细胞工程总结

一、名词解释：

细胞工程(cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生

物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。

1．脱分化：脱分化：具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程称为脱分化。（如根、茎、叶）

2.饲喂培养：将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。

3.核重编成：使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程。

4.细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain

5.热力灭菌：主要是利用高温使菌体变性或凝固，酶失去活性，而使细菌死亡。

6.人工种子：是将植物立体培养产生的体细胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜的条件下发芽出苗

7.植板率：每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分率。植板率=每平板形成的细胞团数/每平板接种的细胞总数

8.胚胎移植: 是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。

9．体细胞无性系：以单体细胞为材料，采用无性繁殖法繁殖的品种（品系）称无性系品种（品系），简称无性系

10.过滤灭菌：过滤灭菌法,即用筛除或滤材吸附等物理方式除去微生物

仓鼠细胞Hamster cells 白细胞抑制因子leukocyte inhibitory factor, LIF 干细胞Stem cells

二、简答

1.细胞活力鉴定方法：取纯化后的植物原生质体悬浮液0.5ml置于小试管中，加入含2mg/L 的FDA的丙酮溶液，使最终浓度为0.01％，混匀，放置5分钟，荧光显微镜观察（激发光滤光片QB-24，压制滤光片JB-8），有活力原生质体发绿色荧光，不产生荧光为无活力。对于叶肉、子叶、下胚轴而言，由于叶绿素的关系，原生质体发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。此外，还可用细胞壁染色法来鉴定活力.

2.双层培养法固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。

特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎

3.体细胞杂交应用：两个遗传性状不同的体细胞融合的过程。应用：体细胞杂交能克服有性杂交的配子不亲合性，获得一些含有另一亲本非整倍体的杂种或胞质杂种。它们的遗传变异范围极广，大大丰富了育种的原始材料，从而创造出自然界中没有的新物种。如马铃薯与番茄融合得到的薯番茄和番茄薯，白菜甘蓝。

4.杂种植株鉴定：通过形态学、细胞学、分子生化、抗性鉴定、育性鉴定、叶绿

体、线粒体、核DNA、rubp羧化酶分析和同工酶酶谱分析等方法，对获得的再生植株进一步分析和鉴定以证实再生植株的真实性。

5.体细胞杂交分类：按照所用亲本原生质体的性质分为三类：常用的体细胞杂交、配子间的细胞杂交、配子体细胞杂交。

6.物理灭菌方法、特点：A.热力灭菌是最常用的方法包括干热灭菌和湿热灭菌法——1.干热灭菌对象不含水、耐高温器皿、工具等; 2.湿热灭菌热蒸汽，穿透力强、灭菌时间短的一种常用方法（a.间歇灭菌对象不耐高温100度的高温物品或有机溶剂压力100°30min 取出后30°培养24min b高压灭菌时间20min121度0.05-0.15kpa灭菌）B辐射灭菌常用紫外线避免直接在灯下操作C过滤灭菌孔径0.45酶系或小量液体培养基0.20毫米滤膜出去病毒以外的所有微生物

7.无菌操作规程1.每次无菌操作前30min，首先用70%酒精棉擦拭超净工作台，然后把所需的接种器具和培养基等移入超净工作台，打开紫外灯照射接种室20-30min后，再开启工作台气流20-30min 2工作人员手洗干净后进入缓冲室，穿上无菌工作服，然后用70%酒精喷洒全身3进入无菌操作室，检查接种所用的物品4接种前，用70%酒精擦拭双手，按常规操作在酒精灯上进行各种操作5.对清洗过的植物材料进行灭菌，然后进行接种6接种过程不要与人交谈，将器具拿到操作台外，接种时用酒精擦拭后再酒精灯上用外焰灼烧，放凉后再用7工作结束后，及时将接种的材料移出培养室，清理工作台，打开紫外灯照射半小时后将其关闭。

8.体细胞核移植过程：细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。

9.治疗性克隆步骤：首先取病人体细胞核，移植到去核的成熟受体卵母细胞2在早期胚胎形成后，从中分离获得人ES细胞3对ES细胞进行基因修饰和定向分化研究4将定向分化的细胞移给病人

10.诱导变异方法：物理、化学诱变和转座子插入

11.变异的细胞学基础细胞遗传学基础aDNA重复复制但不发生在细胞分裂，其结果是染色体体数目增加，形成同源多倍体．一些中间类型的倍数性的形成，可能是由于DNA经过重复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或和融和所致．b.染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体易位及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。c近年的研究认为，染色体断裂与DNA甲基化程度有关，增加DNA甲基化，也引起染色体断裂．分析认为，甲基化程度曲增加可能抑制DNA的复制效率，使得DNA 复制不能同步，从而造成后期桥的产生和染色体的断裂．

分子遗传学基础：a碱基突变dna序列中碱基的改变，突变的碱基序列处于结构基因的位置或调控序列的位置导致bdna序列的选择性扩增和丢失基因的选择性扩增是为满足细胞短期内的某种需要而产生足够基因产物的一种手段；dna序列的丢失多发生在rDNA及其他们的间隔序列，某些重复序列也易发生c 转座子活化体细胞无性系变异的原因之一dDNA甲基化和去甲基化不仅能通过调控基因的表达与关闭来调控生物的发育，也可以通过甲基化途径来适应环境对生物体的压力

12超低温保护技术应用快冻法慢冻法逐级冰冻法干冻法包埋脱水法

意义1保持细胞培养物的遗传稳定性2长期保存植物种质资源3长期保存农作物的优良品种激情育种亲本材料的种质4建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒原种5保存实验材料，防止再培养中的遗传变异

超低温保护试剂：冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是主要方法液氮DMSO和高分子量化合物聚乙烯二醇海藻糖

13提高次生代谢产物的途径：a选择适宜的起始材料－－种类、部位栀子(ZHIZI)（Gardenia jasminoides）胚轴银杏子叶当归根红豆杉幼嫩的茎茜草叶柄b培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要c前体的应用对某一目的产物来讲可能有多种前体物质，同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。d激发子的应用也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子非生物激发子，如辐射、金属离子、茉莉酸类似物（茉莉酸甲酯）等，生物诱发子内源性（来源于植物结构的化合物）和外源性（包括菌丝、微生物机体）f培养技术的选择包括反应器的选择和培养方式的选择培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本

14.影响悬浮培养因素：a起始愈伤组织的质量

b接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。

c培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。

•培养基

–应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。

–基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定培养基设计时，一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基

有MS、B5、LS 、N6等。