大肠杆菌耐热性肠毒素_ST_的分子生物学研究进展_王玉炯

第22卷第3期 宁夏大学学报(自然科学版)2001年9月 Vol.22No.3 Journal of Ningxia Uni versity(Natural Science Edi tion)Sep.2001文章编号:0253-2328(2001)03-0331-06

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展

王玉炯, 许崇波

(宁夏大学生物工程系,宁夏银川 750021)

摘 要:大肠杆菌的耐热性肠毒素(ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁.文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解S T的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义.

关键词:大肠杆菌;耐热性肠毒素;分子生物学

分类号:(中图)R378 2 文献标识码:A

产肠毒素性大肠杆菌(Escherichia coli,E TEC)是引起幼畜腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定居因子),已知的粘着素有K88,K99,F41和987P等.ETEC 借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻[1].

ETEC产生两种肠毒素:一种为不耐热性肠毒素(LT),它由一个分子量为28kD的A亚单位结合5个分子量为11.5kD的B亚单位组成,全LT或B亚单位具有良好的免疫原性[2];另一种为耐热性肠毒素(ST),成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽,有很强的毒素活性,而免疫原性极差.Rebertson 综合研究的资料表明,20%~30%的ETEC为LT+/ ST-;30%~40%的E TEC为LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于E TEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色,对人类和家畜健康有很大威胁,因此从分子水平研究ST的各种性质、致病机理和免疫原性等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义.

1 S T的一般生物学特性

1.1 ST的分类

根据ST的生物学特性及致病性,将其分为ST (又称ST a)和ST (又称ST b)两类[2].ST 可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳猪肠积水;ST 不溶于甲醇,对乳鼠不引起肠积水,而对断乳小猪可致肠积水.ST

可根据它的来源不同及核苷酸序列的差异分为ST a与ST b,ST a为牛源或猪源(又称ST p),ST b为人源(又称ST h),ST 则为猪源性[3].

1.2 ST的理化性质

不同来源的ST 其理化性质相同.ST 分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低离子强度时易与碱性疏水性多肽聚合.ST 分子量较小,为2000D 左右,也有报道为4000D和5000D.18肽的小分子具有3个链内二硫键,因该键属于共价键,键能高,不易破坏,故分子结构高度稳定,因而耐热(在100 30min和121 15min不失活)、耐酸碱(在pH=2~10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂;抗各种蛋白酶水解,为肽类毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活.但ST 对可破坏二硫键的氧化剂和还原剂高度敏感,0.1mol/L的2 巯基乙醇、4 10-5mol/L的二硫苏糖醇和过甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有机溶剂.经等电聚焦测定,ST的等电点为4.3左右.ST纯化后为白色粉末,其最大吸收波长为275nm,最小吸收波长为255nm.ST 单独不具免疫原性,但与大分子偶联可产生免疫原性.J.C.Frantz[4]将人工合

收稿日期:2000-06-12

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660060)

作者简介:王玉炯(1963-),男,教授,博士,研究微生物学、分子生物学及基因工程等.

成的ST a连接到载体蛋白上,加上福氏佐剂免疫动物(母猪、母牛)后可产生抗体,且抗体高峰能维持数周,使出生的新生动物对产肠毒性大肠杆菌的攻击有保护作用.

1.3 ST的检测

对ST 的检测广泛应用的是乳鼠试验,即先将过液培养物(或离心后的上清液)经口灌入2日至4日龄的乳鼠,4h后剖腹取出全部肠管称重,计算肠管与剩余尸体重量的比率,此法简单易行,重复性较好.对ST 的检测是用断乳小猪肠环结扎试验[2],即将4~9周龄断乳小猪麻醉,取其肠段扎成6cm肠环,每环注入5mL菌液或上清液,然后计算肠环中液体与肠段长度的比率(m L/cm).检测ST的免疫学反应主要有放射免疫测定法(RIA)和E LISA等.随着分子生物学的发展,近年来建立了ST基因探针检测方法[3,5~6],应用结果表明,敏感性和准确性俱佳. 1.4 ST 的作用机理

业已证实,ST 能激活颗粒性鸟苷酸环化酶(GC)[7],而二硫化合物能抑制此酶,从而使ST 无作用.ST 的生物活性具有组织特异性,可使回肠上皮细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)增高10倍而结肠下段仅增高1.8倍,对其他组织、器官无活性,此特异性可能与受体分布有关.Mg2+,Mn2+等可增强ST 的作用.

ST 的激活作用具有专一性,这是由于ST 对小肠粘膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲和力,同时小肠粘膜本身以颗粒性酶为主.有关ST 激活酶的作用机理主要有两种学说:一是 瀑布 学说,认为ST 结合到细胞膜表面,打开钙离子能道,钙摄取增加,激活调钙蛋白,触发磷酸酯酶A2,膜磷脂释放花生四烯酸,后者的过氧化物及过氧化氢代谢物使GC激活,但有的学者认为,ST 并不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成分;二是 直接偶联 学说,该学说认为ST 激活GC是直接的,不需要介导酶,即与已知腺苷酸环化酶激活机理相似,依靠ST受体复合物系统激活.

近来,S.A.Waldman研究发现了小肠粘膜颗粒性GC与ST受体偶联的新模式[8],即两者可能通过细胞骨架成分紧密相连.这种偶联可抵抗各种离子、非离子去垢剂、盐及尿素等的溶解,而其他组织上的酶可被上述物质所溶解,但ST受体抵抗溶解作用,说明其他组织中酶与受体无特殊偶联关系.S.A. Waldman观察到GC只有与细胞骨架成分、ST受体结合在一起才被ST 所激活.

ST受体及GC定位于细胞膜刷状缘的亚细胞结构中,其中含有丰富的细胞骨架成分,包括肌纤蛋白等不受去垢剂溶解的物质,这些骨架成分提供基质使GC定位于此,并与受体偶联.有趣的是小肠粘膜细胞膜上的c GMP依赖性蛋白激酶也与受体及GC 位于相同位置,并与骨架成分紧密相连.进一步研究发现,位于刷状缘的25kD蛋白磷酸化后,在小肠可介导ST 毒素诱导的离子转移.据以上资料推测, ST 引起水和电解质分泌是由刷状缘上ST 受体, GC,cGMP依赖性蛋白激酶,25kD底物蛋白形成一个功能性复合物所介导,这些成分可以共价键形式紧密连接于细胞骨架成分上,并保持一种有利于各种成分相互作用的适当的空间排列结构,从而发挥各自的功能.

上皮细胞c GMP增多而引起肠液潴留致泻已予公认,但对其中的机理尚不明了.业已发现,cGMP和cAMP一样,能使电泳性质相似的刷状缘膜和basola teral膜蛋白磷酸化,小肠绒毛上皮细胞内cGMP含量增高,Cl-主动吸收受抑制,跨膜电位和短环路电流增加,8 溴cGMP模拟的短环路电流增加约为8 溴cAMP的1/3,推测ST的作用可能与霍乱肠毒素通过c AMP升高使Na泵磷酸化、Na+吸收障碍导致水泻的机理相似,即cGMP使Cl-转运蛋白磷酸化, Cl-主动转运受抑制,进而肠腔内电解质与水潴留引起腹泻.

2 ST的分子生物学研究

2.1 ST基因的位点

编码ST的基因位于产肠毒素性质粒(Ent)上.含有ST 基因的质粒多是接合性质粒,分子量为46~97MD,与编码性菌毛的F质粒有一定的同源性.含有ST 基因的质粒分子量为21~80MD,至少一部分质粒是接合性质粒.ST 常与定居因子在同一大质粒上,ST 常与LT在同一大质粒上[9].某些ST基因位于转座子上,两端有反向重复序列,称为Tn1681.

2.2 ST基因的克隆和表达

M.H.W.So等[10]首先报道成功地克隆了ST基因,即将带有ST毒性决定簇的牛源大肠杆菌ESF0041的质粒用EcoR 切出8.9kb的片段,然后与载体pSC101连接,转化到非产肠毒素性大肠杆菌,使ST的产量大约增加3倍,然后又将这一杂种质粒进行亚克隆,用Ba mH 酶切产生2个片段,大小分别为5.6kb和3.4kb,再分别与pBR322重组,转化后进行筛选检测,发现只有3.4kb片段产生ST.以此再用Pst 消化产生1.7kb,1.4kb和0.3kb

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