似的结果。我们也考察了这些光敏剂对于成纤维细胞株（HELF）的光毒性。与肿瘤细胞（K562，图3c）相较，ZnPc-(Lys)5对HELF的毒性小得多。ZnPc-(Lys)5对HELF细胞的IC50至少比对肿瘤细胞K562的IC50高5倍。这可能与HELF细胞对ZnPc-(Lys)5的摄取比肿瘤细胞低有关。值得关注的