!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

我们这用的是含硫酸铵的。

（买来就加进去了的）。

如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。

实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。

3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。

YPD培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）20 g/L 葡萄糖 (即2%)1x YPDA培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物0.03 g/L 腺嘌呤（即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温20 g/L 葡萄糖 (即2%)实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。

（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。

（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3.（蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。

注意：◆高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。

◆可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。

◆需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15 mg/L。

（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。

）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。

最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEGTE buffer 1X 1 ml of 10X TELiAc 1X 1 ml of 10X LiAc无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10x TE buffer :0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压For β-galactosidase 滤膜实验Z buffer溶液：Na2HPO4•7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4•14H2O 则20.739 g/L）NaH2PO4•H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4•2H2O 则 6. 21g/L）KCl 0.75 g/LMgSO4•7H2O 0.246 g/L最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年X-gal 溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，–20°C避光保存Z buffer/X-gal 溶液：100 ml Z buffer0.27 ml β-mercaptoethanol （β-巯基乙醇）1.67 ml X-gal 贮存液ONPG 溶液：（即配即用）ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.注意：1.ONPG需要1～2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。

带有β-巯基乙醇的Z buffer将0.27 mlβ-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？为了转化成功的小提示：1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。

如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。

（也要大力涡旋使细胞团分散开来。

）2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。

3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。

4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。

如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。

5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。

一般BD是AD的两倍。

（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。

可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forth —not round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。

（接种的时候采取四区分区画线法）二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。

2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。

3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。

4.置于30℃摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD600>1.55.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600在0.2～0.3之间。

6.30℃摇床以230 rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为0.4～0.6.（If the OD600 is < 0.4, something is wrong with the culture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。

9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）(至此酵母感受态细胞制备完毕)12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。

之后轻轻混匀13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。

14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。

15.30℃摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。

17.42℃水浴热激15 min18.取出后在冰上冷却1-2 min19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。

20.用0.5 ml 无菌的1×TE重悬酵母。

21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天。

（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。

）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。

如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α- gal 实验。

如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。

如果酵母能生长的话就接着做一个β- gal。

所以有的人同时转化两种菌种。

这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。

之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。

三. α和β-gal实验：（我就做β-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的24～28页）1.试剂：2.原理：◆ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。

◆Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。

（Na2CO3在配制时，不需要高压）3.实验方法一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）a)将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。