优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌
荧光光谱法检测微藻中油脂_胡小文
荧光染料 , 能与脂类物质 , 包括蜡脂和三酰甘油及游 离脂肪酸结合 , 在 543 nm的激发光照射下 , 显示波 长为 598 nm的桔红色荧光 , 在 450 ～ 500 nm的激发 光照射下 , 显示波长大于 528 nm的金黄色荧光 [ 4] 。 当环境的极性减弱时 , 最大发射峰会蓝移 , 选择合适 的激发波长和发射波长 , 可以区分细胞中的极性脂 和中性脂 [ 5] 。大量研究表明[ 6 -9] 尼罗红可以对细胞 中的油脂进行定量分析 , 细胞经染色后的相对荧光 强度与细胞内油脂含量显著相关 。
采用 TAP液体培养基 , 在 28℃、2 500 lx、150 r/ min下培养藻株到对数生长期 。 1.3.2 藻液细胞密度与 OD600关系的测定
将藻液稀释 成密度梯 度 , 以 TAP培养 基为空 白 , 利用 754 -UV分光光度计测其 OD600 , 同时利用 血球计数板 进行显微 计数 (每 个藻样重 复计 数 4 次 , 取平均数 ), 对 OD600与相对应的 细胞个数进行 回归分析 。 1.3.3 藻液细胞的染色及荧光检测
取对 数 生 长 末 期 的 藻 液 , 8 000 r/min离 心 2 min, 弃上清液 , 用 PBS缓冲液重悬至不同密度 , 测 定尼罗红染色的最适藻液密度 , 同时对尼罗红染色 时间 、尼罗红染料质量浓度 、二甲基亚砜体积分数等 指标进行试验 , 利用荧光分光光度计进行平行检测 以获得最适的染色条件 。 2 结果与分析 2.1 藻液细胞密度与 OD600的相关性 按照 1.3.2方法 , 以藻液 OD600 (X)为横坐标 , 以显微计数得到的细胞密度 (Y)为纵坐标做图 (见 图 1), 并 进 行 回 归 分 析 , 得 回 归 方 程 为 :Y= (1.648X - 0.137)×109 , R2 =0.995, 表 明 藻液 OD600与细胞密度呈显著正相关 , 说明藻液细胞密度 可以用 OD600来表示 。
尼罗红荧光染色法的优化及应用
尼罗红荧光染色法的优化及应用石健;张雯婕;冯汛;胡雨婷;瑶池【摘要】The chlorella is screened as material to optimize Nile red fluorescent measure ,and it is used to trance the varia-tion on microalgae oil in sewage .The experiment finds out that the dye won’t work until microalgae is broken by ultrasonic , and the addition of DMSO will enhance fluorescence reaction .The optimization result isdetermined :VDMSO∶Vsewage = 1∶5 ,5 min broke cell by ultrasonic and dye 5min ,NR 1 .5 μg/mL .As to the application ,microalgae oil accumulation is only half compared to medium ,indicating that sewage is not conducive to microalgae oil accumulation ,and the best harvesting time is stationary phase ,when the yield and oil content reaches the highest of micro algae .%以自主筛选的小球藻为材料对尼罗红荧光染色进行条件优化，并用该方法追踪微藻在污水中的油脂含量变化。
实验发现，微藻只有经过超声波破碎，染色才会出现荧光，DMSO 的添加会增强荧光反应。
尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量
尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永【摘要】尼罗红-荧光光谱法能够快速地对微藻细胞中的油脂含量进行检测,但是该方法对所测微藻物种具有一定依赖性,在分析不同微藻细胞油脂含量前需要对测试条件进行优化.优化后的亚心形扁藻油脂含量分析条件为:藻液800×g离心5 min 去除培养基,用体积分数4％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液重悬至OD750=0.3,尼罗红质量浓度0.8 μg/mL,避光40℃水浴恒温10 min,激发波长520 nm.发现亚心形扁藻在培养的对数生长后期油脂开始积累,稳定期后期油脂含量趋于恒定,优化后的尼罗红-荧光光谱法能够准确地检测亚心形扁藻生长过程中的油脂含量变化.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2016(041)010【总页数】4页(P98-101)【关键词】亚心形扁藻;尼罗红;荧光光谱法;油脂含量【作者】宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永【作者单位】中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580【正文语种】中文【中图分类】TS222;TQ646随着全球能源消耗量的不断增加，不可再生的化石能源日渐短缺，而使用化石燃料还会产生大量的CO2及硫、氮氧化物等有害气体危害环境。
生物柴油是一种通过甘油三酯或游离脂肪酸与短链醇的酯基转移反应或酯化作用形成的单烷基酯，它经过稍微改性或不改性就可以在传统的柴油机中使用[1]。
生物柴油由于环境友好及可再生性，成为较理想的替代能源之一。
微藻具有光合效率高、生长周期短、含油量高等优点，是生产生物柴油的理想原料[2]。
提高微藻油脂含量是降低生物柴油成本的重要途径，是微藻生物柴油产业化亟待解决的关键问题之一。
尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究_林义
Abstract: [Objective] To establish a simple method to screen oleaginous yeast and determine the intracellular lipid content. [Methods] The study is based on the theory that the combination of nile red and intracellular oil will emit fluorescence when induced by UV light and the fluoresence indensity is associated with the lipid content. We cultivate yeast in the culture medium added with nile red, and screen the oleaginous yeast strains from the 385 deep-sea yeasts by measns of obeserving the fluorescence of the yeast colony. We have identified the screened oleaginous yeast strains by the 26S rDNA D1/D2 series analysis method. Designating one of the oleaginous yeasts (2A00015) as the test strain, the lipid content rapid determination method by nile red dyeing was established. [Results] 22 oleaginous yeasts were obtained with the lipid content reaching up to 62.9%. Based on the molecular identification, it showed that the 22 yeasts are separately belong to Candida viswanathii, Candida parapailosis, Rhodotorla mucilaginosa, Debaryomyces hansenii, Pichia guilliermondii and Rhodosporidium paludigenum. The optimum condition for lipid content determination by nile red dyeing is: bacterium suspension OD600 lower than 1.2, nile red concentration 0.5 mg/L, dyeing time 5 min, exciting wavelength 488 nm, ssion wavelength 570 nm. The relative fluorescence intensity obtained by this method exhibits a positive association with the lipid content obtained by weighing method, which can be explained as R2=0.9637. Keywords: Nile red dyeing, Oleaginous yeast, 26S rDNA D1/D2, Fluorescence, Lipid content 在适宜条件下, 某些微生物产生并储存的油 脂占其生物总量的 20%以上, 具有这样表型的菌 株称为产油微生物, 包括细菌、酵母、霉菌、藻 类[1−2]。 其生产的油脂与植物油脂相似, 多以 C16、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸等 。 C18 为主, 如棕榈油、 传统产油微生物筛选主要通过染色观察、提取油 脂、测定含量等一系列步骤, 过程十分繁琐, 不 利于大量筛选。 尼罗红是一类苯吩哑嗪酮类化合物, 能够与 脂类物质结合发出很强荧光, 不溶于水且易溶于 有机溶剂
尼罗红和 BODIPY 荧光染料在微藻油脂含量测定中的应用
尼罗红和 BODIPY 荧光染料在微藻油脂含量测定中的应用郝翠翠;梁成伟;石蕾【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2017(34)1【摘要】In the face of energy crisis , using microalgae to produce biofuel and high value-added products has attracted great attention . Microalgae constitute a diverse group of microorganisms with advantages like fast and efficient growth .In addition, they do not compete for arable land and offer very high lipid yield potential .Microalgae are currently considered as the most promising alternative sources for the next generation of food , feed, cosmetics and renewable energy in the form of biofuel .Major challenges for the development of this resource are to select lipid-rich strains using high-throughput staining for neutral lipid content in microalgaespecies .Compared with traditional quality method, the fluorescent staining method is simpler , cheaper and easier to operate .In this article, the properties of fluorescent Nile red and BODIPY and the use of fluorescentfor lipid measurement in microalgae were summarized .%面对能源危机，利用微藻生产生物燃料及其相关高附加值产品引起了人们的极大关注。
微生物胞内油脂染色法检测技术进展_李艾
and more attentions to it. In this paper，the characteristics of microbial lipids and synthetic approach，three main
methods and the progress of staining detection intracellular lipid of microorganism were reviewed.In addition，the
图 1 动物体内和微生物体内不饱和脂肪酸（ PUFAs） 的 生物合成途径［6］
Fig.1 The biosynthetic pathways of polyunsaturated fatty acids（ PUFAs） for animals and microorganism［6］
2 苏丹染色检测技术
目前，常用的油脂含量测定方法有： 油脂抽提称 重法： 如索氏抽提法、有机溶剂法、酸水解法、超临界 CO2 萃取法等，此类方法需要大量的样品经过细胞破 碎处 理，溶 剂 消 耗 量 大，操 作 繁 琐 耗 时 耗 力，不 适 合 大批量的筛选研究和实时测定； 染色法： 如苏丹染色 法、尼罗红染色法、磷酸香草醛显色法等。染色法比 油脂抽提称重法更简单，样品需求量少，且节约大量 的时间。因 此 油 脂 染 色 检 测 技 术 是 一 种 快 速、简 单 的油脂测定 方 法，可 提 高 科 研 和 生 产 中 油 脂 测 定 效
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发现菌株经过苏丹黑染色后菌体内油脂颗粒被染成 黑色，可依据黑色油脂颗粒的大小，油脂颗粒的多少 初步筛选产油脂能力强 的 菌 株。 马 丽 娟 等［10］ 利 用 细 胞化学方法苏丹Ⅲ染色法对 4 株高产油脂菌株进行 初筛，得到 一 株 细 胞 内 含 有 较 多 脂 滴 的 菌 株。 他 们 对两株酵母菌和两株霉菌染色，经二甲苯洗脱，沙黄 复染后，显微镜下观察菌丝体成粉红色，油脂颗粒呈 亮黄色。宋安东等［11］从微观方面，先用苏丹黑染色， 显微镜下观 察 脂 肪 粒 数 目 和 大 小，发 现 细 胞 和 菌 丝 呈红色，菌体内的脂肪颗粒呈蓝黑色； 后用苏丹Ⅲ菌 泥染色法观 察 菌 体 颜 色，他 们 发 现 对 含 油 脂 菌 体 在 苏丹Ⅲ染色 时，发 现 颜 色 的 变 化 与 菌 体 含 油 量 之 间 有较好的相关性并呈现一定的规律，低脂 菌 体 颜 色 偏红，高脂菌体颜色偏灰。Ines Schulze 等［12］将从土 壤 中 筛 选 出 的 酵 母 菌 体 影 印 到 滤 纸 ，将 吸 附 了 菌 体 的滤纸经 过 干 燥，0.08 % 的 苏 丹 黑 染 色，用 96 % 的 乙醇两次冲 洗 后，观 察 颜 色，滤 纸 被 染 成 蓝 色 的 位 置 相 对 应 的 菌 体 可 能 为 产 油 脂 菌 株 ，此 方 法 可 一 次 性处 理 多 个 样 品，节 省 了 筛 选 菌 体 时 间。 Liu 等 人［13］从森林土样得到的 61 株真菌、酵母和细菌，利 用苏丹黑染 色，后 镜 检 观 察 胞 内 脂 滴 筛 选 出 16 株 产油脂真菌。Varavut Tanamool 等［14］ 同 时 利 用 苏 丹 黑和尼罗 蓝 染 色 法 观 察 Hydrogenophaga sp. 菌 株 在 蔗糖培 养 基 中 连 续 培 养 积 累 PHA （ 聚 羟 基 脂 肪 酸 酯） 的情况。
快速高通量测定三角褐指藻油脂含量
快速高通量测定三角褐指藻油脂含量曹素娟;柳科欢;任玲萱;侯兴国;卿人韦;兰利琼【摘要】为了实现三角褐指藻细胞内油脂含量的快速高通量测定,探索了尼罗红荧光染色法检测其油脂含量的检测条件.采用96孔板并配合酶标仪考察三角褐指藻的预处理液的种类及其用量、染色液尼罗红的用量、染色温度、染色时间以及细胞浓度对荧光强度的影响,确立最优染色条件,并研究荧光强度与油脂含量之间的对应关系.结果表明,TritonX-100终浓度为0.05％时,通透效果最佳,每100 μL藻悬液中加3μL尼罗红染液(0.1 mg/mL),温度40℃,时间10 min,细胞浓度低于3×106个/mL 时,荧光强度(y)与油脂含量(x)之间呈现良好的线性关系:y=927.37x+15.913,R2=0.9247.方法优化后,90 min即内可完成对96个样品的处理及分析,极大提高了分析的通量.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(055)006【总页数】6页(P1331-1336)【关键词】三角褐指藻;高通量;油脂含量;尼罗红;荧光染色【作者】曹素娟;柳科欢;任玲萱;侯兴国;卿人韦;兰利琼【作者单位】四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064;四川大学生命科学学院,成都610064【正文语种】中文【中图分类】Q9451 引言近年来，由于化石燃料资源的日益枯竭，人类亟需找到替代品. 海洋微藻由于来源广泛、环境友好、可再生等优点吸引了越来越多人的关注. 目前生物柴油的来源主要有大豆、棕榈种子、菜籽油以及动物脂肪等[1-3]，但是这些仍然不能满足当前经济发展对生物柴油的需求，而且还存在与粮食作物竞争耕地的问题. 微藻具有生长周期短、可再生、不与粮食作物竞争耕地、生产的生物柴油清洁环保等特征，因此，利用微藻生产生物柴油日益受到关注. 尽管一些微藻如原始小球藻[4]、鞘藻属[5]、雨生红球藻[6]、杜氏盐藻[7]等可以高效地生产优质生物柴油. 但是微藻种类仍然非常有限. 如何从大量的微藻中快速高通量筛选出油脂含量高的藻种仍是一个亟需解决的问题. 目前，对油脂的定量测定主要采用的方法有Bligh-Dyer法[8]，简化重量法[9]，香草醛比色法[10]等，这些方法均需要提前将藻液离心冻干、反复萃取、旋转蒸发等，不仅需要的藻量较大，过程繁琐耗时，并且提取过程中所用的有机溶剂对人体有很大的危害性. 为了解决上述问题，实现油脂含量的快速高通量测定，本研究利用96孔板作为反应器并配合荧光染料、酶标仪测定，90 min内即可完成对96个样品的分析测定工作，极大地提高了分析的效率.尼罗红(9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one)是一种脂溶性的疏水性染料，能够与细胞内的脂类物质结合，在特定的激发波长下发射出橘黄色的荧光，因此常被用于哺乳动物、细菌、酵母、藻类等的油脂定量分析[11-13]. 经尼罗红染色的微藻细胞的荧光强度与细胞内油脂含量显著相关. 在定量分析中，尼罗红进入细胞与脂类结合以后，荧光强度的检测可以利用荧光分光光度计[13]、酶标仪[14]、流式细胞仪[15]等仪器. 采用酶标仪检测经尼罗红染色后细胞的荧光强度的方法，具有灵敏度高、操作流程简单、所需要的样品量少、一次可检测的多个样品等特点，利于产油微藻的快速筛选. 目前尼罗红染色富油微藻面临的主要问题是有些微藻细胞壁较厚，细胞通透性较差，油脂定量不准确. 通常可以采用物理方法如微波[16]、超声波[17]、化学方法如二甲基亚砜[14]或者TritonX-100等处理细胞，从而改善细胞的通透性.三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一种海洋硅藻，属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属[18]，是海洋硅藻研究的模式藻种. 三角褐指藻在对数生长期结束后开始积累油脂，油脂积累量可占细胞干重的20%～30%，应用前景非常广阔. 本文以三角褐指藻为研究对象，采用尼罗红荧光染色法，酶标仪检测，系统地优化染色条件，包括检测波长、预处理液的种类及其用量、尼罗红用量、细胞浓度、染色温度、染色时间、尼罗红用量等条件的优化，为微藻油脂的快速检测提供参考方法.2 材料与方法2.1 材料三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，编号为MACC/B288，来自中国海洋大学藻种种质库.尼罗红(Nile red)，购自索莱宝公司；丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、TritonX-100、甲醇、乙醇、异丙醇等均为分析纯.2.2 方法2.2.1 尼罗红母液的配制取一定量的固体尼罗红溶于丙酮中，质量浓度为0.1mg/mL，2～8 ℃避光保存.2.2.2 磷酸缓冲液(PBS)配方(pH 7.4) 称取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO43.5814 g，KH2PO4 0.272 g，溶于900 mL蒸馏水中，用1 M的盐酸调pH至7.4，定容至1 L，高压灭菌自然冷却后备用.2.2.3 藻种培养三角褐指藻采用常规方法培养，即高压灭菌的f/2培养基，培养温度(21±1) ℃，光照强度2500 lx，光暗比为12∶12(h∶h)，接种浓度(1.5～3.0)×105个/mL，每日摇动3～4次，并且随机调动三角瓶的位置使光照均匀，培养至对数生长期结束后开始取样.2.2.4 三角褐指藻生长曲线从接种日开始，于0～10 d，取三角瓶中细胞，进行细胞计数(B204LEDR生物显微镜)，绘制三角褐指藻生长曲线图.2.2.5 荧光光谱测定方法取96孔板(WHBA-96孔板)，在同一孔中依次加入80μL藻液、20 μL DMSO、2 μL尼罗红溶液，40 ℃避光染色10 min，采用全波长酶标仪检测(Thermo varioskan flash全波长酶标仪)，设置激发波长的范围为450～560 nm，发射波波长范围为510～720 nm.根据荧光光谱的扫描结果来确定最大激发波长和发射波长.2.2.6 染色条件的探索结合Chen[14] 等的方法和本实验室的研究经验，初始的染色条件为：取96孔板，每孔分别加入用水、PBS、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、DMSO、0.1%的TritonX-100处理的三角褐指藻悬液100 μL，除对照组为水，试验组采用浓度均为20%的透性化试剂[20, 21]，即各透性化试剂与藻液体积比为20∶80. 此外，为排除干扰，不加藻液的背景荧光值也分别测定.按每100 μL处理液加2 μL尼罗红母液，每个处理3个重复，40 ℃避光染色10 min，经酶标仪测定，实验结果为3个重复的平均值.采用单因素变量法，分别对每个参数进行优化.2.2.7 油脂含量的测定方法油脂的提取采用溶剂浸提法，取适量对数生长期结束后的三角褐指藻藻，分别稀释成0.5×106、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106 个/mL，分别取50 mL低温离心收集藻细胞，75 ℃真空干燥至恒重，将干燥的藻细胞移至研钵内充分研磨，然后将粉转至4.5 mL离心管内，并向离心管内加入2 mL石油醚∶乙醚(2∶1)进行抽提，在旋涡混匀器上振荡混匀，25 ℃浸提5～10 h，每30 min振荡混匀一次，加入1 mL10%的KOH溶液，振荡混匀，离心取上清至另一已称重的4.5 mL离心管中，旋转真空干燥仪中55 ℃烘干称重.2.2.8 数据处理方法所有测试都重复三次，数据统计分析采用SPSS17.0进行，采用均值±标准差(x±SD)为表示方法，不同样品之间的差异采用单因素方差分析进行比较，以P<0.05为有显著性.3 结果与分析3.1 三角褐指藻生长三角褐指藻在第5 d之前，后一天藻数目是前一天的约2倍，这是由于培养基中营养充足，藻的长势最佳(图1). 第0 d到第1 d由于藻种在新环境中需要一个适应期，所以几乎不会生长(藻数目由0.27×106个/mL上升至0.31×106个/mL)，第1 d至第2 d(藻数目由0.31×106个/mL上升至0.6×106个/mL，接近2倍增加)，第2 d至第3 d(藻数目由0.6×106个/mL上升至1.6×106个/mL同样接近2倍)，直到第5 d至第6 d(藻数目由5.67×106个/mL上升至7.12×106个/mL，增幅较小)，往后几天藻数目增幅越来越小，第5 d之后由于营养逐渐缺乏造成藻的生长速率变慢，对数生长期结束，后续实验样本采用接种第5 d后的藻.图1 三角褐指藻生长曲线Fig.1 The growth curve of Phaeodactylum tricornutum3.2 三角褐指藻尼罗红染色油脂的荧光光谱确定对尼罗红染色后的三角褐指藻进行荧光光谱扫描，获得荧光光谱扫描图.结果显示，尼罗红染色后的油脂最大激发波长为526 nm(图2)，最大发射波长为597 nm(图3). 尼罗红荧光染色法的最佳激发波长范围是450～550 nm，而最佳发射波长范围是540～605 nm[19]；而Ren[20]等的研究结果表明尼罗红染色法的最佳激发和发射波长分别为530 nm和568 nm；Siegler et al[21]的结果表明最适波长为527 nm和590 nm. 本文扫描波长的结果和前人的研究结果一致，这说明方法是可靠的.图2 最大激发波长扫描图谱图Fig.2 Maximum excitation wavelength scanning map图3 最大发射波长扫描图谱Fig.3 Maximum emission wavelength scanning map3.3 染色条件的优化3.3.1不同有机溶剂预处理对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、2 μL尼罗红母液、40 ℃避光染色10 min条件下考察体积分数为20%的不同有机溶剂预处理对荧光强度的影响，结果见图4a.(a)(b)(c)(d)(e)(f)图4 三角褐指藻尼罗红染色法条件优化(a)注：对照组为水，试验组采用浓度均为20%, 不同字母表示差异显著(P<0.05)；(b)～(f)注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)Fig. 4 Optimization of nile red dyeing method for Phaeodacylum tricornutumDifferent letters indicate significant differences (P<0.05)以水为对照，体积在藻液中占比均为20%的不同透性化试剂处理，检测荧光强度. 由图4a可知，与水和PBS相比，甲醇、丙酮处理的藻细胞荧光强度增加不明显，乙醇、异丙醇和DMSO处理的藻细胞荧光强度增加较明显，而荧光强度增加最明显的是0.1% TritonX-100处理过的藻细胞. 因此选择20%的TritonX-100(质量分数0.1%)作为藻细胞预处理液.3.3.2 0.1%的TritonX-100体积分数对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、2 μL尼罗红母液、40 ℃避光染色10 min条件下考察不同体积分数0.1% TritonX-100对荧光强度的影响，结果见图4b.结果显示，0.1% TritonX-100体积分数从1%～20%，荧光强度依次升高，20%达到最大值(图4b). 低浓度的预处理液渗透性弱，因此在一定浓度范围内，随着预处理液浓度增大荧光强度也增大；20%～40%范围内，由于较高浓度的TritonX-100会对藻细胞产生毒性，因此荧光强度逐渐降低. 整体而言，20%的荧光强度最大，1%的最小. 因此， 0.1% TritonX-100最适体积分数为20%.3.3.3 不同浓度尼罗红对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同体积尼罗红母液对荧光强度的影响，结果见图4c.结果显示，0.1 mg/mL尼罗红丙酮溶液体积为0.5～3 μL时，荧光强度依次增大，3 μL时达到最大值，当尼罗红丙酮溶液体积超过3 μL时，由于高浓度尼罗红对藻细胞有一定的毒害性，荧光强度逐渐变小(图4c). 因此，优选尼罗红用量3 μL为最适用量.3.3.4 染色时间对染色的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3 μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同染色时间对荧光强度的影响，结果见图4d.由图4d可知，当染色时间为3～10 min时，荧光强度依次增大，10 min时荧光强度达到最大；10～30 min，而随着时间的增加荧光逐渐淬灭，荧光值逐渐变小. 因此，仍优选10 min为最佳染色时间.3.3.5 不同染色温度对荧光强度的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3 μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同染色温度对荧光强度的影响，结果见图4e.由图4e可知，当染色温度在20～40 ℃时，荧光强度逐渐变大，40 ℃时荧光强度达到最大，当染色温度为40～60 ℃时，由于高温影响了藻细胞活性，荧光值变小. 因此，后续实验仍选40 ℃时为最佳染色温度.3.3.6 不同浓度藻细胞对荧光强度的影响实验在藻细胞浓度为5×106 个/mL、3μL尼罗红母液、0.1% TritonX-100体积分数为20%，40 ℃避光染色10 min条件下考察不同藻细胞浓度对荧光强度的影响，结果见图4f.由图4f可知，当藻细洗吧胞个数为1×106～3×106个/mL时,荧光强度逐渐增大，当藻密度为3×106个/mL时，荧光强度达到最大，当藻密度大于3×106个/mL 时，由于藻互相遮盖，造成染色不均匀，荧光强度逐渐降低. 因此，优选藻密度为3×106个/mL时为最佳藻细胞浓度.3.4 藻液油脂含量与荧光强度的相关性分析为了建立三角褐指藻的油脂含量与荧光强度之间的相关关系，分别采用上述优选的尼罗红染色法和溶剂浸提法，测定了在藻细胞浓度不同、藻液体积相同的条件下藻的荧光强度和油脂含量，对荧光强度(y)和油脂含量(x)之间进行回归分析，结果见图5.图5 藻液油脂含量与荧光强度的相关性分析Fig.5 Correlative analysis of oil content and fluorescence intensity of algae由图5可以看出，当荧光强度为0～140，细胞浓度为0.5×106、1×106、2×106、3×106个/mL时，其相关性较好，回归方程为y=927.37x+15.913，R2=0.9247,说明其相关性较好. 因此，可以利用尼罗红染色法快速检测三角褐指藻内油脂的含量.4 讨论尼罗红染色法为测定微藻细胞内油脂含量提供了一种便捷的方法，该方法最大的优势是高通量. 但是由于藻细胞外面的一层厚而坚硬的细胞壁，为油脂含量的测定带来了困扰，不经透性化试剂处理可能会导致油脂定量误差. 并且其他染色条件也影响检测效果，如染液浓度、藻细胞浓度、染色时间和温度等，因此优化各种染色条件对建立一种快速准确高效的方法具有重要价值. 经过透性化试剂处理，三角褐指藻荧光值在处理前后有了较大改变，其中其中20%体积比的TritonX-100(质量分数0.1%)的处理效果最佳. 推测透性化试剂，尤其是TritonX-100，改变了三角褐指藻细胞壁和细胞膜的通透性，提高了尼罗红对油脂的染色效果. 对其他影响如染液浓度、藻细胞浓度、染色时间和温度也进行了优化，极大地提高了染色灵敏度和准确度.综上，本研究采用96孔板高通量方法，尼罗红荧光染色，酶标仪快速检测，对染色条件进行了优化，建立了一种准确、快速高效、高通量的尼罗红荧光染色检测三角褐指藻油脂含量的方法，为进一步三角褐指藻的研究打下良好的基础，为其他微藻油脂的快速检测提供了参考方法.参考文献:【相关文献】[1] Felizardo P, Correia M J, Raposo I, et al. 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Algal Res, 2015, 7: 11.[21] Siegler H D L H, Ayidzoe W, Ben-Zvi A, et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures[J]. Algal Res, 2012, 1: 176.。
微藻细胞油脂含量的快速检测方法_张敬键
中国生物工程杂志China Biotechnology ，2012，32（1）：64-72微藻细胞油脂含量的快速检测方法*张敬键1吕雪娟2李爱芬1万凌琳1吴洪3尹顺吉3张成武1＊＊（1暨南大学生命科学技术学院热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心广州510632）（2华南农业大学测试中心广州510642）（3新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室廊坊065001）摘要以斜生栅藻（Scenedesmus obliquus JNU20）为实验材料，采用尼罗红（NR ）荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法（FTIR ）测定该藻细胞中的油脂含量。
研究结果表明NR 的最佳染色条件为：染色前微波处理40s ，二甲基亚砜体积分数1%，NR 最终质量浓度1．5μg /ml ，染色时间5min ，染色温度40ħ。
比较了NR 荧光光谱法、FTIR 与传统重量法测定的该藻在不同时相的油脂积累情况，利用激光共聚焦显微镜观察了细胞中油体形成的动态过程。
实验结果表明NR 荧光光谱法、FTIR 与传统重量法测定的结果显著相关（R 2=0．9258，R 2=0．9844），但NR 荧光光谱法和FTIR 更简便快速，研究结果为规模化筛选高含油量藻株及跟踪产油微藻油脂积累过程奠定了基础。
关键词斜生栅藻油脂尼罗红荧光光谱傅里叶变换红外光谱中图分类号Q949收稿日期：2011-09-20修回日期：2011-10-27*国家“863”计划（2009AA06440）、国家“973”计划（2011CB2009001）、国家自然科学基金（31170337、41176105）、广东省教育部产学研结合项目（2010A090200008）、珠海市科技重点项目（PC20081008）资助项目＊＊通讯作者，电子信箱：tzhangcw@jnu．edu．cn面对能源危机，利用微藻生产生物燃料及其相关高附加值产品引起了人们的极大关注，已成为目前化石能源替代燃料研究的热点。
优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌
中国油料作物学报Chinese Journal of Oil Crop Sciences优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌岳秀宏1，李祥宇4，刘鹏阳1,5，陆姝欢4，万霞1,2,3*（1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉，430062；2.农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北武汉，430062；3.农业部油料加工重点实验室，湖北武汉，430062；4.嘉必优生物技术股份有限公司，湖北武汉，430073；5.湖北大学，生命科学学院，湖北武汉，430062）摘要：裂殖弧菌是商业化生产二十二碳六烯酸（DHA ）的重要菌株。
为了快速检测裂殖壶菌细胞油脂含量，本文基于尼罗红荧光染色法，系统地筛选了激发光与发射光，并探究了简化细胞处理步骤，在不使用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞的条件下，优化二甲基亚砜（DMSO ）体积分数、尼罗红用量、染色时间及细胞密度等因素对裂殖壶菌胞油脂检测的影响，并通过气相色谱法与荧光染色法的相关性分析，验证该方法的准确性。
结果表明背景荧光未对荧光强度测定造成干扰；细胞密度在一定范围内，荧光强度与油脂含量的相关性良好，通过荧光强度可以较为准确地反映裂殖壶菌油脂含量。
最佳染色及检测条件为：细胞密度0.7<OD 600<1.3，尼罗红浓度1μg/mL ，DMSO 浓度20%，激发光515nm ，发射光576nm ，常温避光染色20min 。
本研究优化后尼罗红荧光染色法可应用于高含油量的裂殖弧菌突变株或亲缘关系相近的高油脂菌株的高通量筛选。
关键词：裂殖壶菌；油脂含量；尼罗红荧光染色中图分类号：TK6文献标识码：A文章编号：1007-9084（2019）05-0796-08Simplified and rapid lipid determination of Schizochytrium sp .by optimized Nile red fluorescence staining YUE Xiu-hong 1，LI Xiang-yu 4，LIU Peng-yang 1,5，LU Shu-huan 4，WAN Xia 1,2,3*（1.Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China;2.Key Laborato⁃ry of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops,Ministry of Agriculture,Wuhan 430062,China;3.National and Local Joint Engineering Laboratory of Oil Lipid Processing Technology,Wuhan 430062,China;4.CABIO Biotechnol⁃ogy Company Limited,Wuhan 430073,China;5.College of Life Sciences,Hubei University,Wuhan 430062,China ）Abstract:Schizochytrium sp .is an important strain for commercial production of docosahexaenoic acid (DHA).Improving DHA production by physicochemical mutagenesis is an important link in the development of microbialfermentation DHA industry.In order to establish a rapid optimal Nile red fluorescence staining method for determin⁃ing the lipid content in Schizochytrium sp .,we systematically examined the effect of excitation wavelength,emission wavelength and explored the condition of cells without phosphate buffer solution washing.We also optimized the concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO)and Nile red,staining time and cell density.The results showed that the culturing medium did not interfere with the determination of fluorescence intensity.In addition,we evaluated thecorrelation between the florescence intensity of Nile red staining and gas chromatographic method.The lipid contentwas positively correlated to the fluorescence intensity,when the cell density was within a certain range.We con⁃clude that lipid content of Schizochytrium sp.can be effectively determined by fluorescence intensity.The optimal conditions for determining of lipid content in Schizochytrium sp were obtained as follows :cell density was 0.7<OD 600<1.3,the concentration of Nile red was 1μg/mL,DSMO concentration was 20%(v/v),staining time was 20min,andthe excitation and emission wavelengths was 515nm and 570nm.The optimized Nile red fluorescence staining 2019，41（5）：796-803doi ：10.19802/j.issn.1007-9084.2019059收稿日期：2019⁃03⁃08基金项目：十三五重点研发计划(2016YFD0501209-01)；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2013-OCRI)；中国光谷“创新人才”计划（K159）作者简介：岳秀宏(1993-)，女，硕士研究生，研究方向为微生物代谢与酶工程，E-mail:1280356506@ *通讯作者：万霞(1981-)，女，湖北武汉人，副研究员，从事脂质化学与营养创新研究，E-mail:wanxia@岳秀宏等：优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌method could be used to rapidly and high-throughput screening of mutants with high lipid content in Schizochytri⁃um or closely related strains.Key words:Schizochytrium sp.；lipid content；Nile red fluorescence dyeing二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种重要的ω-3系列超长链多不饱和脂肪酸，由22个碳和6个双键组成[1]。
裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析
摘 要 采 用 水酶 法 对 裂 殖壶 菌 油脂 的提 取 工 艺进 行 研 究 ，通过 单 因素和 正 交 实验 优化 提 取 工 艺条 件 ， 并 对裂 殖 壶菌 油脂 的脂肪 酸组 成进 行 分析 。 实验 结 果表 明 ，水酶 法提 取 裂 殖 壶 菌油 脂 的 最佳 工 艺条 件 ：复合 酶 配 比 ２：８（纤维 素酶 ：中性 蛋 白酶 ，Ｕ ：Ｕ），液 料 比 ４ ｍＬ／ｇ，加酶 量 ２ ５００ Ｕ／ｇ，酶 解 温度 ５５℃ ，酶 解 时 间 ４ ｈ；在 此优化 条 件 下 ，裂 殖 壶茵 油脂提 取 率 为 ８２．４７％ 。裂 殖 壶菌 油 脂 脂 肪 酸 以 Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ２２ ：５ｎ一６ 和 Ｃ２２：６ｎ一３为主 ，其 脂肪 酸组 成 简单 ，且 Ｃ２２：６ｎ一３质 量 分数 高达 ３２．６５％ ，表 明裂 殖 壶 菌油 脂具 有很 高 的营养价值和功能性油脂的开发潜力，可作 为 Ｃ２２：６ｎ一３的重要食 药来源。
关键 词 裂殖 壶茵 水 酶 法 油脂提 取 脂肪 酸 中图分 类号 ：ＴＳ２５１．９ 文 献标 识码 ：Ａ 文章编 号 ：１００３—０１７４（２０１８）０２—００４４—０６
裂殖 壶 菌 （Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．），又 名 裂 壶 藻 ，其 属于 真 菌 门 （Ｅｕｍｙｃｏｔａ）、网 粘 菌 纲 （Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙ— ｃｅｔｅｓ）、破 囊 壶 菌 目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）、破 囊 壶 菌 科 （Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）的 一 类 类 藻 的海 洋 微 生 物 Ｊ。 裂殖 壶菌 的菌 体 脂 质 含量 丰 富 ，且 以甘 油 三酯 为 主 ， ＤＨＡ 占总脂 肪酸含 量 的 ３０％ ～４０％ ，被认 为 是一 种 理想 的 ＤＨＡ新 生 资源 。 目前 ，从 裂 殖 壶 菌 中提 取制 备 高纯 度 ＤＨＡ 已 日益 成 为 国 内 外 海 洋 生 物 技 术 的 研究 热 点 。
尼罗红-荧光光谱法测定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究
尼罗红-荧光光谱法测定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究邴欣;宋琪;刘双;于道永【摘要】The traditional Nile red fluorescence dyeing method could not be applied to determine the lipid content in Botryococcus braunii because of its extracellular excretion, thick cell wall and dense cell colo-nies. By studying the pretreatment and staining conditions, the detection method was optimized as fol-lows:treating algal cells by ultrasound for 3 min at 20℃,100 W and 40 kHz, centrifugation at 3 000 × g to remove the culture medium, suspending the cells with 8% dimethylsulfoxide to OD750 1. 6, every 1 mL sample added by 10 μL Nile red acetone solution of 120 μg/mL ( mass concentration of Nile red 1 . 2μg/mL) , staining at 40℃ for 10 min. Then the sample was measured by fluorescence spectrometer ex-cited at 520 nm. The interaction between Nile red and microalgal cells, and the determination stability and accuracy were enhanced after optimization.%布朗葡萄藻因胞外分泌物多、细胞壁厚、聚集生长等原因,不能用传统的尼罗红染色方法进行油脂含量测定。
尼罗红荧光光谱法快速测定解脂耶氏酵母油脂含量的研究
油 脂含 量 。 尼 罗红一荧 光 法 可成 为一 种 快 速检 测 解 脂 耶 氏 酵母 胞 内油 脂含 量 的 新 方 法 。
ｓ ｔ ｕ ｄ ｉ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ Ｎｉ ｌ ｅ Ｒｅ ｄ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｆ ｉ ｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｅ ｍｉ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｖ ｅ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｉ ｎ Ｙ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ａ ｌ ｉ ｐ ｏ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ， ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｖ ｏ ｌ ｕ ｍｅ ｆ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ， ｄ ｏ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｎｉ ｌ ｅ Ｒｅ ｄ ｄ ｙ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ， ｄ ｙ ｅ ｉ ｎ ｇ ｔ ｉ ｍｅ ａ ｎ ｄ
Ａｂｓ ｔ ｒ ａｃ ｔ ： Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｒ ａ ｐｉ ｄ ｌ ｉ ｐｉ ｄ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｉ ｎ Ｙ ａ ｒ ｒ ｏ ｗｉ ａ ｌ ｉ ｐｏ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ， ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ
尼罗红染色法检测拟微绿球藻油脂含量
尼罗红染色法检测拟微绿球藻油脂含量武迪;成杰;刘佳;张茜;苏勇宁;巩东辉;季祥【摘要】The Nile red fluorescent dye was used to examine the lipid content of Nannochloropsis oculata strain.In order to obtain the optimal dyeing parameters,the influence of volume percentage ofDMSO,pretreatment temperature,the concentration and staining time of Nile red was explored.Meanwhile,the factors were optimized by the orthogonal experimental design.The results indicated that the optimum dyeing conditions for Nannochloropsis oculata strain were asfollows:volume percentage of DMSO is 20%,pretreatment tem-perature is 35℃,the concentration of Nile red was 1.5 μg· mL-1,and the staining time of Nile red is 10 min.It's expected that the strategy presented in this study could be used for rapid determination of lipid content of Nannochloropsis oculata strain.%尼罗红染色法是检测胞内油脂较灵敏的方法,为了获得用尼罗红染色法检测拟微绿球藻油脂的最优条件,本文对尼罗红染色法的染色条件进行了研究,结果显示:二甲基亚砜(DMSO)浓度为20%,预处理温度35℃,尼罗红浓度为1.5 μg /mL,染色时间10 min时,可以较为准确的反应出拟微绿球藻胞内的油脂含量.【期刊名称】《内蒙古科技大学学报》【年(卷),期】2017(036)003【总页数】4页(P289-292)【关键词】拟微绿球藻;尼罗红染色;油脂测定【作者】武迪;成杰;刘佳;张茜;苏勇宁;巩东辉;季祥【作者单位】内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010;内蒙古包头医学院,内蒙古包头014030;内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010;内蒙古再回首生物工程有限公司,内蒙古鄂尔多斯 016100;内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学生命科学与技术学院,内蒙古包头 014010【正文语种】中文【中图分类】TQ92D.6随着人类社会的发展，化石能源的储备越来越少，化石燃料燃烧时产生大量CO2，造成温室效应等严重的环境问题，世界各国正在寻找绿色的可再生能源来代替化石能源，比如风能，水能，太阳能等.在众多可再生能源中，生物质能源是国际公认缓解能源危机的有效途径之一，其中微藻被认为是适合生产生物质能源(生物柴油)的原料[1].微藻油脂含量的检测方法有多种：Bligh-Dyer法[2]、香草醛比色法[3]、油红O染色法[4]、苏丹黑B染色法[5]等，这些方法操作步骤繁琐，对检测样品需求量较大.尼罗红作为一种亲脂性的恶嗪类荧光染料，能进入细胞与胞内中性脂结合并发出荧光检测信号，借助酶标仪、荧光分光光度计等设备进行检测，荧光强度与细胞的中性脂含量呈正比[6,7].本文以拟微绿球藻作为出发藻种，研究了二甲基亚砜(DMSO)浓度，尼罗红染液浓度，预处理温度，染色时间，四个条件对染色结果的影响，得出一个能快速、准确测出拟微绿球藻油脂含量的最优染色条件.1.1 藻种拟微绿球藻(Nannochloropsis XJ006)为内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室保存藻株.采用标准f/2培养基，25 ℃，4800 lx，光暗比1:1，250 mL三角瓶培养.1.2 实验方法1.2.1 尼罗红染色法对油脂含量的测定传统尼罗红染色方法[8]：取培养至稳定期的藻液适量，8000 r/min离心10 min，去除上清，藻细胞沉淀用PBS缓冲溶液洗两次，用20%DMSO重悬藻细胞至OD680值0.8，40℃水浴10 min，按1 mL藻液加15 μL尼罗红染料(质量浓度为0.1 mg/mL丙酮溶液)，室温下混匀染色5 min，激发波长480 nm，测定其在575 nm波长的荧光强度.1.2.2 正交试验设计表根据DMSO浓度，预处理温度，尼罗红浓度，染色时间单因素的实验结果，设计四因素三水平正交实验如表12.1 DMSO浓度对染色结果的影响取培养至稳定期的藻液适量，8000 r/min离心10 min，去除上清，藻细胞沉淀用PBS缓冲溶液洗两次，分别用不同浓度(0%，10%，20%，30%，40%)DMSO 重悬藻细胞至OD680值0.6，按1 mL藻液加入10 μL尼罗红染液(质量浓度为0.1 mg/mL丙酮溶液)，室温下混匀染色5 min，激发波长480 nm，测定其在575 nm波长的荧光强度，结果如图1所示.由图1可知，当二甲基亚砜浓度在0%—40%之间时，荧光值出现先增加后减少的趋势，当二甲基亚砜浓度为20%时荧光值最大(Plt;0.05).DMSO作为一种细胞渗透剂，其作用是增加细胞通透性，使尼罗红染液更易进入胞内染色.但从图2中可看到，在DMSO浓度为0时，就有较高的荧光值，这可能是因为拟微绿球藻细胞壁较薄，本就可以使尼罗红穿透细胞壁，进入胞内.DMSO浓度超过20%后，荧光值又表现出明显的下降趋势，这可能是高浓度的DMSO遮盖了荧光信号，所以荧光值变低.因此，最佳的DMSO浓度为20%.2.2 预处理温度对染色结果的影响采用20%DMSO水溶液重悬至OD680值0.6，分别以30℃、40℃、50℃、60℃的温度水浴10 min，其余操作见2.1，结果如图2所示.由图2可知，当预处理温度在30℃—60℃的范围内时，其荧光值呈现先增高后下降的趋势，而处理温度在40℃时，荧光信号的强度最大(Plt;0.05).在温度较低时也有一定的荧光信号.随着温度的增加，在40℃时检测到最高的荧光信号，之后开始下降.推测其原因是温度较高，对荧光信号生了影响，导致荧光值降低.2.3 尼罗红浓度对染色结果的影响采用20%DMSO水溶液重悬藻细胞至OD680值0.6，按1 mL藻液加入不同体积(5、10、15、20、25 μL)质量浓度为0.1 mg/mL的尼罗红丙酮溶液，其余操作见2.1，结果如图3所示.由图3可知，在尼罗红浓度0.5 μg/mL到2.5 μg/mL的范围内，荧光值总体呈现先增高后降低的趋势，而在尼罗红浓度为1.0 μg/mL时，有最高强度的荧光值(Plt;0.05).起始荧光值较低是因为尼罗红染液较少，不能对胞内油脂完全染色，导致荧光信号较弱.而随着尼罗红染液浓度的增加，在达到峰值之后，其荧光值反而越低，这可能是因为过高的尼罗红染液浓度，覆盖了荧光信号，再加上过高的背景值，影响了荧光信号的测定.所以，尼罗红染液的最佳浓度为1.0 μg/mL.2.4 染色时间对染色结果的影响采用20%DMSO水溶液重悬藻细胞至OD680值0.6，室温下混匀染色分别为1 min，5 min，10 min，20 min，其余操作见2.1，结果如图4所示.由图4可知，随着染色时间的延长，尼罗红染料与中性脂结合后产生的荧光信号呈现先增加后减少的总体趋势.当染色时间为5 min时，所测得的荧光信号最强(Plt;0.05).初始荧光值较低，是因为染色时间较短，尼罗红染液未能与胞内油脂充分结合，导致荧光值偏低.随着染色时间的增加，在达到最佳的染色时间后，荧光信号开始衰减，荧光值越来越低.由此可见，过长或过短的染色时间均不适宜荧光信号的检测.综上所述，尼罗红最佳染色时间为5 min.2.5 正交试验由表2知，对染色结果影响的顺序为：Cgt;Agt;Bgt;D，即对染色结果影响最大的是尼罗红浓度，其次是DMSO浓度，然后是预处理温度，影响最小的是染色时间.根据各因素的均值，确定最佳的染色条件为A2B1C3D3.通过单因素实验和正交实验结果，考虑各个因素交互影响最终确定最佳染色条件为：二甲基亚砜(DMSO)浓度为20%，预处理温度35℃，尼罗红浓度为1.5 μg /mL，染色时间10 min.在该条件下测得的荧光值为52838.2.6 脂含量与荧光值标准曲线为了找到荧光值与油脂含量的对应关系，测定并绘制了油脂含量和荧光值的标准曲线，如图5所示.由图5知，在一定范围内，XJ006藻细胞胞内油脂含量与荧光值存在一定的线性关系.其关系为Y=0.013 95*X-223.1(R2=0.996 7).其中X代表荧光值，Y代表胞内油脂含量(mg/L).用上述最佳条件测定的拟微绿球藻油脂含量为514mg/L.优化的拟微绿球藻脂质检测的条件为二甲基亚砜(DMSO)浓度为20%，尼罗红染液浓度为1.5 μg /mL，预处理温度35℃，染色时间10 min.通过酶标仪，在改进的尼罗红染色法下，荧光值和胞内脂质含量呈现较好的线性关系，其相关系数为0.996 7.测定的拟微绿球藻油脂含量为514 mg/L.研究工作后续均采用以上条件检测拟微绿球藻的油脂含量.【相关文献】[1] Rodolfi L, Chini Zittelli G, Bassi N, et al. Microalgae for oil: Strain selection, induction of lipid synthesis and outdoor mass cultivation in a low-cost photobioreactor[J]. Biotechnology and bioengineering, 2009, 102(1): 100-112.[2] Bligh E G, Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification[J]. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 1959, 37(8): 911-917.[3] Ahlgren G, Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: a method study[J]. Archiv für Hydrobiologie, 1991, 121(3): 295-306..[4] 秦红霞, 赵玲, 王宇豪, 等. 两种脂肪细胞内脂滴染色方法的比较研究[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2014, 23(6): 544-547.[5] 张连水, 张慧霞, 齐树亭, 等. 测定微藻油脂方法的比较研究[J]. 河北渔业, 2016 (2016 年 05): 14-16.[6] Kimura K, Yamaoka M, Kamisaka Y. Rapid estimation of lipids in oleaginous fungi and yeasts using Nile red fluorescence[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56(3): 331-338.[7] Bertozzini E, Galluzzi L, Penna A, et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red[J]. Journal of Microbiological Methods, 2011, 87(1): 17-23.[8] 王海英, 符茹, 黄宝祥. 基于尼罗红荧光染色的小球藻脂质快速检测方法研究[J].中国油脂, 2012, 37(3): 78-81.。
中性脂含量高的微拟球藻藻株的快速筛选
085,其中基因过表达藻株 12 株 9 ,分别为 Δ6 去饱和
酶基因(
NoD6)
3 株、
Δ12 去饱和酶基因(
NoD12)
3 株,
以及2条来自三角褐指藻 1 条来自拟南芥的二酰甘油
酰基转移酶 DGAT 基因,命名为 P
tDGAT1(
2 株)、
P
t
-
DGAT2(
3株)和 AtDGAT(
1 株)。28 株物理诱变藻
.02%,亚硝基胍(
NTG)诱变藻株 231 号相
对产率为323
.84%。本研究获得了3株中性脂产率高的微拟球藻藻株,这3株藻株有望应用于生物柴油的生产,研究结果
可为高油脂含量微藻的快速筛选提供参考。
关键词: 微拟球藻;中性脂;尼罗红;藻种选育
中图法分类号: S
968.
42;O657.
3
DOI: 10.
-1
为活化保存藻株用于实验,对藻种进行预培养,培
/2 海水培养基,盐度 30±2,光照强度为 50~
养基为f
60μmo
l·m-2·s-1,温度为(
25±3)℃,每天定时摇
瓶3次,培养至指数生长期用于后续实验。
1.
2 藻株中性脂含量的检测
尼罗红是一种脂溶性荧光染料,其在特定波长下
荧光强度与油脂含量呈显著的线性关系[16],可用于表
16441/
.
nk
i.
hdxb.
20220372
jc
文献标志码: A
文章编号: 1672
5174(
2023)
12
032
08
引用格式: 陈小凡,王路路,肖腾飞,等.中性脂含量高的微拟球藻藻株的快速筛选[
裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究
裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究蒋晓艳;王婉玉;钟敏;胡雪琼;苏伟明;吉宏武;李雁群【摘要】为了建立快速检测裂殖壶菌胞内油脂的方法,探讨了尼罗红荧光染色法检测裂殖壶菌油脂含量的检测条件.通过考察裂殖壶菌重悬液中添加二甲基亚砜体积分数、尼罗红染液用量、染色温度、染色时间及细胞密度对荧光强度的影响,确立最优检测条件,进一步考察细胞油脂含量与荧光强度的关系,从而建立尼罗红荧光检测法的定量关系.结果表明,最优检测条件为:每毫升裂殖壶菌重悬液中二甲基亚砜体积分数和尼罗红染液用量分别为25％和15 μL,染色温度50℃,染色时间15 min.在最优检测条件下,细胞密度不超过0.218×108个/mL范围内,菌液油脂含量(X)与荧光强度(Y)呈现良好的线性关系,其线性关系式为Y=798.55X-3.44,相关系数R2为0.996 4.因此,采用尼罗红荧光染色法可以快速检测裂殖壶菌的油脂含量.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2016(041)001【总页数】5页(P51-55)【关键词】裂殖壶菌;油脂;尼罗红荧光染色【作者】蒋晓艳;王婉玉;钟敏;胡雪琼;苏伟明;吉宏武;李雁群【作者单位】广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088【正文语种】中文【中图分类】TS222;TQ646微生物油脂微生物的生长周期短、培养简单，不受季节和气候变化等的限制，是一种可无限再生的资源。
一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用[发明专利]
![一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/252ab8d0376baf1ffd4fadca.png)
专利名称：一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：鲍杰,赵瞭,侯伟亮,胡明珊,张建
申请号：CN201910186710.0
申请日：20190313
公开号：CN111690587A
公开日：
20200922
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用，属于生物技术和微生物技术领域。
具体步骤为将油脂酵母菌株培养在木质纤维素水解液中，通过离心发酵液获取上层包含高油脂含量的轻油脂细胞转接后继续培养，并逐步提高离心力直到菌株发酵性能达到稳定。
筛选得到新菌株命名为皮状丝孢酵母MS28,其保藏编号为CGMCC No.14780。
本发明快速高效，对所有油脂酵母菌株筛选均具有重要借鉴意义。
申请人：华东理工大学
地址：200237 上海市徐汇区梅陇路130号华东理工大学
国籍：CN
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利用流式细胞仪筛选紫外诱变高含油小球藻
利用流式细胞仪筛选紫外诱变高含油小球藻李青;吴洪;蔡忠贞;陈传红;尹顺吉;崔春莉【摘要】为筛选得到高含油的小球藻藻株,对若夫小球藻(Chlorella zofingensis)进行紫外诱变,尼罗红染色后再利用流式细胞仪对高含油藻株进行筛选.结果表明:紫外诱变40 min后,经流式细胞仪筛选,分选出的90％的突变藻株总脂含量都高于野生对照株.最终筛选到的藻株S16经培养总脂产量达到2.4 g/L,比野生对照株提高了50％.%In order to screen strain with high lipid content from Chlorella zofingensis,firstly Chlorella zofingensis was mutated by ultravioletray(UV),and then the cells of mutated Chlorella zofingensis were screened by flow cytometry after Nile red staining.The results showed that after being mutated by UV for 40 min and screened by flow cytometry,90％ of the mutated strains contained more lipid than wild control strain.The total lipid yield of the screened strain S16 reached 2.4 g/L,increasing by 50％compared with wild control strain.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2018(043)005【总页数】4页(P110-112,122)【关键词】小球藻;紫外诱变;流式细胞仪分选;高含油【作者】李青;吴洪;蔡忠贞;陈传红;尹顺吉;崔春莉【作者单位】新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l;新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l;新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l;新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l;新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l;新奥科技发展有限公司煤基低碳能源国家重点实验室,河北廊坊06500l【正文语种】中文【中图分类】TS222;TQ92能源是人类生存与发展的基础，不可再生化石能源日趋减少及使用过程中造成的环境污染问题全球瞩目[1]。
高产DHA裂殖壶菌的诱变选育及转录组分析
高产DHA裂殖壶菌的诱变选育及转录组分析
蔺楚彬;万霞;曾驰
【期刊名称】《武汉轻工大学学报》
【年(卷),期】2024(43)2
【摘要】裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)可以积累大量的Ω-3多不饱和脂肪酸,特别是高含量的二十二碳六烯酸(DHA),在食品工业中发挥着重要作用。
为了获得高产DHA的裂殖壶菌,通过对原始菌株进行电子束(EB)辐射诱变,并结合丙二酸和尼罗红染色法筛选,得到了一个DHA产量提高11.42%的突变体M2-11。
转录组结果表明,与原始菌株相比较,M2-11中与脂质合成相关的基因绝大多数被上调,还存在多个差异显著的其他功能基因。
本研究为裂殖壶菌的诱变选育和遗传改造提供了参考。
【总页数】9页(P42-49)
【作者】蔺楚彬;万霞;曾驰
【作者单位】武汉轻工大学生命科学与技术学院;中国农业科学院油料作物研究所;农业部油料作物生物学与遗传改良重点实验室;农业部油料加工重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.97
【相关文献】
1.EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌
2.利用胞内核磁共振法快速筛选高产DHA裂殖壶菌的研究
3.利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产DHA的新型裂
殖壶菌4.常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育高产DHA的裂殖壶菌突变株5.裂殖壶菌诱变株高产DHA机理的转录组学分析
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优化尼罗红荧光染色法简便快速筛选高油脂裂殖壶菌岳秀宏; 李祥宇; 刘鹏阳; 陆姝欢; 万霞【期刊名称】《《中国油料作物学报》》【年(卷),期】2019(041)005【总页数】8页(P796-803)【关键词】裂殖壶菌; 油脂含量; 尼罗红荧光染色【作者】岳秀宏; 李祥宇; 刘鹏阳; 陆姝欢; 万霞【作者单位】中国农业科学院油料作物研究所湖北武汉 430062; 嘉必优生物技术股份有限公司湖北武汉 430073; 湖北大学生命科学学院湖北武汉 430062; 农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室湖北武汉 430062; 农业部油料加工重点实验室湖北武汉 430062【正文语种】中文【中图分类】TK6二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一种重要的ω-3系列超长链多不饱和脂肪酸，由22个碳和6个双键组成[1]。
DHA广泛存在于人类的神经和视网膜组织中，是神经系统细胞生长及维持的必要因素，也是大脑和视网膜的重要成分，对胎婴儿智力和视力发育至关重要[2]。
研究报道表明DHA还具有降低高血压、心血管疾病、炎症和某些癌症的风险，因此受到人们越来越多的关注[3～5]。
目前，除了鱼油来源的DHA外，裂殖壶菌、吾肯氏壶藻和寇氏隐甲藻等微生物也被用于DHA的商业化生产，原卫生部2010年第3号公告将其列为新食品原料。
其中,裂殖壶菌作为DHA产业化生产的菌株，以其生长速率和高效的产油效率成为DHA产业化生产的研究热点[6]。
不同亚种间或不同发酵条件下，裂殖弧菌DHA 含量约占细胞总脂肪酸的23%～51%，DHA产量约为6～36 g/L[7]。
中性脂为裂殖壶菌主要的油脂成分，占总油脂95.90%，其中以三酰甘油（TAG）为主，占中性油脂的97.20%[8]。
通过提高TAG含量进一步提高裂殖壶菌DHA产量是目前研究报道的热点。
由于基因工程和基因编辑改造方法和法规尚不完善，通过物理或化学手段诱变并筛选高产突变株，仍是提供优势菌株资源的重要手段。
因此，建立快速、简便、高通量方法筛选高含油脂的突变株十分关键。
目前，微生物油脂定量的方法主要为有机试剂提取（称重法）[9]和气相色谱法[10]。
但前者样品需求量大，操作繁琐，安全性低，后者虽灵敏度高，但设备及检测标品昂贵且耗时。
这两种方法的检测通量均不高，因此应用于高含油脂的裂殖壶菌突变株的筛选时耗时耗力。
尼罗红是一种脂溶性的荧光染料，可以与胞内油脂结合产生荧光。
尼罗红与胞内油脂结合产生的荧光强度与胞内油脂含量呈正比，已被运用于酵母、微藻等多种微生物油脂含量的检测[11～14]。
该方法操作简单、样品量小、可高通量操作，能较好地适用于微生物的油脂检测。
尽管尼罗红荧光染色法在快速检测高油脂含量微生物方面有较大优势，但将该方法应用于不同的物种还需要重新优化染色条件，且该方法仍有改进空间。
不同物种的油脂成分有所差异，激发光与发射光也有所不同[14～18]。
本文结合多功能酶标仪与荧光光谱仪，系统选择了适用于裂殖壶菌油脂含量检测的激发光与发射光。
目前报道过的文献中[11～18]检测胞内油脂均用磷酸缓冲盐溶液（PBS）或无菌水对细胞进行洗涤，以消除培养基对染色的影响，但操作繁琐，在样品多的情况下耗时长，不适合高通量的菌株筛选工作。
本实验在简化洗涤步骤的情况下，探究了尼罗红染色法应用于裂殖壶菌胞内油脂测定时最适宜的激发光与发射光波长、细胞溶剂二甲基亚砜体积分数、尼罗红用量、染色时间及细胞密度等条件，试图建立简便、高通量、快速的方法检测裂殖壶菌油脂含量。
1 材料与方法1.1 材料与仪器菌株：本实验所用菌株为裂殖壶菌Schizochytrium sp.A-2，由嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司提供。
材料：葡萄糖、谷氨酸钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾，均购于国药集团化学试剂有限公司。
尼罗红(Nile red，NR)、二甲基亚砜(dimethyl slfoxide,DMSO)均购于美国Sigma Aldrich公司。
仪器：立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；电热恒温振荡培养箱（太仓市强乐实验设备有限公司）；干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）；多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；荧光光谱仪（日本日立公司）；电子精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；气相色谱仪（美国安捷伦公司）。
1.2 方法1.2.1 培养基及相关试剂的配置活化培养基：葡萄糖40 g，酵母浸膏6 g，天然海水1 L，pH 6.8，于121℃灭菌20 min。
发酵培养基：葡萄糖50 g，酵母浸膏9 g，谷氨酸钠30 g，补加天然海水至1 L，pH 6.8，于121℃灭菌20 min。
PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.2 g/L、十二水合磷酸氢二钠2.9 g/L、氯化钠8.0 g/L，氯化钾0.2 g/L，pH 7.4，121℃灭菌15 min。
尼罗红染液：将1 mg尼罗红溶于10 mL的丙酮中，用有机滤膜过滤到小棕瓶中避光保存。
1.2.2 菌种培养与发酵挑取平板保存的单菌落于装有30 mL活化培养基的250mL锥形瓶中，28℃，150 r/min，培养48 h，活化两代。
接种5%的种子液到装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，28℃，220 r/min，培养48 h。
1.2.3 油脂含量测定离心收集细胞，进行冷冻干燥后，通过脂肪酸提取及气相色谱分析方法[20]测定胞内油脂含量。
1.2.4 荧光强度的测定取500μL菌液加入500μL一定体积分数的DMSO振荡混匀，向其中加入一定体积的1 mg/mL的尼罗红染液，再次混匀于暗处染色。
取200μL染色后重悬菌液于96孔黑色酶标板中，使用多功能酶标仪检测荧光强度，并扣除空白培养基尼罗红染色荧光强度值。
2 结果与分析2.1 DMSO浓度、激发光及发射光对尼罗红染色荧光强度的影响2.1.1 DMSO浓度对尼罗红染色荧光强度的影响DMSO是一种含硫的有机化合物，能改变细胞壁和细胞膜对药物、毒物、电解质等的透性，使尼罗红易于透过细胞壁与胞内油脂结合，提高染色效果。
与丙酮、甲醇、异丙醇等相比，DMSO挥发性较低，可与水以任意比例互溶，已广泛应用于微藻尼罗红染色法[12,15,18]。
由于不同菌种的细胞壁通透性不同，DMSO的用量不同，相关研究中检测微拟球藻采用的浓度为15%[17]，检测小球藻采用的浓度为20%[18]。
因此本实验首先考察DMSO浓度对尼罗红染色荧光强度的影响，此部分实验条件为尼罗红浓度1μg/mL，常温避光染色10 min，DMSO体积分数分别设为5%、10%、20%、30%、40%、50%。
使用酶标仪设定激发光为480 nm，发射光在550～750 nm 范围内，每隔10 nm进行一次荧光值检测，结果如图1所示。
由图1A可知，在没有细胞的情况下，DMSO体积分数为30%～50%时染色液在650 nm处出现峰值，因此认为DMSO与尼罗红结合在650 nm处形成发射波。
且DMSO浓度越高，尼罗红与DMSO结合峰值越高。
由图1B可以看出，尼罗红与脂质结合，在580 nm左右产生峰值，DMSO浓度为20%时，尼罗红对油脂染色效果最佳；DMSO浓度为30%和40%时，尼罗红与DMSO结合，胞内油脂不能充分地与尼罗红结合，峰值降低；尼罗红浓度为50%时，DMSO与尼罗红结合产生的荧光遮盖尼罗红对中性脂染色产生的荧光，峰值右移；DMSO浓度为10%和5%时，未看到显著峰值，DMSO浓度太低不足以改变细胞透性，尼罗红与脂质结合不充分，荧光强度较低未形成显著特征峰。
综上所述，DMSO浓度为20%时，其作为溶剂不会影响尼罗红与油脂结合，且该浓度尼罗红与油脂结合染色效果最佳。
后续实验DMSO浓度均为20%。
2.1.2 激发光及发射光对尼罗红染色荧光强度的影响尼罗红与中性脂结合，激发光光谱范围在450～580 nm之间，发射光光谱范围在500～750 nm之间。
不同物种的油脂种类不同，所选择的激发光与发射光也会有差异。
文献[14]中四株小球藻油脂含量检测激发光直接设为480 nm，发射光为575 nm。
文献[15]中裂殖壶菌油脂含量检测激发光直接设为490 nm，发射光为590 nm。
根据目前报道的文献，微藻激发光一般在 480～520 nm[12～19]。
本研究测定发射光范围时固定激发光为480 nm，发射光在520～660 nm范围内每隔0.2 nm进行一次荧光值检测。
测定激发光范围时，固定发射光为576 nm，激发光450～550 nm范围内每隔0.2 nm进行一次荧光值检测。
由图1C、1D可见，最佳激发光为515 nm，最佳发射光为576 nm。
2.2 背景荧光对尼罗红染色荧光强度的影响依据以上实验结果，此部分实验条件拟定为DMSO浓度为20%，尼罗红浓度1μg/mL，细胞密度OD600=1.2，常温避光染色10 min，分别测定了PBS缓冲液、菌液离心后上清、PBS细胞重悬液及发酵后菌液在激发光为515 nm，发射光在550～700 nm的荧光强度。
如图2所示，尼罗红对上清液和PBS染色，在发射光为560～700 nm范围内均未产生明显峰值。
与图1A无细胞培养基检测结果相同，DMSO浓度较低时，不形成特征峰；用尼罗红分别与PBS细胞重悬液及发酵后菌液染色，尼罗红与油脂结合在580 nm处产生峰值，且峰值相近，上清颜色并未对尼罗红与油脂结合产生影响。
且尼罗红对上清及PBS染色在580 nm处荧光强度相近，对染色结果无明显影响。
胞内油脂荧光强度等于菌液荧光强度值减去空白培养基尼罗红染色荧光强度值。
2.3 尼罗红浓度对荧光强度的影响为考察尼罗红浓度对裂殖壶菌染色的影响，此部分实验条件设置为：DMSO浓度20%，细胞密度OD600=1.2，常温避光染色10 min，激发光为515 nm，发射光在550～750 nm范围内每隔10 nm进行一次荧光值检测。
尼罗红浓度分别为0.5、1、2、5、8、10 μg/mL，结果见图3。
图1 DMSO浓度、发射光及激发光波长对荧光强度的影响Fig.1 Effects of DMSO volme ratio and excitation,emission wavelength on relative fluorescence intensity注：A：无细胞培养基；B：菌液OD600为1.2；C：发射波长的确定；D：激发波长的确定Note:A:Culturemediumwithoutcell;B:OD600=1.2;C:Determination of theemissionwavelength.D:Determination of theexcitation wavelength图2 尼罗红在不同溶液中的荧光光谱图Fig.2 Fluorescencespectraof Nilered in differentsolutions由图3A、B可知，尼罗红浓度在0～5μg/mL间，荧光强度随尼罗红浓度增加而增加。