荧光光谱
荧光光谱分析
百泰派克生物科技
荧光光谱分析
荧光光谱法（又称荧光分析法或分光荧光测定）是一种电磁光谱法，可以测量样品吸收光子后发出的光子强度。
实际上，大多数荧光分子是芳香族的，如蛋白质/肽中的色氨酸。
光学技术，如UV-Vis、圆二色谱（CD）、傅立叶变换红外（FTIR）和荧光光谱，都被用于获取被测化合物的结构、相互作用和动力学信息。
荧光光谱是研究溶液状态和显微镜下蛋白质/肽的实时结构和动力学的重要研究工具。
荧光光谱分析。
生物制药，特别是蛋白质和多肽类药物，在整个研发过程中都面临着独特的挑战。
在成功批准和上市之前，需要对治疗性蛋白质/肽的生物物理、生化特性和3D结构有透彻的了解，因为产品的活性、稳定性、毒性、功效和保质期会因结构-活性关系而受到影响。
与小分子不同，这些大分子需要多种分析方法结合进行分析。
荧光光谱法可应用于：1，通过改变荧光强度来探测结构变化或两个分子的结合；2，通过色氨酸荧光的波长定位色氨酸残基（在蛋白质表面或深埋在蛋白质内部）；3，通过荧光偏振和各向异性研究荧光团迁移率。
荧光发光光谱
荧光发光光谱荧光光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。
它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光；通常但不一定是可见光。
一种补充技术是吸收光谱。
在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。
测量荧光的设备称为荧光计。
分子具有称为能级的各种状态。
荧光光谱主要关注电子和振动状态。
通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。
在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。
在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。
与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。
然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。
由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。
因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。
对于原子种类，过程是相似的；然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。
这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。
在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。
发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。
这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。
荧光光谱的原理与应用
荧光光谱的原理与应用一、简介荧光光谱是一种非常重要的光谱技术，用于研究物质的光谱特性。
和吸收光谱相比，荧光光谱具有很多优点，包括高灵敏度、高选择性和动态特性等。
本文将介绍荧光光谱的原理和应用。
二、荧光光谱的基本原理荧光光谱是物质在受激发后发射荧光的光谱。
荧光的产生涉及两个过程：激发和发射。
具体来说，当物质受到足够能量的激发后，其内部的电子会升级到激发态，并在短时间内返回到基态，释放出荧光。
这个过程伴随着光的吸收和发射。
荧光光谱图通常由激发光和发射光组成。
激发光是用于激发物质的光，而发射光是物质在激发后发射的荧光。
通过测量激发光和发射光的强度和波长，可以得到荧光光谱。
三、荧光光谱的应用1. 荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中有广泛的应用。
例如，它可以用来研究生物分子的结构和函数。
荧光标记是研究生物分子的常用方法之一，该方法利用荧光染料或荧光蛋白标记生物分子，通过测量荧光光谱来研究它们的相互作用、分子结构以及代谢路径等。
2. 荧光光谱在材料科学中的应用荧光光谱在材料科学中也有很多应用。
例如，它可以用于研究材料的光电特性。
通过测量材料激发和发射的荧光光谱，可以了解材料的能带结构、载流子动力学等信息，对材料的性能进行评估和优化。
3. 荧光光谱在环境监测中的应用荧光光谱在环境监测中也起到重要作用。
例如，它可以用于水质监测。
通过测量水样中的荧光光谱，可以判断水质的污染程度和有机物的种类。
同时，荧光光谱还可以用于检测空气中的有害气体，如VOCs、NOx等。
4. 荧光光谱在食品安全中的应用荧光光谱在食品安全领域也有广泛应用。
例如，它可以用于检测食品中的有害物质和污染物。
通过测量食品样品的荧光光谱，可以判断食品是否受到了污染，确保食品的安全性。
5. 荧光光谱在医学诊断中的应用荧光光谱在医学诊断中也有很多应用。
例如，它可以用于癌症的早期诊断。
通过测量病变组织或体液中的荧光光谱，可以鉴别正常组织和癌变组织之间的差异，帮助早期发现癌症。
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱
OH H2C O HO O H2C OH HO OH O HO C H2 O OH OH OH O HO O HO CH2 O HO O CH2 HO OH O O OH HO O HO O HO H2C OH
OH
O
CH3CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2
HO
OCH2CH2(OCH2CH2)n OH
β－CD∶OP 加合物的组成
用摩尔比法测定了βCD∶OP 二元体系的组 成. 由图4 可以看出, β - CD 与OP 的摩尔比为1∶1 , 说明在溶液中形成了 1∶1 的二元加合物,
加合物形成的机理及其结构
OP 疏水性烷基链的长 度、径度和体积分别为 1.036 nm、0.400 nm和 0.216 nm3 。 β- CD 空腔的深度 (0.780 nm) 、空腔口直 径(0.780 nm) 和体积 (0.346nm3 ) 相比, OP 的 疏水性烷基链中至多有 6 个碳被包络在空腔内, 其余未被包络部分和极 性头基位于空腔外
H2C
H2C
CH3 N
NpMA
PyMA
DMAA AMPS NpMA PyMA
AIBN DMF
乙醚
乙醇多次洗涤干燥
萘和芘标记聚电解质在水溶液中的紫外光谱和荧光光谱
在水溶液中的紫外吸收 光谱与小分子萘和芘的 光谱基本相同, 说明萘 和芘标记到聚电解质上 并没有对它们的光谱结 构产生明显影响, 而且 混合溶液表现出两者光 谱的迭加. 290 nm 处萘有一吸收带, 而芘的吸收很弱, 所以 在混合溶液中可用290 nm 激发萘; 343 nm 处仅 有芘的吸收, 因此可用 343 nm 选择性地激发芘.
330 nm 为中心的发射带 是萘的荧光, 360～ 440 nm 是单体态芘的发射光 谱, 480 nm 是芘激基缔 合物的发射光谱.
pl光谱和荧光光谱
PL光谱（Photoluminescence Spectroscopy）和荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy）在某些情况下可以互换使用，但严格来说它们之间有一些区别。
荧光光谱：
荧光光谱通常是指材料吸收了特定波长的光子后，电子从低能级跃迁到高能级，在返回低能级时释放出比入射光更长波长的光的过程。
这种现象是由于物质内部能量状态的变化引起的，并且需要一个外部光源来激发。
荧光光谱仪用于测量激发光谱、发射光谱、峰位、峰强度等信息，这些信息可以帮助了解分子或晶体结构以及其动力学性质。
PL光谱：
PL光谱则是指“光致发光”（Photoluminescence），它也是通过照射待测物体产生激发态粒子，然后激发态粒子自发地回到基态并释放出光子的过程。
然而，术语PL光谱常常特指半导体材料中的这一过程，特别是在研究半导体中缺陷和载流子行为的时候。
在实践中，两者之间的主要区别在于应用领域和技术细节。
荧光光谱更多地应用于生物医学、化学等领域，而PL光谱则常用于物理学和材料科学，特别是对于半导体的研究。
然而，这两者的基本物理原理是一样的：都是基于受激辐射导致的发光现象。
荧光光谱
0.46
0.60
λexmax(nm) 205 286
365
390
λ max em
(nm)
278
321
400
480
3. 刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面
性增加，有利于荧光发射。
芴
F=1
戊省 0.52 580 640
联苯
F=0.2
-O
O
O
荧光黄
C
COO产生荧光
F=0.92
-O
O
酚酞
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱC COO不产生荧光
到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
C. 激发光谱与发射 IF4800 固定em=620nm(MAX) 固定ex=290nm (MAX)
光谱的镜像关系
4400 4000
1→ 4
1→1
4 3
3600
S1
3200
1→ 3
1→2
2 1
2800
1→ 2
2400
1→4
2000
1600
1200 800
1→4
400
1→1
0
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
4 3 2 1
S0 ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
D.磷光光谱
与发射光谱相同条件下的磷光光谱
IF4800
4400 4000
488
τ p(s)
2.6
2.5
1.4
0.23 0.014 0.0023
含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。
荧光光谱名词解释
荧光光谱名词解释
以下是几个与荧光光谱相关的常见名词的解释：
1. 荧光：荧光是指物质吸收光能后，在经历激发态到基态跃迁过程中发出的光辐射。
这种光辐射通常具有较长的波长，可见光范围内的颜色。
2. 激发：激发是指将物质从基态转移到激发态，使其能级上升，通常是通过吸收光能或其他能量来实现。
激发是产生荧光的前提条件。
3. 激发光源：激发光源是用于激发荧光的光源。
常见的激发光源包括紫外线灯、激光器和白炽灯等。
激发光源的选择通常取决于所研究的物质的特性和所需的激发波长。
4. 荧光发射：荧光发射是指物质在激发后返回基态时所发出的光辐射。
荧光发射的波长范围通常比激发光波长长，且具有特定的荧光峰。
5. 荧光光谱：荧光光谱是通过测量荧光发射强度随波长的变化而得到的图谱。
荧光光谱可以提供有关物质荧光性质的信
息，如发射波长、发射强度和荧光峰的位置等。
6. 荧光光谱峰：荧光光谱峰指荧光发射谱中最强的发射峰。
荧光光谱峰的位置和强度可以提供关于物质结构和荧光特性的重要信息。
7. 荧光量子产率：荧光量子产率是指物质发生荧光的效率，即荧光发射光子数与吸收光子数之比。
荧光量子产率越高，表示物质更有效地发出荧光。
以上是一些与荧光光谱相关的名词解释。
荧光光谱是研究物质荧光性质和特征的重要工具，广泛应用于生物化学、材料科学、分析化学等领域。
荧光光谱基础知识
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy )韩荣成(10303023)北京大学,03级生物医学工程一、背景知识：1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。
除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。
在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。
但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。
分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。
Ee 大约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级，可见⊿Ee>⊿Ev>⊿Er分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。
从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光（fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭（quenching）。
如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。
磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级⎯三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。
所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。
荧光光谱缩写
荧光光谱缩写荧光光谱缩写（FluorescenceSpectroscopy）是一种研究物质结构和活性的常用技术，它可以获得物质中离子、激发态、和荧光能带等高分辨率的光谱信息，常用于鉴定、分析和研究物质结构和活性。
荧光光谱是基于物质本身能够吸收光谱，然后发射出对应频率长度的光谱，来测量物质结构和活性。
它是一种无损测量技术，可以在原位测量，无需样品的剥离，能够获得物质结构和活性的高精度数据。
荧光光谱研究的结果包括吸收光谱、激发态、和荧光能带等信息。
吸收光谱是根据物质的结构，在不同的频率长度入射的光，物质会有不同程度的吸收，研究其吸收率变化可以了解物质的结构。
激发态是物质中激发态电子在不同跃迁时发出的能量，研究其激发态，可以获得更多关于物质结构的信息。
荧光能带是激发态电子跃迁到其它能态时，所释放的能量的波长范围，研究荧光能带可以了解物质中活性的程度和结构变化。
荧光光谱研究广泛用于地球科学、材料科学、生物科学、分析化学等领域，也经常被应用在大气物质、生物样品和地质样品等实际工程中。
其优势是在不同温度，物质中吸收光谱、激发态、和荧光能带的变化可以被准确测量，可以帮助科学家研究物质的动态性质和结构变化，能够获取有关物质结构的定量数据。
荧光光谱的研究有很多种技术，包括单量子荧光（Single-Photon Fluorescence）、多量子荧光（Multiphoton Fluorescence）、多光子共振荧光（Multiphoton Resonance Fluorescence）、共振能量转移荧光（Resonance Energy Transfer Fluorescence）等，被广泛应用在各种研究领域，用来检测并了解物质的结构和活性。
荧光光谱研究结合了物理和化学，是一种重要的物质研究手段，它可以提供近似于分析化学实验的结果，不仅可用于鉴定、分析和研究物质结构和活性，还可以用于其它科学研究中，比如药物研究、水处理、空气治理等。
荧光光谱
荧光光谱有很多，如原子光谱1905年，Wood首先报道了用含有NaCl的火焰来激发盛有钠蒸气的玻璃管，并得 到了D线的荧光，被Wood称为共振荧光。在Mitchell及 Zemansky和Pringsheim的著作里讨论了某些挥发性元素 的原子荧光。火焰中的原子荧光则是Nichols和Howes于1923年最先报道的，他们在Bunsen焰中做了Ca、Sr、Ba、 Li及Na的原子荧光测定。从1956年开始，Alkenmade利用原子荧光量子效率和原子荧光辐射强度的测定方法，以 及用于测量不同火焰中钠D双线共阵荧光量子效率的装置，预言原子荧光可用于化学分析。 1964年，美国的 Winefordner和Vickers提出并论证了原子荧光火焰光谱法可作为一种新的分析方法，同年，Winefordner等首次 成功地用原子荧光光谱测定了Zn、Cd、Hg。有色散原子荧光仪和无色散原子荧光仪的商品化，极大地推动了原子 荧光分析的应用和发展，使其进入一个快速发展时期。
荧光分析的特点
灵敏度高：荧光分析的最大特点是灵敏度高，通常情况下要比分光光度计的灵敏度高出2-3个数量级。 选择性强：包括激发光谱和发射光谱，在鉴定物质时，通过选择波长可以使分子荧光分析有多种选择。 试样量少和方法简便。 能提供比较多的物理参数：如激发光谱、发射光谱、荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等参数。这 些参数反映了分子的各种特性，并通过它们可以得到被检测分子的更多信息。
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱是一种分析样品中荧光物质的方法，它是利用物质在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
荧光光谱原理是基于物质分子在吸收能量后从基态跃迁到激发态，然后再从激发态跃迁回基态时发出荧光的原理。
在这个过程中，分子的激发态能级和基态能级之间的能量差决定了荧光发射的波长，因此荧光光谱可以用来研究分子的结构、环境和相互作用等信息。
荧光光谱的原理可以用来解释荧光物质的发光特性。
当荧光物质受到激发后，其分子内部的电子会跃迁到激发态，这个过程需要吸收一定的能量。
当分子从激发态跃迁回基态时，会释放出能量，这部分能量就以荧光的形式发射出来。
荧光发射的波长和强度可以提供关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度等。
荧光光谱的原理还可以用来解释荧光物质的激发和发射过程。
在激发过程中，荧光物质吸收能量，使得分子内部的电子跃迁到激发态。
这个过程是一个快速的过程，通常在纳秒到皮秒的时间尺度内完成。
而在发射过程中，分子从激发态跃迁回基态，释放出荧光。
荧光发射的波长和强度受到激发光的波长和强度的影响，因此可以用来研究激发光和荧光物质之间的相互作用。
除了用来研究荧光物质的发光特性和激发发射过程外，荧光光谱的原理还可以用来研究分子的结构和环境。
由于不同的分子在激发后会发出不同波长的荧光，因此可以通过测量荧光发射的波长来研究分子的结构。
此外，分子的环境也会影响其激发和发射过程，因此可以通过荧光光谱来研究分子的环境信息。
总之，荧光光谱原理是基于分子在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
通过研究荧光发射的波长和强度，可以得到关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度、结构和环境等。
荧光光谱在化学、生物、环境等领域都有广泛的应用，是一种重要的分析方法。
化学实验中的荧光光谱分析
化学实验中的荧光光谱分析荧光光谱分析是一种常用的分析技术，它能够通过测量物质在激发光作用下产生的荧光发射，来获得物质的结构和性质信息。
在化学实验中，荧光光谱分析被广泛应用于物质的定性和定量分析。
本文将介绍荧光光谱分析的原理、仪器以及实验操作。
一、荧光光谱分析的原理荧光现象是物质吸收能量后返回基态时发出的光辐射。
当物质受到紫外光或其他能量激发时，部分电子被激发至高能级，由于高能级的不稳定性，电子会迅速返回基态，并释放出荧光发射光。
荧光光谱分析便是基于这种原理进行的。
荧光光谱分析的关键是荧光的激发和发射过程。
首先，物质被激发后，激发态的电子会从吸收态跃迁到激发态，这个过程称为激发过程。
然后，在电子返回基态的过程中，由于能级差异，荧光光子会被发射出来，这个过程称为发射过程。
不同元素和化合物的荧光光谱具有独特的特征，可以对其进行分析和鉴定。
二、荧光光谱分析的仪器荧光光谱分析的仪器主要包括荧光光谱仪和激发光源。
其中，荧光光谱仪主要用于测量荧光发射光的强度和波长，激发光源则用于提供激发光。
荧光光谱仪通常由光源、样品室、分光仪和检测器等部分组成。
光源可以是氘灯、氙灯或者激光器。
样品室是放置样品的地方，通常使用石英或者玻璃制成，以透明材料为主要考虑因素。
分光仪可以将发射光按照波长进行分散，在荧光光谱仪中一般使用光栅作为分散元件。
检测器则用于测量发射光的强度，常见的检测器包括光电二极管和光电倍增管。
激发光源的选择主要根据被测物质的特点和分析要求。
一般来说，紫外光源是常用的激发光源之一，可以提供短波长的光线。
此外，还可以使用激光器作为激发光源，激光器的优点是能够提供大功率和单一波长的光。
三、荧光光谱分析的实验操作进行荧光光谱分析时，需要根据实际情况选择合适的荧光光谱仪和激发光源，然后按照以下步骤进行实验操作。
1. 准备样品：将待测物质制备成适当的溶液或固体样品。
2. 调节仪器参数：根据被测物质的性质和实验要求，调节荧光光谱仪的参数，如选择合适的激发波长和检测范围等。
光谱学中的荧光光谱分析
光谱学中的荧光光谱分析光谱学是一门研究物质吸收、发射或散射光学射线的学科，广泛应用于化学、材料科学、生物学等领域。
荧光光谱分析是光谱学中重要的一种，是通过荧光现象来研究物质本身的属性、结构、构象和功能等方面的科学方法。
一、荧光现象荧光是一种特殊的发光现象，在物体受到激发后发出的辐射光谱，其激发源可以是电磁辐射（光、射线等）或化学反应。
荧光的强度与激发光的波长、激发能量、温度等因素有关。
荧光现象是由物质中的分子或原子受到能量激发后发生的，荧光发射的光谱与分子或原子的电子结构有关。
荧光光谱分析利用荧光现象研究物质分子结构、浓度、化学反应等方面。
二、荧光光谱分析荧光光谱分析是一种非常重要的光谱分析方法，广泛应用于化学、材料科学、生物学等领域。
荧光光谱分析的原理是利用物质分子经受光激发，激发后发出的荧光光谱信息，研究分子的结构、状态和化学反应等有关特征。
荧光光谱通常可以分为发射光谱和激发光谱，其中发射光谱是受到激发后发出的荧光光谱，而激发光谱则是物质在受到激发前的吸收光谱。
荧光发射光谱的峰位和宽度、相对荧光强度以及激发光和发射光的偏振方向等都可以反映物质分子的结构、构象、化学环境等因素，且其灵敏度较高、分析速度快、操作简便等特点使其成为了当前的一种广泛应用的分析方法。
三、荧光光谱分析的应用荧光光谱分析的应用范围非常广泛。
化学上，荧光光谱可用于分析有机物、无机物、金属物质等。
其中有机物荧光分析可用于分析一些药物、环境污染物等。
生物学上，荧光光谱在蛋白质结构研究、酶学分析等方面得到了广泛应用。
近年来，荧光光谱分析还被应用于生命科学领域，如 DNA 分析、肿瘤诊断、药物筛选等方面。
此外，荧光光谱分析也是环境监测、食品安全、医药等领域中的重要分析方法。
综上所述，荧光光谱分析在各个领域都有广泛应用，并且其应用前景十分广阔。
随着科技的发展，荧光光谱分析将会有更广泛和深入的研究和应用。
光谱分析荧光光谱
光谱分析荧光光谱荧光光谱是指在荧光的激发下，样品发出的荧光光线在不同波长下的强度分布情况。
荧光光谱的研究主要集中在两个方面：一是对荧光的发射光进行测量和分析，另一个是对荧光的激发光进行测量和分析。
在荧光的发射光测量与分析中，光谱仪是基本的测量设备。
常见的光谱仪包括荧光光谱仪、荧光光谱仪、荧光分光光度计等。
荧光光谱仪的基本原理是通过样品在荧光试剂的激发下，发射出的荧光光子与荧光物质相互作用，生成可观察到的荧光。
荧光光谱仪通过检测和记录荧光光谱的强度分布，可以确定样品中存在的不同成分。
荧光光谱的激发光测量与分析是指在荧光样品发出荧光的同时，也会吸收一部分能量，即激发光，这一部分能量与样品的化学组成和结构密切相关。
通过测量激发光谱的强度分布，可以了解荧光物质的吸收特性，并从中得出相关信息。
荧光光谱分析具有以下几个特点：首先，荧光光谱能够提供有关样品的结构和成分信息。
不同的物质具有不同的荧光特性，通过荧光光谱的测量和分析，可以鉴别和定量分析样品中的不同成分。
其次，荧光光谱分析具有高灵敏度和选择性。
荧光技术具有很高的灵敏度，可以在很低的浓度下检测到荧光物质。
此外，荧光光谱分析可以选择性地检测和分析荧光物质，不受其他物质的干扰。
此外，荧光光谱分析还具有快速、无标记和无损伤等特点。
与其他分析方法相比，荧光光谱分析速度快，通常只需几秒钟甚至更短的时间。
此外，荧光光谱不需要使用标记物，避免了标记物对样品的污染和干扰。
此外，荧光光谱不破坏样品，可以多次重复测量，对于贵重样品来说是一种非常有价值的分析方法。
在实际应用中，荧光光谱分析具有广泛的应用。
例如，在生物学领域中，荧光光谱可以用于研究生物大分子的结构和功能，如蛋白质、核酸和多糖等。
在药物研发中，荧光光谱可以用于研究药物的荧光特性，并用于药物的质量控制和药理学研究。
在环境监测和食品安全领域，荧光光谱可以用于检测和鉴别环境污染物和食品中的有害物质。
总之，荧光光谱分析是一种重要的光谱分析技术，通过测量和分析样品在不同波长下发射和吸收的荧光光谱，可以获取有关样品结构、成分和性质等信息。
荧光光谱
Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为
Q k nr 1 k nr
非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常 量子效率和波长相关，但生化的荧光通常 和波长无关。
n 1 /
（ 2). 荧光各向异性
荧光偏振： 荧光偏振（参数）： p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥) 荧光各向异性: γ=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +2F⊥) p和同时描述荧光偏振。 从对称性考虑，Fx=Fy,
另外可以通过测量吸收谱的方法确定。
2）荧光偏振 （1）荧光偏振现象及用途 一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏 振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的， 可以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射 过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合 以及蛋白质的内部动力学。 与膜结合的荧光发色团用来估计膜的内部粘性以及居 于相变温度之上的磷脂复合物的特性。
（2）时间分辨寿命
•所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均 匀分布也不是高度有序。 •利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一 个衰减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均 寿命。 •另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分强 度。
•在固体样品中，可以克服样品在溶剂中旋转扩散的影 响。
F0 [ F ] [ FQ] [ F0 ] [ F ] Ks [ F ][Q ] F0 1 K s [Q ] F 与动力学猝灭的形式相仿，然而荧光寿命并没有发生改 变。静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系，因此需要通过改变温 度或测量荧光寿命来区分。kq～T/η（因为和扩散系数相关）
荧光光谱技术介绍
荧光光谱技术概述 荧光光谱的分类与特点 荧光光谱实验技术 荧光光谱分析方法 荧光光谱技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光光谱技术概述
定义
荧光光谱技术是一种通过测量物质吸收光后发射的荧光光谱来研究物质性质的技术。
原理
当物质吸收特定波长的光后，会通过电子跃迁至激发态，当电子返回到较低能态时，会释放出特定波长的荧光。荧光光谱的特性和强度与物质的结构和组成密切相关。
定义与原理
用于检测生物分子结构和功能，如蛋白质、DNA和细胞代谢物等。
生物医学研究
用于检测水体、土壤和空气中的污染物，如重金属、有机物和农药等。
环境监测
用于分析化学物质的结构和组成，如有机化合物、无机离子和金属配合物等。
化学分析
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养成分等。
食品工业
荧光光谱技术的应用领域
原子荧光光谱法的基本原理是原子吸收特定波长的辐射能后跃迁至激发态，随后返回基态时发射出特定波长的荧光。通过测量荧光强度，可以确定待测元素的浓度。
原子荧光光谱法在实践中需要解决一些问题，如光谱干扰、仪器噪声和基体效应等。为了提高测量的准确性和可靠性，需要采取相应的措施来减小这些因素的影响。
原子荧光光谱法通过测量待测元素原子在辐射能激发下产生的荧光强度，来定量分析待测元素在样品中的含量。其优点包括较高的灵敏度、较好的选择性以及较低的检测限。
19世纪末
荧光现象的发现。
20世纪初
荧光光谱仪器的初步研制。
20世纪中叶
荧光光谱技术开始应用于化学和生物学研究。
21世纪初
高灵敏度、高分辨率荧光光谱仪器的出现和应用领域的拓展。
荧光光谱分析
荧光光谱分析引言荧光光谱分析是一种利用物质在受到激发时发射的荧光来分析其性质的方法。
通过测量物质在不同激发波长下的荧光光谱，可以获得有关该物质分子结构、光物理性质以及环境因素对荧光行为的影响的信息。
本文将介绍荧光光谱分析的原理、仪器和应用。
原理荧光光谱分析基于物质分子在受到激发时发射荧光的原理。
当物质受到激发波长的光照射时，其分子内的电子被激发到高能级，随后返回基态时发射荧光。
不同分子结构、物理性质和环境因素会影响荧光的发射行为，因此通过测量荧光光谱可以得到有关物质性质的信息。
荧光光谱分析可以分为荧光发射光谱和荧光激发光谱。
荧光发射光谱是在固定的激发波长下测量物质发射的荧光光谱，用于研究物质的荧光特性。
荧光激发光谱是测量物质在不同的激发波长下发射的荧光光谱，用于研究物质的光物理性质和分子结构。
仪器荧光光谱分析通常使用荧光光谱仪进行测量。
荧光光谱仪包括激发光源、样品室、光学系统和检测器。
激发光源通常可以使用氘灯、氙灯或激光器，用于激发样品的荧光。
样品室是放置样品的空间，通常使用四面透明的石英室。
光学系统包括分光镜、滤光片和光电二极管等组件，用于收集和分析荧光信号。
检测器负责将荧光信号转换为电信号，并传输到计算机进行数据处理和分析。
应用荧光光谱分析在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些典型的应用领域：生物领域荧光光谱分析在生物领域中被广泛应用于分析生物样品的成分和性质。
例如，荧光光谱可以用于分析蛋白质、核酸、细胞器和药物等的结构和相互作用。
荧光标记技术也是生物荧光光谱分析的重要应用之一。
环境监测荧光光谱分析可以用于环境监测和污染物分析。
通过测量水、空气等样品的荧光光谱，可以获得有关污染物浓度、分布和性质的信息。
荧光光谱分析在水质监测、大气污染物分析以及土壤污染检测等方面具有重要应用价值。
材料科学荧光光谱分析在材料科学中用于分析材料的结构和性质。
例如，荧光光谱可以用于研究材料的能带结构、杂质掺杂和缺陷等。
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能量转移与供体的发射谱和受体的吸收谱的重叠、量子 产率、距离、相对取向相关。
（2）.能量转移的物理机制
（1）碰撞猝灭分析
Lackowicz “Principle of fluorescent spectroscopy”Chapt 8, p237-p265
碰撞猝灭的Stern-Volmer 方程
F0 / F =1+kqτ0 [Q]＝1＋KD[Q] 其中kq是猝灭速率 τ0 是无猝灭剂存在时的荧光寿命 [Q]是猝灭剂的浓度
激发态的供体能量被受体吸收，荧光强度下降。
能量转移可能以两种方式：辐射和非辐射。 共振转移的机制：
偶极子相互作用通过非辐射进行能量转移 （<10nm)。
荧光能量转移的先决条件： 1)供体和受体有一定谱重叠（共振能量转移）。 2)供体和受体距离比较近（正比于R6)。 3）供体和受体跃迁偶极距的方向不能垂直
F F0et /
公式中的τ即为荧光寿命
荧光寿命和量子产率示意图
Q
k nr 1
k nr
Q为量子产率，为荧光发射速率，knr为
非辐射转移速率,τn为荧光自然寿命.通常
量子效率和波长相关，但生化的荧光通常 和波长无关。
n 1/
（ 2). 荧光各向异性
荧光偏振： 荧光偏振（参数）： p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥) 荧光各向异性: γ=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +2F⊥) p和同时描述荧光偏振。
•荧光猝灭，荧光能量共振转移都可以影响荧光的寿命， 因此用时间分辨谱进行研究。
5. 荧光标记
有些物质不发荧光，而且生化分子中如氨基酸中只有少数残基发 荧光，成为内源荧光。
如染料与与研究对象结合，作为探针应用荧光方法与蛋白质结合 后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区大小、粘性、分 子间距离等。
加入染料不应影响大分子的结构 加入染料不应影响大分子的功能 标在不同位置，效果不同。 标记方法： 1）有转基因标记： 单点转基因标记: 把某个氨基酸改变成Trp,或者转变成Cys再与荧
光探针结合。 荧光蛋白：在蛋白中插入含发色团的荧光蛋白，GFP, YFP, 1）绿
色荧光蛋白（GFP,green fluorescent protein）BFP
2）量子点荧光标记
量子点：Quantum Dot
•量子点又可称为半导体纳米微晶体。目前研究较多的 主要是硫化镉、硒化镉和碲化镉（CdS、CdSe 和 CdTe） 。
时间分辨荧光光谱： 荧光各向异性： 荧光量子点标记，转基因荧光标记 双光子荧光光谱
2.常用荧光光谱
荧光光谱有瞬态荧光光谱和稳态荧光光谱两类。 通常荧光光谱指的是稳态荧光光谱。 1）荧光的激发光谱，发射谱
激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发
射的荧光强度与激发光波长的关系曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多
（2）时间分辨寿命
•所得到的是平均结果。一般来讲，样品不会是完全均 匀分布也不是高度有序。
•利用瞬态测量寿命时，式中的时间寿命是基于只有一 个衰减时间的假设。但如果有多组分，则需要取平均 寿命。
•另外采用有供体和受体时的荧光强度，用的是积分强 度。
•在固体样品中，可以克服样品在溶剂中旋转扩散的影 响。
（1）各向异性的时间相关特性
一般情况下，要用水合体积进行计算旋转相关时间。 如果是球形的样品，将会有单一衰减指数；
大多数情况将会有多个衰减指数。 原因主要是样品为非球形蛋白质或样品中有不同 运动状况的荧光发色团。衰减时间与沿各分子轴的 旋转相关。 如果样品内部某些片断是柔性的，衰减时间也会 改变。因此荧光各向异性可用于研究蛋白的内部动 力学。 能量转移也会影响各向异性衰减。 在膜蛋白的研究中，通过各向异性衰减也有很多 信息。
e)系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 如 电子自旋改变，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
f）振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振
动弛豫的时间10 -12 s。
2）荧光的应用
荧光发光分为内源荧光和外源荧光。 外源荧光应用很广，如染料结合作为荧光探针与蛋
白质结合后吸附在大分子上可以提供微区极性、疏水区 大小、粘性、分子间距离等。 荧光寿命和量子产率： 荧光猝灭： 荧光能量共振转移：
l3
l1
l 2 l 2
a)光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态，过程约10-15s。此时， 荧光分子处于激发态。
b)内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射 跃迁过渡到低的能级。
c)外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的 作用，以及能量转移，过渡到低的能级
d)荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子 激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命 约为10ns左右。
（2）.荧光偏振的定量描述
设发射振子和Z轴夹角为 Y为荧光检测方向
Z θ
X
φ
F∥
F⊥ Y
p=(F∥ -F⊥)/ (F∥ +F⊥)
cos2 cos2 sin2 p
cos2 cos2 sin2
cos2 cos2 d 1 d 2
(3cos2 1) / 2 p
(1 cos2 ) / 2
满足上述条件即为荧光。因此荧光范围比较宽， 从X射线到红外光谱区仍然是荧光。
其他的能量如（化学反应、加热、生物代谢等） 也会有荧光。生活中很多现象都与荧光相关。如： 钞票防伪，日光灯管，萤火虫发光。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
F0/F～[Q]曲线。单一线性猝灭曲线预示所有发色团 和猝灭剂是具有相同的可接近性。如果其中有一种不可接 近，则Stern-Volmer曲线不是线性的。
（2)静态猝灭
荧光发色团和猝灭剂形成不发荧光的复合物，吸收光以
后，以无辐射跃迁的形式回到基态。
解离常数为：
[FQ] Ks [F ][Q]
F0 [F ] [FQ]
荧光各向异性可以采用稳态测量，也可以用瞬态方 法进行测量。稳态测量是得到的是一个平均值，虽然 容易解释，但需要做很多假设。
瞬态测量是测量脉冲激发后的时间相关各向异性。 可以直接从实验数据中观察得到并进行解释。
各向异性与样品尺寸、形状以及标记分子的柔性 相关，需要从各种分子模型进行计算拟合。 各向异性衰减可以从TD或FD方法得到。 目前还是采用时间分辨进行测量。
第3讲 荧光光谱
1. 荧光是怎么产生的？有什么用途？ 2. 常用荧光光谱有哪些？荧光光谱有哪些特征？ 3. 荧光强度和物质浓度是什么样的关系?还有哪
些因素会影响到荧光强度？ 4. 荧光光谱的有哪些光谱参数？ 5. 有哪些实验方法？各种荧光测量方法有什么
用途？
1.荧光介绍
1）荧光产生及其物理机制
荧光：某些物质受到照射后发出能量较低的光，一 旦光照停止，光线也立即消失，称为荧光。入射光 和发射光频率之差称为斯托克频移。
3 .荧光光谱仪及使用 技术
1）荧光光谱仪
光源
激发单色器
样品池
检测器
发射单色器
检测器
荧光是散射谱，所以一般在垂直入射方向接收。背 景是没有入射光，是“暗背景”，因此灵敏度更高。
2）荧光强度和溶液浓度的关系
I0
薄层吸收的光强为：
dF
dI I0[ekcx ekc(xdx) ] I0kcekcxdx
11
2/3
p 3 (3cos2 1) / 2
3）.荧光能量共振转移
（1）能量转移：
Fluorescent resonance energy transfer（FRET)
术语：Förster resonance energy transfer
纪念德国科学家 Theodor Förster Theodor FÖrster 简介
溶液发出的荧光光强正比于吸收光强。
F A dI AI0 kcekcxdx AkI0[1 ekcl ]
如果kcl<<1，进行展开，有
ekcl 1 kcl (kcl)2 (kcl)3 • • • 1 kcl
2!
3!
样品池长度通常为1cm，因此荧光强度为
F ' K 'I0c
荧光随着浓度增高，强度反而减小，称为浓度猝灭。 原因可能是： a 浓度增加，分子碰撞机会增加，增加了非辐射损耗。 b 溶液中其他杂质吸收发出的荧光。（内滤光） c 吸收谱和发射谱重叠，荧光又被吸收。（自吸收） d 仪器原因
Ks
[F0 ] [F ] [F ][Q]
F0 F
1
K s [Q]
与动力学猝灭的形式相仿，然而荧光寿命并没有发生改
变。静态猝灭也是和猝灭剂呈线性关系，因此需要通过改变温
度或测量荧光寿命来区分。kq～T/η（因为和扩散系数相关）
另外可以通过测量吸收谱的方法确定。
2）荧光偏振 （1）荧光偏振现象及用途
一旦用偏振光照射，从许多样品出射的光也是偏 振的。当样品各个方向出射的偏振光是不相同的， 可以说样品显示出偏振的特性。 研究偏振可以提供分子及周围环境更多的信息： 偏振光照射到荧光分子上，分子对光的吸收和发射 过程与分子框架相对偏振光的偏振方向相关。 荧光偏振可以用来测量蛋白质的变形，蛋白质的结合 以及蛋白质的内部动力学。 与膜结合的荧光发色团用来估计膜的内部粘性以及居 于相变温度之上的磷脂复合物的特性。