实验五 蛋白质的定量测定
实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL30%Acr，%Bis 1mL10%过硫酸铵双蒸水载体两性电解质样品液（BSA-10mg/mL）样品液（肌红蛋白-5mg/mL）TEMED共作三支管，每管加胶液约2.聚焦电泳在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
蛋白定量的实验报告
蛋白定量的实验报告本实验旨在利用免疫印迹（Western blot）技术进行蛋白定量，了解不同浓度蛋白样品的定量方法及其应用，为今后实验设计提供参考。
实验原理：免疫印迹是一种常用的蛋白分析技术，通过在蛋白印迹膜上利用特异性抗体与目标蛋白相互作用，从而检测和定量目标蛋白的存在量。
免疫印迹技术的基本步骤包括：电泳分离蛋白样品、将蛋白转移至膜上、与抗体结合、信号发光和检测。
实验步骤：1. 准备蛋白样品：将待测蛋白样品依次制备成不同浓度的标准品，分别为25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL和100 μg/mL。
2. SDS-PAGE电泳：将不同浓度的蛋白样品加入蛋白电泳缓冲液，按照分子量大小进行电泳分离。
3. 蛋白转移：将电泳分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以使用湿式转印法或半湿式转印法。
4. 阻断与孵育：用5%非脂乳糖或3%牛血清蛋白阻断膜上的非特异性结合位点，防止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将目标蛋白的一抗加入阻断液中，孵育膜，使抗体与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：将与目标蛋白一抗结合的二抗加入孵育液中，孵育膜，二抗一般会携带荧光物质或酶标记，在可见光或紫外线下观察或进一步检测。
7. 发光与显影：通过添加发光底物或显色剂，观察蛋白在膜上的相对强度并进行定量分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们成功制备了不同浓度的标准品，并进行了免疫印迹实验，通过观察膜上的发光信号强度来定量目标蛋白的含量。
从实验结果中我们可以看出，随着标准品蛋白浓度的增加，免疫印迹膜上的发光信号强度也呈现出增加的趋势。
这是因为在免疫印迹技术中，标准品的蛋白浓度与免疫印迹膜上的发光信号强度成正相关关系。
因此，通过在实验中测量标准品的发光信号强度，可以根据标准曲线来计算待测样品中目标蛋白的含量。
需要注意的是，在进行免疫印迹实验时，关键的环节是选择合适的抗体。
抗体的特异性与亲和力会直接影响免疫印迹结果的准确性。
因此，在实验设计中，需要充分考虑抗体的选择，并进行合适的预实验来验证抗体的特异性和性能。
仪器分析实验5-紫外可见光谱分析
实验五色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的紫外吸收光谱分析一、实验目的1. 掌握紫外-可见分光光度计的工作原理和基本操作。
2. 掌握紫外-可见吸收光谱的绘制（包括导数光谱）以及定量测定方法。
3. 掌握。
4. 了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱特点。
二、实验原理1. 紫外-可见吸收光谱法测定蛋白质含量的基本原理紫外-可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，也称作紫外和可见吸收广度法，它包括比色分析法和紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。
电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。
当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。
图1 电子跃迁示意图物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度(A),然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I。
与透过光强度I之比的对数与该物质的浓度c及样品池厚度b成正比。
其数学表达式为:此式为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中A为吸光度。
由于不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，具有不同的吸收光谱，因而，我们可以利用紫外-可见吸收光谱法对物质结构进行鉴定和进行定量分析、根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围(150~800nm)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。
氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是蛋白质的基本组成单位。
氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。
20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区均有光吸收，而在近紫外区(220nm-300nm)只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)因为它们的结构均含有芳香共轭π键系统。
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
《生物化学实验》教学大纲
《生物化学实验》课程教学大纲一、课程基本情况课程名称（中文）：生物化学实验课程名称（英文）：Biochemical experiment课程代码：学分：0。
5总学时:24理论学时:实验学时；24课程性质：学科专业基础课适用专业：园艺适用对象:本科先修课程：生物化学考核方式：实际操作占20％、实验报告占50％、技能考核占30％教学环境：实验室开课学院：生态技术与工程学院（一）课程简介:生物化学实验课程是生命科学教学中重要的基础课,主要围绕生物体的组成成分如：蛋白质，核酸，酶等生物大分子的基本性质等方面入手，帮助学生掌握生物化学的基本实验方法和技能，包括层析、比色、电泳、生化物质的分离、制备、分析和鉴定及实验方法、操作技术和一些基本仪器的原理和使用，培养学生基本实验技能，提高综合分析问题的能力。
（二）实验目的和要求：通过本课程的教学使学生了解和掌握现代生物科学研究对本课程的需求，了解生物化学技术的基本原理、方法和技能,包括生物物质的性质鉴定、含量测定、生化分离技术的分离原理（包括盐析、等电点分离技术、电泳技术、色谱技术等）。
通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维及对生命科学探索的兴趣和爱好.要求学生课前预习，写好预习报告，实验过程中仔细观察，认真记录，课后做实验报告。
（三）实验项目列表：实验一生物化学实验基本知识蛋白质及氨基酸的呈色反应学时：3（一）实验类型：综合性（二)实验目的：1 了解实验室规则和常用生化仪器名称，掌握实验记录与实验报告的写法以及实验室一些基本知识，掌握缓冲溶液的配制方法，初步掌握一些仪器的正确操作。
2 掌握鉴定蛋白质的原理和方法.（三）实验内容:蛋白质和氨基酸与一些显色剂反应呈现一定的颜色反应。
（四)要求：通过实验了解蛋白质的一些颜色反应，掌握鉴定蛋白质的方法.（五）每组人数：1人（六）主要仪器设备及配套数:常规仪器25套(七）所属实验室：生物化学实验室实验二蛋白质等电点测定和沉淀反应学时：3（一）实验类型：设计性(二)实验目的：1 熟悉蛋白质的沉淀反应。
蛋白质的定量测定实验报告
蛋白质的定量测定实验报告实验目的：本实验旨在学习如何通过定量分析方法来测定蛋白质的含量，并了解其原理与步骤，掌握实验技能。
实验原理：本实验采用了伯威尔法来测定蛋白质的含量，其原理是使用布莱德福试剂与蛋白质反应，得到紫色化合物，再通过光度计量测光密度，最后根据光密度与标准曲线得出蛋白质含量。
实验步骤：1. 制备标准蛋白质溶液：取不同浓度的酪蛋白标准品称取相应的质量，加入去离子水中定容制成相应浓度的标准蛋白质溶液。
2. 取待测样品加入少许的生理盐水加以均匀悬浮后，以PBS （Phosphate Buffer Saline）定容到一定的浓度。
3. 取10ml的试管，依次加入不同浓度的标准蛋白质溶液分别制成标准曲线，其中最高的浓度为2mg/ml。
4. 在本次实验中样品大部分成分已知，加入生理盐水的原因是为了将待测浓度控制在标准曲线范围内，以保证准确度，同样的超出标准曲线的部分需要稀释。
5. 向标准曲线上各试管加入1ml的布莱德福试剂，摇晃后静置5分钟。
6. 在550nm波长下使用光度计测光密度。
7. 记录测得的各标准点吸光值，并作图得到标准曲线。
8. 根据待测样品的吸光值和标准曲线，计算出样品中的蛋白质浓度。
实验结果：根据标准曲线，以及不同待测样品的吸光值，我们成功计算并得出各样品中蛋白质的浓度如下：样品编号蛋白质浓度(mg/ml)1 0.82 1.23 0.54 0.65 0.9实验结论：通过以上实验步骤，我们成功运用伯威尔法测定出了待测样品中蛋白质的含量。
实验结果表明，实验仪器操作规范，数据准确可靠。
蛋白质是生命体中重要的物质，其定量测定对于生物化学研究至关重要。
此次实验，我们不仅掌握了具体测定方法，而且也深化了我们对蛋白质含量分析的理解和认识。
实验五蛋白质序列分析
输入SwissProt/TrEMBL AC号 打开protein.txt， 将一条蛋白质序列 粘贴在搜索框中
13
计算窗口（7-11） 相对权重值 权重值变化趋势 是否归一化
氨基酸标度
14
输出结果
所用氨基酸 标度信息
分析所用参 数信息
15
文本结果 序列 图形结果 参数
每个位置 的得分
16
蛋白质序列分析
选择滑动窗口大小
选择打分矩阵 和权重
选择输入格式，选择 “SwissProtID or AC” 查 询 内 容 ， 输 入 Q9H2G9
/software/COILS_ form.html
图形结果
33
33
预测为 卷曲螺 旋的区 域
34
蛋白质序列分析
6
输出结果
• 输入Swiss-Prot/TrEMBL AC号—分不同的功能域肽段 • 以P02699为例
功能域
用户自定义区段
7
点击不同功能域得到以下结果
氨基酸数目 相对分子质量 理论 pI 值
氨基酸组成
正/负电荷残基数
8
原子组成
分子式 总原子数
消光系数
半衰期
9
不稳定系数 <40 stable >40 unstable 脂肪系数 总平均亲水性
序列在线提交形式： • 如果分析SWISS-PORT和TrEMBL数据库中序列 – 直接填写Swiss-Prot/TrEMBL AC号(accession number) • 如果分析新序列： – 直接在搜索框中粘贴氨基酸序列
输入Swiss-Prot/TrEMBL AC号 打开protein.txt， 将蛋白质序列 粘贴在搜索框中
实验五 蛋白质的颜色反应和沉淀反应
（三）重金属盐沉淀蛋白质 原理：当溶液PH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷， 原理：当溶液PH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这 PH大于等电点时 2+、 样它就容易与重金属盐（ 样它就容易与重金属盐（如Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+等）结合形成 不溶性盐类而沉淀。 不溶性盐类而沉淀。 注意事项：使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时， 注意事项：使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过 否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。为什么？ 量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。为什么？ （四）生物碱试剂沉淀蛋白质 原理： 原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为 生物碱。 生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱 试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。当溶液PH小于等电点时， PH小于等电点时 试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。当溶液PH小于等电点时， 蛋白质颗粒带正电荷， 蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂发生反应生成不溶性 盐而沉淀。 盐而沉淀。
（五）有机酸沉淀蛋白质 原理：当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷， 原理：当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容 PH小于等电点时 易与某些有机酸如三氯乙酸和磺基水杨酸等的酸根负离子发生 反应生成不溶性盐而沉淀。 反应生成不溶性盐而沉淀。这个反应可将生物体液中的蛋白质 完全清除。 完全清除。 （六）无机酸沉淀蛋白质 原理：浓无机酸（磷酸除外），能使蛋白质发生不可逆的 原理：浓无机酸（磷酸除外），能使蛋白质发生不可逆的 ）， 沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。 沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。
常见的蛋白质沉淀反应
1. 蛋白质盐析作用 2. 3. 4. 5. 6. 7. 酒精沉淀蛋白质 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质 有机酸沉淀蛋白质 无机酸沉淀蛋白质 加热沉淀蛋白质
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量得五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度［目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制、 [原理］双缩脲(ＮH2ＣONHCONH２)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物,称为双缩脲反应,蛋白质分子中含有许多肽键(－CＯＮＨ—)在碱性溶液中也能与Ｃu2+反应产生紫红色化合物、在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。
因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一。
操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差,而且特异性不高。
除—CＯNＨ-有此反应外,－COＮH2、-CH2NH2、－CＳ-NＨ2等基团也有此反应。
［操作］取中试管７支,按下表操作。
各管混匀、放置37℃水浴中保温2０分钟。
用５40nｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。
［计算］(一)在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(g/L),并求出人血清样本得蛋白质浓度、(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者,求出人血清样本得蛋白质浓度(g／Ｌ)。
[器材]中试管７支,l毫升刻度吸管3支,１0毫升刻度吸管1支,水浴箱,72１型分光光度计、坐标纸。
［试剂](-)6N NａOH:称取240g氢氧化钠溶于10００ｍl水中。
(二)双缩脲试剂:称取CuＳ0４·5Ｈ2O ３。
0克,酒石酸钾9。
0 克与碘化钾５.0克,分别溶解后混匀,加６N ＮaOH ｌ０0ml,最后加水至100０ｍl,贮于棕色瓶中,避光,可长期保存、如有暗红色沉淀出现,即不能使用。
(三)0.9％ＮaＣl。
(四)蛋白质标准液(1０mg／m１),称取干燥得牛血清蛋白100、０mg,以少量生理盐水溶解后倒入l０ml容量瓶中,淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中,最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成l0mg ／m1作为蛋白质标准液。
蛋白质检测方法汇总
蛋白质检测方法汇总本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。
了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验五：植物组织蛋白质提取与含量测定
1.4
1.0 5 Y
1.9
1.0 5 Z
四、实验步骤
三、样品蛋白质含量测定
2. 蛋白质含量测定：
两个原则来选择合适稀释倍数： 样品A595不能超过标准蛋白的最大A595值；
去除最小吸光度，选择中间吸光度。
将待测液最佳A595值(Y)代入标准曲线所得方程式中求出待测液中蛋白含量（X）
3. 蛋白质含量计算：
添加
• 按下页表所示依次加入各种试剂；
• 震荡，混匀； • 室温下静置5 min;
混匀
静置
测定 绘制
• λ =595 nm处测各管吸光度； • 绘制标准曲线，X=标准BSA含量，Y=吸光度，
四、实验步骤
一、标准曲线制作 管号 BSA(mL) 0.9%NaCl(mL) 0 0 1.0 1 0.2 0.8 2 0.4 0.6 3 0.6 0.4 4 0.8 0.2 5 1.0 1.0
定容
• 上清定容，用0.9% NaCl定容至10 mL(样品液)，
四、实验步骤
三、样品蛋白质含量测定
1. 样品液的稀释：
管号
稀释倍数（n） 样品液
1
5 0.2
2
10 0.1
3
15 0.1
4
20 0.1
0.9% NaCl
待测液 G-250(mL) A595
0.8
1.0 5 W
0.9
1.0 5 X
G-250(mL)
蛋白含量（ug）
5
0
5
20
5
40
5
60
5
80
5
100
5
X
振荡混匀，静置5 min，以0号管为空白对照 A595
《蛋白质纯化与鉴定实验指南》
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二、Hela细胞核提取物的Sephacry S-300 HR柱层析98实验3 序列特异性DNA亲和层析101一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸 105二、DNA亲和介质的制备107三、亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用112四、亲和层析的操作 113实验4 DNA酶I足迹分析117一、DNA酶I足迹探针的制备118二、DNA酶I足迹分析122实验5 凝胶迁移变动分析126实验6 肝素-Sepharose CL-2B的制备129试剂的配制 131参考文献 138第3单元 大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化 Richard R. Burgess和Mark W. Knuth141实验1 大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制144实验2 包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析148 实验3 可溶性提取物（核心RNA聚合酶-复合物）的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层 152 析一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物153二、免疫亲和层析 154实验4 定量测定与制备小结158一、蛋白质的定量测定 158二、定量SDS凝胶染色与扫描159三、定量蛋白质斑点印迹 160四、酶测定法 163五、纯化记录表 164六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片 165实验5 蛋白质的鉴定167一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm167二、消光系数的测定（Scopes法）167三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度169四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性 169方案补充实验：从过表达细菌提纯 172一、快速蛋白质斑点印迹试验 172二、是可溶的还是不溶的？ 173三、溶解包涵体沉淀需多少N-十二烷基肌氨酸钠？ 173四、沉淀和RNA聚合酶需多少聚乙烯亚胺？174五、从PEI沉淀洗脱和RNA聚合酶需多少盐？175六、透析法除N-十二烷基肌氨酸钠需多少时间？ 176五、胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定 202实验2 膜胰岛素受体的溶解205一、胰岛素受体的溶解及活性测定 211二、溶解膜蛋白用的去垢剂的筛选 213实验3 溶解受体的凝集素亲和层析215实验4 部分纯化受体的胰岛素亲和层析219一、胰岛素亲和层析 220二、配体与活化介质的偶联 221实验5 胰岛素受体与胰岛素的交联223实验6 胰岛素激素的胰岛素受体自磷酸化226实验7 胰岛素受体糖基化的分析229试剂的配制 234参考文献 240附录 243附录1 pH的测量243附录2 缓冲液的配制245附录3 电导率的测量247附录4 固态硫酸铵法分级分离248附录5 蛋白质的SDS-PAGE电泳249一、电泳 251二、凝胶染色 256三、样品制备（沉淀法） 259附录6 蛋白质的过甲酸氧化263附录7 用亚氨基二乙酸Sepharose 6B分离磷酸肽265附录8 蛋白质内序分析用肽段的分离与纯化267附录9 推荐读物269技术索引 271主题索引 273。
生化大实验实验五Folin–酚试剂法测定蛋白质含量
进行测定时，加 Folin氏试剂要特别小心，因为 Folin氏 试剂仅在酸性 pH条件下稳定，但上述还原反应只是在pH 10 的情况下发生，故当Folin氏试剂加到碱性的铜 - 蛋白质溶液 中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏之 前，还原反应即能发生。
【操作步骤】
各管混匀后加入5mL试剂甲，混匀，于37℃放置10分 钟。再加入0.5mL试剂乙（Folin氏试剂），立即振摇均匀， 在37℃保温30分钟，然后于500nm或650nm比色测定。以 吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
这个测定法较双缩脲法灵敏得多，但要费较长时间。 对双缩脲反应发生干扰的离子同样容易干扰Lowry反应，而 且对后者的影响还要大得多。所测蛋白质样品中若含酚类及 柠檬酸均有干扰作用。浓度较低的尿素（约0.5％左右）、 胍（0.5％左右）、硫酸钠（1％）、硝酸钠（1％）、三氯 乙酸（0.5％）、乙醇（5％）、乙醚（5％）、丙酮（0．5 ％）等溶液对显色无影响，这些物质浓度高时必须做校正曲 线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠 - 氢氧化钠溶液即可显 色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须提高碳酸 钠 — 氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
2.样品测定：取1.0mL样品溶液（约含20 ～250μg 多肽或蛋白质）于试管中，加入5mL试剂甲，混 匀后同标准溶液测定。（本次实验样品取0.1加 0.9ml蒸馏水再测定）
3.结果与计算：根据测定管吸光度查标准曲线，由
标准曲线计算样品蛋白含量。
【试剂】
1.标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，配制 成250μg/mL的溶液。 2. Folin - 酚试剂的配制（均用分析纯试剂）： 试剂甲：由下述四种溶液配制，（1）4％碳 酸钠（Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L氢氧化钠 溶液；（3）1％硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液； （4）2％酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸 钠）。在使用前，将（1）与（2）等体积混合配 成碳酸钠 — 氢氧化钠溶液，将（3）与（4）等体 积混合配成硫酸铜 — 酒石酸钾钠溶液。然后将这 两种溶液按50： 1的比例混合， 即为Folin — 酚 试剂甲。该试剂只能用一天，过owry法）测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝)
标准蛋白溶液(mL) 标准蛋白溶液(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.9％ 0.9％ NaCl(mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 标准蛋白含量( 10 20 30 40 标准蛋白含量(µg) 0 考马斯亮蓝试剂(mL) 4.0 mL 考马斯亮蓝试剂(mL) 颠倒摇匀，静置5min， 号试管为空白对照， 595nm处比色 颠倒摇匀，静置5min，以 1 号试管为空白对照，在595nm处比色 A595（OD595） 0
三、试剂及器材
1、实验试剂 、 0.9％ NaCl溶液 ％ 溶液 标准蛋白质溶液 （BSA 0.1mg/ml） ） 考马斯亮蓝 G250（0.01％） （ ％） 样品液 2、实验仪器 、 分光光度计、移液器、试管、 分光光度计、移液器、试管、试管架
四、 操作方法
1、标准曲线制作
取7支试管，按下表操作。 支试管，按下表操作。 1 2 试管编号 3 4 5 8(样品 8(样品) 样品) 0.6 0.8 1ml 0.2 0.2 样品 60 80 6 7
六、 注意事项
1、EP管、试剂要求干净，不含有去污剂。 EP管 试剂要求干净，不含有去污剂。 2 、 蓝色物质不易洗去 ， 测定完后用乙醇将蓝 蓝色物质不易洗去， 色的比色杯洗干净。 色的比色杯洗干净。
七、 思考题
1、与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马 与其它测定蛋白质浓度的方法相比， 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将 制作标准曲线及测定样品时， 各管中溶液颠倒混合 ？
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH 2CH 3
Coomassie G-250
NH
PROTEIN
实验五 DNS法分析蛋白质N-末端
1、α-氨基与丹磺酰氯的反应
反应条件：pH9.0-9.5，室温2-4小时或40℃中反应2小时。
2、 DNS-蛋白质的酸水解
1、DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除 DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)， 甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS—氨基酸 很少破坏。 2、DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基 反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏； DNS-ε-赖氨酸和DNS-O酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨 酸和DNS-双-酪氨酸生成，层析后在层析图谱的位点上，都与 DNS-α-氨基酸有区别。 3、DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，在DNS-C1 过量时，会产生DNS—NH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现 黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分 开。
实验方法Biblioteka 聚酰胺薄膜层析点样 层析
注意事项
1、点样斑点不宜太大，用毛细管可分2-3次点，点 一次吹干一次。 2、层析时层析液不能没过斑点，要在斑点以下。 3、观察时，用铅笔圈好黄色亮点。
思
考
• 网上查询蛋白质结构分析最新动态． • 薄膜层析与其它层析法比较有那些优点？ • 选用展层剂的依据是什么？
DNS法分析蛋白质 末端氨基酸的原理 法分析蛋白质N-末端氨基酸的原理 法分析蛋白质
蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl是一 种荧光物质）在碱性条件下反应，生成DNS-蛋 白质，经酸水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰 胺薄膜层析分析DNS-氨基酸，可确定蛋白质的 N-末端氨基酸。此法灵敏度高，也可用于蛋白 质的氨基酸组成的测定。
双缩脲法测定蛋白质的浓度
5H2O溶于约150ml蒸馏水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室 温放置2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3、 7200分光光度计 0ml置试管中，加入双缩脲试剂2.
1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0. 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。
实验五 双缩脲法测定蛋白质的浓度
1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂： 尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂： 0ml置试管中，加入双缩脲试剂2. 0ml置试管中，加入双缩脲试剂2. 1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0. 尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
0123456
2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8
蒸馏水（ml）
3 2.7 2.4 2.1 1.8 1.6 1.2
双缩脲试剂（ml）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。
三、实验试剂
1、1mg/ml卵清蛋白液：将1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液 并稀释至1000ml.
2、双缩脲试剂：将1.75gCuSO4.5H2O溶于约150ml蒸馏水， 然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰 冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
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实验五蛋白质的定量测定(凯氏定氮法、考马斯亮蓝法)
（4学时+ 4学时）
一、实验目的
学习凯氏定氮法测定总氮含量、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法。
通过检测添加三聚氰胺的样品的表观蛋白及实际蛋白质的含量，掌握两种方法定量检测蛋白质的原理及特点。
二、实验原理
食品制作需要检测蛋白质含量，但是直接测量蛋白质含量技术上比较复杂，成本比较高，不适合大范围推广，所以业界常常使用“凯氏定氮法（Kjeldahl method）”的方法，通过食品中氮原子的含量来间接推算蛋白质的含量。
也就是说，食品中氮原子含量越高，蛋白质含量就越高。
一种化工原料——三聚氰胺，因含氮量很高、生产工艺简单、成本很低，给了掺假、造假者极大的利益驱动，所以为了“增加”产品的表观蛋白质含量，出现了非法添加三聚氰胺的诸多案例。
A 凯氏定氮法总氮含量的测定：
凯氏定氮法是测量天然有机物（蛋白质、核酸、氨基酸等）含氮量的常用方法。
植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。
非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氨化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。
可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测定总氮、蛋白氮或非蛋白氮。
本实验对样品中总氮含量进行测定。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变为无机氮后再进行测定。
将待测样品与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。
为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。
消化完成后，加入过量的NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。
以甘氨酸为例，上述反应如下：
CH2NH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3
2NH3 +H2SO4→（NH4）2SO4
（NH4）2SO4+ 2NaOH →Na2SO4 +2H2O +2NH3↑
2NH3 +4H3BO3→ （NH4）2B4O7 +5H2O
（NH4）2B4O7 +2HCl +5H2O →2NH4Cl +4H3BO3
试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水杨酸转化为铵盐。
由于水杨酸与硫代硫酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。
B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定：
考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
在非结合状态下为红色，当通过范德华力与蛋白质结合后，颜色会变为蓝色，最大吸收波长由465 nm变成595 nm。
吸光度的变化与蛋白质浓度的关系符合比尔定律。
蛋白质与染料的结合在2 min即可完成，达到最大光吸收。
1 h后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀。
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质的灵敏度很高，标准测定法的灵敏度是Lowry蛋白测定法的4倍，其测定范围为10-100μg，微量法的测定范围为1-10μg。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲。
相比Lowry蛋白测定法，考马斯亮蓝法测定快速、简便，干扰物质少。
三、实验器材与试剂
A 凯氏定氮法总氮含量的测定
实验材料
牛血清白蛋白5.5mg、三聚氰胺1mg。
实验仪器
凯氏自动定氮仪，红外温控定时消化炉，玻璃消化管、三角瓶、酸式滴定管。
实验试剂
1. 浓硫酸（AR级）
2. 35%NaOH
3. 混合催化剂：K2SO4：CuSO4·5H2O＝3：1，充分研细、混匀，贮于广口瓶中备用。
4. 混合指示剂：取200mL 0.1%甲基红酒精溶液和50mL 0.1%甲烯蓝酒精溶液混合，贮于棕色瓶中备用。
本指示剂在pH＝
5.2时为紫红色，pH＝5.4时为暗灰或褐色，pH＝5.6时为绿色，变色点pH为5.4，变色范围为pH 5.2～5.6，非常灵敏。
5. 2%硼酸溶液：按100：1的体积比加入混合指示剂，摇匀后溶液呈紫红色即可。
6. 0.010 mol/L的标准盐酸溶液：取比重l.19的分析纯盐酸0.84 mL，加无氨蒸馏水稀释至1L，再以硼酸钠标定。
标定方法：精确称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）0.50 g，溶于50mL蒸馏水中，加混合指示剂2～3滴，用配好的盐酸溶液滴至浅红色。
精确计算盐酸的浓度并稀释成0.010mol/L。
B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定
实验仪器
试管及试管架，移液管（0.1 mL ~5mL），分光光度计。
实验试剂
1. 考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL95%乙醇中，加入100 mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。
最终试剂中含有0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。
2. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量（可直接根据产品标定的蛋白质含量确定），根据其纯度用0.15 mol/L NaCl配制成0.1 mg/mL的蛋
白溶液。
1. 测试样品
样品1：同凯氏定氮法（牛血清白蛋白+三聚氰胺）：配制成0.05 mg/mL 的溶液。
（称量4.2308mg 牛血清白蛋白及0.7692mg 三聚氰胺，用0.15 mol/L NaCl 定容溶解至100mL ，供全班用，此与凯氏定氮法样品相同）
样品2： 牛血清白蛋白，0.05mg/mL 的蛋白溶液。
四、实验方法
A 凯氏定氮法总氮含量的测定
1．样品处理
准确称取待测样牛血清白蛋白5～10mg ，分别放入消化管中，准备1支空白消化管，然后给各管加入混合催化剂6g ，浓硫酸5～10 mL ，置红外消化炉上，先在150～200℃下加热0.5 h ，继续升温到400℃，再消化0.5～lh 。
直至溶液呈清亮透明。
待样品液冷凉后，可用自动定氮仪进行蒸馏，然后进行手动滴定。
2．样品测定
将35％的氢氧化钠溶液和配制好的硼酸溶液分别贮于固定的塑料桶中。
打开仪器的电源开关，通入冷却水以及供锅炉使用的无离子水，输入有关参数，放入已消化好的样品，即可自动蒸馏、手动滴定。
样品与空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。
选用酸式滴定管，加入0.010 nmol ／L 标准盐酸溶液进行滴定，直至三角瓶中硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡红色即为滴定终点，记录盐酸的用量。
3. 计算
含氮量：N （％）=()0401.1V V W M
-
粗蛋白含量： P (%)=N (%) × C
M ——标准酸摩尔浓度
W ——样品重量（克）
V 0——空白滴定标准酸消耗量（毫升）
V ——样品滴定标准酸消耗量（毫升）
C ——粗蛋白转换系数
B 考马斯亮蓝法蛋白质含量的测定
采用微量法测定。
1. 取12支试管，分两组按下表平行操作。
摇匀，1 h内以0号管为空白对照，595 nm比色。
2. 以标准蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，或通过Microsoft Excel线性回归求方程。
3. 样品用0.15 mol/L NaCl配制成0.05 mg/mL的溶液，用吸管吸取0.5 mL 样品溶液，加入5 mL考马氏亮蓝试剂，以标准曲线制作中0号管作对照，测定OD值，平行做两份。
求平均OD值，代入上述回归的线性方程，根据样品稀释度求得蛋白质含量。
五、注意事项：
1. 样品及催化剂加入消化管时，避免粘于管壁。
2. 空白及样品滴定时，保证滴定终点的一致性。
3. 考马氏亮蓝染色后，比色应该在2min-1h内完成，在严格测定的情况下，可在加入试剂后5-20min内测定OD,在这段时间内颜色最稳定。
六、实验报告
1. 结果与讨论
2. 思考题
(1) 何为消化？如何判断消化终点？
(2) 凯氏定氮法、考马斯亮蓝法定量检测食品蛋白质的原理及特点。