亲和纯化工艺(建工)
串联亲和纯化技术
串联亲和纯化技术亲和纯化技术是一种常用的蛋白质分离和纯化方法，在生物科学研究、药物研发等领域广泛应用。
它使用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用，通过一系列步骤实现目标蛋白质的高效纯化。
本文将从亲和纯化的原理、步骤以及应用方面来进行详细介绍。
亲和纯化技术的原理基于分子间的特异性识别和结合。
首先，我们需要选择一个适当的配体，该配体具有与目标蛋白质结合的能力。
配体可以是抗体、亲和色谱介质等。
当样品中含有目标蛋白质时，配体与目标蛋白质结合形成复合物。
随后，我们可以通过控制条件（如pH、离子浓度等）来解离复合物，从而获得纯化的目标蛋白质。
亲和纯化技术的步骤主要包括细胞裂解、配体固定、样品加载、洗脱和再生步骤。
首先，我们需要将细胞裂解得到包含目标蛋白质的混合物。
其次，将配体固定在纯化介质上，形成亲和色谱柱或亲和杂质。
然后，将混合物加载到亲和色谱柱上，目标蛋白质与配体发生结合。
在洗脱步骤中，通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH或离子浓度，从而调控目标蛋白质与配体的结合，使其从亲和柱中洗脱出来。
最后，进行再生步骤，即通过再生缓冲液将配体重新恢复到初始状态，以便于下一次亲和分离的进行。
亲和纯化技术在生物科学研究和药物研发中具有重要的应用价值。
首先，在蛋白质研究领域，亲和纯化可以用于纯化目标蛋白质，获得足够纯度的样品进行结构解析、功能研究和药物筛选。
其次，在疾病诊断和治疗方面，亲和纯化可以用于纯化特定抗原，用于制备相应的诊断试剂盒或制备特异性治疗药物。
此外，亲和纯化还可以用于分离和纯化膜蛋白、酶等难以纯化的蛋白质。
在进行亲和纯化实验时，我们需要注意以下几点。
首先，选择合适的配体是关键，配体必须能够与目标蛋白质特异性结合，而不与其他非目标蛋白质结合。
其次，进行样品加载时，应注意控制加载量和速度，避免样品过量或过快，以免影响纯化效果。
此外，洗脱步骤中要根据实验需求选择适当的洗脱缓冲液，以充分洗脱目标蛋白质。
最后，在实验结束后，应及时进行亲和纯化柱的再生，以确保下次实验的有效性。
第九章 亲和纯化技术
（二）空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分 子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。 常用的“手臂”多为烃链。
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（三）配基与载体的结合位点的影响
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（一）配基的选择
亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。 1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和 势），KL 在10-4～10-8之间。
2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。
13
亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ）
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（二）配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增 加配基浓度有利于吸附。 增加亲和柱的长度来提高吸附率。（增加配基 浓度有困难时） 配基浓度太高
亲和纯化技术
（Affinity purification）
1.生物亲和作用（bioaffinity）：生物物质， 特别是酶和抗体等活性物质，具有识别特定物 质并与该物质的分子结合的能力。这种能力具 有排他性。生物分子间的这种特异性相互作用 称为生物亲和作用。 2.利用生物分子间的特异性结合作用的原理进 行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术
KL
配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响
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（一）配基浓度对亲和力的影响
为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，须提高配基浓度。
11第九章--亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
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碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
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（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
62
非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
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离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
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疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
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（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
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1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
生物制药工艺学习题第九章亲和纯化技术
第九章亲和纯化技术一、填空题1、亲和层析洗脱方法有，，。
2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。
3、亲和层析中常用作别离酶的配基有，，和。
4、亲和层析中非专一性吸附有、、。
5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和两大方法。
二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的选项是〔〕A.载体必须能充分功能化。
B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。
C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。
D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。
2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是〔〕A.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中参加配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 竞争洗脱D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 正洗脱D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取〔Affinity-based resersed micellar extraction〕：2、亲和膜：3、二次作用亲和沉淀〔secondary-effect affinity precipitation〕：4、亲和萃取：5、亲和吸附剂：6、负洗脱：四、问答题1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？2、对亲和层析的公式 LK L V Ve ][100+= 进展说明。
设 K L =10-7，求[L 0] 〔6分〕 3、何谓“手臂〞？其长短与亲和层析效果有何联络？为什么？4、从亲和沉淀的机理和别离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。
第九章 亲和纯化技术〔答案〕一、填空题1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。
2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、配基构造 等。
最新亲和纯化技术
亲和色谱
-目标产物的特异性洗脱
特异性洗脱利用含有与亲和配基 或目标产物具有亲和结合作用的小 分子化合物为洗脱剂，通过与亲和 配基或目标产物的竞争性结合，脱 附目标产物。特异性洗脱条件温和， 有利于保护目标产物的生物活性。 另外，由于仅特异性洗脱目标产物， 对于特异性较低的亲和体系或非特 异性吸附较为严重的物系，特异性 洗脱有利于提高目标产物的纯度。
其他亲和过程
-亲和沉淀定义
亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离相 结合的蛋白质类生物大分子的分离技术， 包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和 沉淀。
其他亲和过程
-一次作用亲和沉淀原理
水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含 有两个以上亲和结合位点
化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联 交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀
亲和配基固定在 膜孔表面，流体在 对流状态下透过膜 的过程中目标蛋 白与配基接触而被 吸附
亲和错流过滤-定义
亲和错流过滤是生物亲和相互作用与 膜分离相结合的蛋白质类生物大分子 的分离纯化技术
亲和错流过滤-原理
传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量 大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可 得到分离，选择性差；
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为 亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是 固定床亲和层析的变型。
亲和膜-亲和膜的提出
固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）
亲和膜思路提出
“降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”
亲和膜-亲和膜的原理
其他亲和过程
-二次作用亲和沉淀原理
利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆 性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基， 制备亲和沉淀介质
10 第八章 亲和纯化
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• 2.1.9 肝素 • 肝素(heparin)是存在于哺乳动物的肝、肺、 肠等脏器中的酸性多糖类物质，相对分子 质量一般为5至30kD，具有抗凝血作用。
• 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性 核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有 亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。 • 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶 液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。 38
• 1.4 配位键 • 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位， 则两者之间可通过金属配位键间接结合。
• 例如羧肽酶(carboxypeptidase)与其底物的 结合需要通过锌原子产生配位键。过渡金 属离子Cu2+，Zn2+和Ni2+等可与组氨酸的咪 唑基产生配位键，形成金属螯合结构。
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• 1.5弱共价键 • 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， • 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基 (hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。 当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键 的条件时可能形成弱共价键。
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• 2.6 螯合剂 • 如果亲和结合作用源于亲和分子对与 金属离子形成的配位键，则加入乙二 胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离 子，可使亲和结合作用消失。
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3、亲和作用体系
• 酶反应的底物特异性即反映在一种酶仅与 特定的物质(底物)相结合并催化该物质发生 的特定反应。 • 此外，酶反应的可逆竞争性抑制剂和底物 一样与酶的活性部位结合，抑制酶的活性。 由于酶反应的产物来自底物，与底物具有 某种相似性，也往往成为酶反应的抑制剂。
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• 1.2氢键
• 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或 氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用，即形 成O…H—O (0.26nm)或O…H—N (0.28～0.30nm)。
亲和纯化原理
亲和纯化原理
亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，其原理是利用特定配体与目标蛋白之间的高亲和性相互作用来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
在蛋白质纯化过程中，亲和纯化技术因其操作简便、纯化效果好、选择性强等优点而备受青睐。
本文将介绍亲和纯化的基本原理及其在生物制药领域的应用。
亲和纯化的基本原理是利用配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。
通常情况下，配体会被固定在固定相上，例如琼脂糖或者磁珠上，而目标蛋白则通过与配体的特异性结合而被选择性地吸附在固定相上。
随后，通过洗脱等步骤，可以将非特异性结合的蛋白质去除，从而实现目标蛋白的纯化。
亲和纯化的选择性来源于配体与目标蛋白之间的特异性相互作用。
这种相互作用可以是多种多样的，例如亲和素-受体、抗体-抗原、金属离子-亲和标记等。
其中，亲和素-受体相互作用是亲和纯化中最常用的一种，因为亲和素与受体之间的结合强度高、特异性好，可以在不同的条件下实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
在生物制药领域，亲和纯化技术被广泛应用于重组蛋白药物的
生产中。
由于重组蛋白药物通常需要高纯度的蛋白质作为药物原料，因此亲和纯化技术可以有效地实现对重组蛋白的高效纯化。
此外，
亲和纯化技术还可以用于从复杂的生物样品中富集目标蛋白，例如
从细胞培养上清液中富集重组蛋白，从血清中富集特定蛋白等。
总的来说，亲和纯化是一种重要的蛋白质纯化技术，其原理简单、操作方便、选择性强，因此在生物制药领域得到了广泛的应用。
随着生物制药行业的不断发展，亲和纯化技术也将不断完善和改进，为生物制药的发展提供更加可靠的技术支持。
生物制药工艺中的纯化与浓缩技术应用
生物制药工艺中的纯化与浓缩技术应用随着人们对生物制药品需求的增加，纯化与浓缩技术在生物制药工艺中扮演着重要的角色。
这些技术的应用能够有效地提高药物的纯度与浓度，确保产品符合质量要求。
本文将探讨在生物制药工艺中纯化与浓缩技术的应用。
一、纯化技术在生物制药工艺中的应用1. 亲和纯化技术亲和纯化技术是一种基于生物分子间的特异性相互作用而实现的纯化方法。
该技术的基本原理是利用目标分子与亲和基质之间特定的结合作用，将目标分子从复杂的混合物中提取出来。
例如，亲和纯化可以用于提取重组蛋白、抗体和酶等生物制药品。
亲和纯化技术能够高效地纯化目标分子，并且可以选择性地去除杂质，提高纯度。
2. 过滤技术过滤技术是生物制药工艺中常用的纯化方法。
这种方法通过使用不同孔径的过滤器将目标分子与杂质分离，以达到纯化的目的。
过滤技术可以分为微滤、超滤和纳滤三种类型。
微滤主要用于去除较大的固体颗粒和生物颗粒，超滤适用于去除分子量较大的杂质，而纳滤则可用于去除分子量较小的溶质。
过滤技术具有操作简便、高效快速等优点。
3. 离子交换技术离子交换技术是一种基于分子之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
该技术通过将目标分子与具有适应性功能团的离子交换基质接触，利用目标分子与离子交换基质之间的静电相互作用进行分离纯化。
离子交换技术在生物制药工艺中常用于去除对生物活性产物有不利影响的杂质，如离子性杂质。
二、浓缩技术在生物制药工艺中的应用1. 蒸发浓缩技术蒸发浓缩技术是一种常用于生物制药工艺中的浓缩方法。
通过加热药物溶液，将溶剂蒸发掉，使溶液浓度增加，以达到浓缩的目的。
蒸发浓缩技术适用于高沸点溶剂体系的浓缩，可以有效地去除大量的水和溶剂。
然而，蒸发浓缩技术可能对热敏感的生物制药品造成损害，因此需要根据具体情况选择合适的操作条件。
2. 膜分离技术膜分离技术是一种通过半透膜将溶质与溶剂分离的浓缩方法。
根据溶质与溶剂的分子大小、电荷和亲疏水性等特性，选用不同类型的膜进行浓缩。
亲和纯化等其他纯化方式
亲和纯化等其他纯化方式亲和纯化是一种常见的蛋白质纯化方式，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
除了亲和纯化外，还有许多其他的蛋白质纯化方式，如离子交换纯化、凝胶过滤纯化、逆流纯化等。
下面是对这些纯化方式的介绍和应用。
一、亲和纯化亲和纯化是利用目标蛋白质与配体之间的亲和作用实现的一种纯化方式。
常见的亲和纯化方法包括亲和层析、亲和吸附和亲和电泳等。
亲和层析是最常用的亲和纯化方法之一，其基本原理是将含有某种特定亲和配体的固定相与蛋白混合，使目标蛋白与亲和配体相结合，然后通过洗脱步骤将目标蛋白从其他杂质中分离出来。
亲和层析常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标记分子等。
二、离子交换纯化离子交换纯化是利用蛋白质分子的带电特性进行分离的一种纯化方法。
其基本原理是通过蛋白质与离子交换基质之间的静电相互作用来实现分离和纯化。
离子交换基质一般是具有阴阳离子交换功能的柱子，可根据蛋白质带电性质的不同选择合适的离子交换材料。
通过调节溶液pH值和离子强度，可以控制蛋白质与离子交换基质的相互作用，实现对目标蛋白的选择性吸附和洗脱。
三、凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化是一种根据蛋白质的分子大小进行分离的方法。
该方法通过使用一系列孔径大小不同的凝胶过滤材料，使较大分子的蛋白质无法通过凝胶网孔，从而实现蛋白质的分离和纯化。
凝胶过滤纯化是一种较为简便快速的纯化方式，适用于分离具有不同分子大小的蛋白质混合物。
四、逆流纯化逆流纯化是一种应用于离子交换和亲和纯化中的技术。
其基本原理是通过动态对流和逆流洗脱的方式，增强目标蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现高效的分离和纯化。
逆流纯化不仅能提高蛋白质的纯化效率，还可以有效去除杂质和保护目标蛋白的生物活性。
在蛋白质纯化领域，亲和纯化、离子交换纯化、凝胶过滤纯化和逆流纯化等方式都有各自的优点和应用范围。
科研工作者和生物制药工程师可以根据实际需求选择合适的纯化方法，以实现对目标蛋白质的高效分离和纯化。
生物制药工艺学第9章亲和纯化技术08-04-16
一、亲和层析的原理
（1）配基固定化：配基与 载体偶联，结合成具有特 异亲和性的分离介质。
（2）吸附样品：亲和层析 介质选择性吸附生物活性 物质.
（3）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
动画
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二、亲和层析载体
（一）、亲和层析对载体的要求：
（1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
洗脱：
洗脱方法主要有三种：
非专一性洗脱
特殊洗脱
专一性洗脱
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非专一性洗脱
改变洗脱剂的pH。 离子强度的分步和梯度变化.
亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 Cl－<I－<CF3COO－<SCN－ <CCl3COO－。
用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
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特殊洗脱
4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。
pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
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5、多孔玻璃珠：
化学与物理稳定性较好，机械强度高。 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质
有非特异性吸附，化学活性基团少。
有较大的亲和力。
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（四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。
（五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
亲和纯化
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• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加 剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
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• 2.5 离液离子 • 在SCN-，I-和CIO4-等离子半径较大的离 液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 • 因此，如果疏水相互作用对亲和结合的 贡献较大，则添加这些离子会降低亲和 结合作用。
• 1.4 配位键 • 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位， 则两者之间可通过金属配位键间接结合。
• 例如羧肽酶(carboxypeptidase)与其底物的 结合需要通过锌原子产生配位键。过渡金 属离子Cu2+，Zn2+和Ni2+等可与组氨酸的咪 唑基产生配位键，形成金属螯合结构。
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• 1.5弱共价键 • 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， • 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基 (hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。 当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键 的条件时可能形成弱共价键。
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• 生物分子间的这种特异性相互作用称为生 物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用 (affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特 异性结合(specific binding)或亲和结合 (affinity binding)。
• 利用生物分子间的这种特异性结合作用的 原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲 和纯化技术(Affinity purification)，其代表 为亲和层析法(Affinity chromatography)。
第八章 亲和纯化
概念
利用生物分子间特异性结合的原理进行物质分 离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表性的方法为亲和层析法 (Affinity chr与该物 质的分子相结合的能力。这种识别并结 合的能力具有排他性，即生物分子能够 区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一种分子相结合。
亲和纯化技术
亲和色谱
-间隔臂的作用
当配基分子量较小时，为 了排除空间位阻作用，需 要在配基和载体之间连接 一个“间隔臂”
间隔臂的长度有一定限制， 超过一定长度后，配基与 目标分子的亲和力会减弱
亲和色谱
-影响亲和吸附的因素
杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关
亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场 使介质与目标分子共同沉淀
亲和色谱定义
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲 和吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似，
多采用断通式前端分析
法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理
料液进料（feedstock loading）
组氨酸 肝素
肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量 为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。
亲和色谱
-亲和色谱介质应满足条件
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；
物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子
介质的活化方法－溴化氰法
亲和膜-定义
亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜
为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质， 是固定床亲和层析的变型。
亲பைடு நூலகம்膜-亲和膜的提出
固定床亲和层析的缺陷
以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限 放大困难（放大采用径向放大）
《生物制药工艺学》第9章亲和纯化技术
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。 ，
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基
载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用
配基。 • 特殊配基（special ligand）
• 具有离子基团的亲和 吸附剂会影响蛋白质的 洗脱行为。
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疏水基团
• 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中 的疏水区相互吸引，形成非专一性 吸附。
• 疏水基团： • （1）长的烃链结构的“手臂”： • （2）疏水性配基：
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复合亲和力
• 离子效应作用，又有疏水作用。 • 配体与配基有较强生物特异性。 • 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高
酚、醇类等偶联。 •
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（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其 它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法 • 重氮化法 ( 含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
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聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。 • 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
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叠氮化法
• 聚 丙 烯 酰 胺 的 酰 肼 衍 生 物 ， 加1mol/L的亚 硝酸，反应液搅90s；
化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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溴化氰活化法
• 载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下 用溴化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳 酸”中间体。
• 在弱碱的条件下直接与含有游离脂肪族氨 基或芳香族氨基的配基偶联。
蛋白质稳态技术中的亲和纯化步骤和实验条件的优化
蛋白质稳态技术中的亲和纯化步骤和实验条件的优化蛋白质是细胞中重要的生物大分子，承担着许多生物学功能。
为了深入研究蛋白质的结构和功能，科学家们开发了各种各样的蛋白质纯化技术。
其中，亲和纯化技术是一种常用且有效的方法，通过利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用，实现目标蛋白质的富集。
亲和纯化是一系列复杂的步骤，其中包括样品制备、亲和基质选择、结合和洗脱条件的优化。
在这些步骤中，合理的实验条件和优化的步骤可以提高亲和纯化的纯度和收率，并最大限度地减少副产物和非特异性吸附。
首先，样品制备非常关键。
在进行亲和纯化之前，需要从生物体中提取目标蛋白质。
为了保持目标蛋白质的活性和稳定性，必须在低温下进行提取，并在提取过程中加入适量的保护剂和抑制剂。
此外，还应选择合适的提取缓冲液和提取方法，以确保目标蛋白质的完整性和纯度。
其次，亲和基质的选择也十分重要。
亲和基质是亲和纯化中的核心组成部分，有选择性地结合目标蛋白质。
常用的亲和基质包括亲和树脂、亲和标记和抗体等。
在选择亲和基质时，需要考虑目标蛋白质和杂质的特性，选择具有高结合选择性的亲和基质。
接下来，结合和洗脱条件的优化可以进一步提高亲和纯化的效果。
在结合条件中，需要选择合适的结合缓冲液和结合温度，以实现目标蛋白质和亲和基质之间的特异结合。
常用的结合缓冲液包括盐溶液和非离子型洗脱剂。
在洗脱步骤中，应选择适当的洗脱缓冲液和洗脱方式，以最大限度地减少非特异性吸附和副产物的存在。
最后，优化后的亲和纯化条件可以通过多种方法进行验证和评估。
其中包括比色法、SDS-PAGE、Western blot等，这些方法可检测纯化蛋白质的纯度、活性和相对分子质量。
根据实验结果，可以进一步调整和优化亲和纯化步骤和实验条件。
在蛋白质稳态技术中，亲和纯化是一种十分重要且常用的方法。
通过合理选择样品制备方法、亲和基质以及优化结合和洗脱条件，可以获得高纯度、高收率的目标蛋白质。
优化后的亲和纯化条件不仅有助于深入研究蛋白质的结构和功能，还可以为后续的实验和应用提供可靠的实验结果。
Chapter 8 亲和纯化
三、亲和作用体系
①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金 属离子； ②抗体：抗原、病毒、细胞； ③激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白； ④外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体 蛋白、细胞； ⑤核酸（ DNA和RNA ）：互补碱基链段、组蛋 白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；
亲和作用体系的特异性
高度特异性体系：一对一关系，如抗原与其单克
特点
优点 以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续 化操作； 选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析； 载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散 传质阻力，目标分子的亲和结合速度快； 不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂 贵、放大困难的缺点。 缺点 相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。
第三节 亲和膜
一、原理
利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和 纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜
亲和层析。
二、应用及特点
应用：单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱
氢酶（G6PDH）的纯化等。
特点
优点 传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用 率高； 压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。 缺点 理论板数很低，吸附和清洗效率低； 膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的 寿命下降。
亲和纯化技术 定义：利用生物分子间的特异性结合作用（亲 和作用）的原理进行生物物质分离纯化的技术。 分类：亲和色谱技术、亲和膜分离技术、亲和 沉淀、亲和反胶团、亲和电泳等。
第一节 生物亲和 作用
一、亲和作用的本质
参与亲和作用的两个分子中，其中之一为蛋 白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白
亲和吸附作用只有在特定配基的存在下才能实
串联亲和纯化法
串联亲和纯化法
亲和纯化是一种利用毒物与固定结合基的吸附作用，将溶液中的污染物从水中萃取出来，以达到较高的处理效果的技术。
1、原理：亲和纯化技术主要利用水溶液中污染物与某些复杂化学物质结合，
以实现将污染物从水中分离。
该技术可以有效解决水中有机污染物（如硫醇、杂芳香族烃、芳香类胺类、有机磷酸盐等）以及重金属离子等的污染问题。
它通常是通过某种固定结合基（如碱性团聚水合物材料）将复杂污染物分离出来，让污染物在当量的复杂溶液中黏结聚集，从而实现对溶液中污染物的萃取。
2、过程：亲和纯化主要包括以下步骤：
（1）向反应系统中加入一定的固定结合基；
（2）将反应系统中的污染物吸附到此固定结合基上；
（3）从反应系统中移除污染物，以达到污染物消减的目的；
（4）回收得到的固体固定结合基；
（5）处理后的溶液再次进行清洗，以消减可能存在的有机物。
3、应用：亲和纯化技术在工业废水处理上是不可替代的，广泛应用于食品、
制药、化工、石油等工业生产过程中的各种废水处理，也有针对各种单一的污染物的处理，如废水中有机污染物、重金属离子等。
它不仅可以帮助企业在改善水质事业中发挥着重要作用，也能帮助工厂在节能、降耗、减排上发挥重要作用。
4、优势：
（1）效率高：比其他水处理技术效率还要高，可以有效处理各种水中的污染物，
主要用于去除废水中的有机物和重金属。
综上所述，亲和纯化技术是一项有效、安全、可靠的水处理技术，用于清除、净化企业的废水，可以有效解决水中有机污染物、重金属离子等的污染问题。
因此，亲和纯化技术在工业废水处理和污染的控制中起着不可替代的作用。
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• 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，利于蛋白质与固定化金属离子结合。
• 金属离子如锌和铜。
• 吸附：在。 • 洗脱：降低值、增加离子强度、或在缓冲
液中加 等方法。
• 特点： • 蛋白质吸附容量大。 • 价格便宜。 • 具有普遍适用性。
•
②偶联条件温和。
•
③偶联效率高。
双功能试剂法
• 双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团的 化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。
• 二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 • 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、
酚、醇类等偶联。 •
（二）、聚丙烯酰胺凝胶及 其它凝胶衍生物活化与偶联
• 叠氮化法
第一节 亲和层析 ()
• 利用生物大分子物质具有与某些相应 的分子专一性可逆结合的特性而建立 的层析技术。
• 适用于从成份复杂且杂质含量远大于 目标物的混合物中提纯目标物。
特点
• 经过一次处理可得到高纯度活性物质 。 • 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度
快、分离效果好、分离条件温和。 • 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
应用受到限制。
• 、聚丙烯酰胺凝胶： • 有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较
高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 • 过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
• 、多孔玻璃珠： • 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性
蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。
• 、其它载体——壳聚糖
亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （）。
一、亲和层析的原理
• （）配基固定化：配基与 载体偶联，结合成具有特 异亲和性的分离介质。
• （）吸附样品：亲和层析 介质选择性吸附生物活性 物质.
• （）样品解吸：选择适宜 的条件使被吸附物活性物 质解吸。
• 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥。 • 配基浓度与亲和对解离常数相关。 • 对于低亲和力系统，配基浓度。
（二）、空间障碍的影响
• 空间位阻。 • 对于分子大的配体以及小
分子配基更明显。
• “手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。
• 常用的“手臂”多为烃链。
（三）、配基与载体的结合位点的影响
• 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 • 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
碳二亚胺缩合法
• 碳二亚胺为 羧基活化剂。
• 反应中的脲 衍生物可用 有机溶剂洗 涤除去。
（三）、用于固定化配基的凝胶衍生物
、活化的 经活化，可偶联蛋白和核酸类配基。
、和 含有个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 用于含有羧基的一类配基。 能与含有一级氨基的配基偶联。
• 多肽或蛋白质等大分子配基
• 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能 基团与载体连接。
• 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附 剂具有较大的亲和力。
• （四）、载体孔径的影响 • 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 • 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。
• （五）、微环境的影响 • 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 • 避免引入离子键的基团。 • 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。
、纤维素
• 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大 分子的渗入。
• 非特异性吸附力较强，空间位阻。
• 主要用于分离与核酸有关的物质。
、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖浓度有、、，商品为 、和（）。 • 保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种
功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 • ,稳定性明显增加，能在中应用。
• 、葡聚糖凝胶： • 葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，
第二节 其他亲和纯化技术
一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳）
一、 亲和过滤（ ）
• 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括 亲和错流过滤和亲和膜分离。
• 亲和错流过滤（ ）: 是将亲和层析与 超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的 亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲 和层析与膜过滤的优点。
第九章 亲和纯化技术
• 利用生物分子间的特 异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯 化的技术称为亲和纯 化技术（ ）
技术要点
• （）找与底物专一可 逆结合的配基。
• （）将配基通过共价 键偶联到基质。
• （）配基与底物吸附； • （）洗脱目标物。
亲和纯化技术
• 亲和层析( ) • 亲和过滤（膜分离） • 亲和分配（双水相萃取） • 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） • 亲和沉淀（沉淀） • 亲和电泳（电泳）
• 洗脱方法主要有三种：
•
非专一性洗脱
•
特殊洗脱
•
专一性洗脱
非专一性洗脱
• 改变洗脱剂的。 • 离子强度的分步和梯度变化.
• 亲和势很高，促溶离子，其洗脱能力的强弱顺序 －<－<－<－ <－。
• 用蛋白质变性剂（如脲或盐酸胍）。
特殊洗脱
• 裂解配基与载体的连接键。
• 断裂方法有： • 硫酯键用羟胺处理分钟。 • 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理。 • 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏
速有关。
• 温度升高会使吸附作用减弱。 • 流速每小时低于 。 • 层析柱用前必须充分平衡。 • 上样体积为柱床体积的。
非专一性吸附
• 亲和层析中的非专一性吸附。
•
离子效应
•
疏水基团
•
复合亲和力
离子效应
• 配基与载体间隔臂的不 完全结合，将无关离子 基团引入吸附剂。
• 具有离子基团的亲和吸 附剂会影响蛋白质的洗 脱行为。
壳聚糖(甲壳素和壳聚糖)
三 、 亲和配基
• 配基的选择 • 配基的浓度 • 配基偶联的位置 • 配基分子的大小 • 配基的类型
（一）、配基的选择
• 亲和层析配基的选用主要取决于分离对 象。
• • 、配基与配体有足够大的亲和力 （亲
和势）， 在～之间。 • 、配基与配体的结合应是专一的 。 • 、配基应具有化学活性 。
亲和错流过滤 （）
• 基质及大分子亲和配基 • 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内
核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的 吸附，形成复合体。
• 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨 大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其 它成分分离。
基质
• 聚丙烯酰胺
• 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、 链球菌等细胞）
、生物胶、亲和胶和亲和胶
• ，无“手臂” 的羧基衍生物。 • 具有个原子“手臂”，未端为氨基。 • 具有个原子的“手臂”，未端具有羧基。
五、 影响吸附亲和力的几个因素
• 配基浓度对亲和力的影 响
• 空间障碍的影响 • 配基与载体的结合位点
的影响 • 载体孔径的影响
（一）、配基浓度对亲和力的影响
• 多糖载体与的高碘酸钠氧化反应小时会产生醛。 • 在温和条件下，醛与赖氨酸上的ε生成西夫碱，
接着用硼氢化钠还原，生成稳定的烷基胺。
环氧化法
• 碱性条件下，多糖载体与环氧氯丙烷作用 生成环氧化合物。
• 环氧化合物又与氨基酸或蛋白质上氨基偶 联。
甲苯磺酰氯法
• 甲苯磺酰氯法
• 在无水丙酮中进行。
• 优点：①活化反应迅速。
亲和势—（复合物的解离常数 ）
•
（二）、配基的浓度
• 对亲和势比较低的时候（≥），增加配基 浓度有利于吸附。
• 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 • 理想的配基浓度为μ。
（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• 亲和柱 • 腺嘌呤氨基接到载体上，对脱
• 重氮化法 (含氨基载体) • 碳二亚胺缩合法（含羧基载体）
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
• 有大量可修饰的酰胺基。 • 酰胺基能被含氮化合物置换制备多种衍生物。
叠氮化法
• 聚丙烯酰胺的酰肼衍生物，加的亚硝酸， 反应液搅。
• 加入脂肪胺类配基，制得亲和吸附剂。
重氮化法
• ω氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对 硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。
六、 配基与间隔臂的连接
• （一）、含氮配基的连接 • （二）、含羧基配基的连接 • （三）、含巯基配基的连接 • （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接
七、 亲和层析的吸附和洗脱
• 影响吸附的条件 • 亲和层析的洗脱 • 亲和吸附剂的再生
（一）、影响吸附的条件
• 亲和吸附剂及配体的性质 • 缓冲液的种类、离子强度、、温度和层析流
糖醇等处理。
专一性洗脱
• （固定化配基），（酶），（游离配基） • （）竞争性效应，即不如稳定，增加洗脱剂中，
会使洗脱下来（正洗脱）。 • （）当稳定性与相同时，的存在并不影响对的
结合，非竞争性效应。 • （）反竞争性效应，即比稳定，使与结合更紧
密（负洗脱） 。
反竞争性效应
亲和层析中配基的选择和洗脱条件
氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛
磷酸脱氢酶有吸附力。
（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸 • 小分子物质作为配基，
载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
（五）、配基的类型