molecularmarker分子标记
molecularmarker分子标记
AFLP标记
EcoR I / Mse I酶切
EcoRI接头
C
ANN
连接 接头 PCR 预扩增 选择性 PCR
MseI接头
A NNC
molecularmarker分子标记
聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测
AFLP标记PAGE电泳结果
molecularmarker分子标记
新组装的杂合体。
molecularmarker分子标记
molecularmarker分子标记
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高
RAPD引物扩增电泳检测结果
molecularmarker分子标记
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子
和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术； （4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
近等基因系的培育与农艺性状基因的标记
P×
F1
×
B C 1F 1
×
B C nF n N IL
molecularmarker分子标记
群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记
群体分离分析法（bulked segregant analysis, BSA）是Michelmore等在 莴苣的抗病性研究中提出的， 简称ＢＳＡ法。 ＢＳＡ法是从近等基因系分析法演化而来的， 它省去了费时费工的选育 近等基因系过程， 克服了许多作物没有或难以创建相应ＮＩＬ的限制， 在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。 对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物，利用 ＢＳＡ法也是进行 快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。 此法是根据性状在 Ｆ２ 代的极端表现分成二组， 用这二组提取的 ＤＮ Ａ分别混合成 ＤＮＡ库， 用此两个 ＤＮＡ库， 筛选出与被测性状相关 的分子标记。 然后， 用此标记在分析群体中进行标记与性状间的共分离分析， 确定是 否连锁及彼此间的遗传距离， 进行基因定位。
分子标记
分子标记（Molecular Markers），是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
每一代的分子标记技术代表如下：
（1）限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）
RFLP是第一代分子标记技术，指把特定的DNA用特点的限制性核酸内切酶进行切割，将切割形成的片段进行标记之后与其他个体进行杂交，以检测不同物种间的多态性。
（2
RAPD是指把第一个生物的基因组用特定的限制性核酸内切酶进行切割，将切割后形成的片段进行扩增，以这些片段为探针来检测2个或多个物种的多态性。
SSR是第二代分子标记技术，指将人工合成或提取的2-8个核苷酸为探针，将其标记之后检测2个或多个物种的多态性。
（4
SNP是第三代分子标记技术，标记单个特殊的核苷酸，用来检测不同个体间的差异性。
检测SNP 的最佳方法是DNA 芯片技术。
对单个核苷酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。
分子标记种类及概述
分子标记概述遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。
早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。
但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。
细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。
同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。
作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。
但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。
近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。
与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
分子标记在菊花育种上的应用
分子标记在菊花育种上的应用菊花(Dendranthemamorifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用以及药用等多种价值。
目前在菊花育种方面的研究仍以传统方法居多，而传统的育种是在不甚明了基因背景的条件下，通过杂交和诱变等育种技术，根据分离群体的形态表现和育种者的经验等对表现型累代选择，从而实现对基因型的改良，加上环境效应较易掩盖基因效应，给目标性状的选择带来很大的难度。
这将导致菊花品种改良进展缓慢，不能满足日益增长的市场需求。
因此我们必须借助一定有效手段和方法掌握菊花的性状遗传，正确选配亲本，达到高产优质的育种目的。
而分子标记(molecularmarker)技术的发展为解决这一问题开创了新途径。
分子标记是在形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来较为理想的一种新的遗传标记形式，具有标记数量多，不影响目标性状的表达，不易受环境影响，结果稳定可靠，重复性好等优点，有效反映生物的个体和群体特征的遗传标记。
使菊花育种中的“间接选择”成为可能，提高了遗传分析的准确性和选育种的有效性。
目前，基于PCR的DNA标记，已广泛应用于遗传图谱的建立、基因标记、基因组作图、基因克隆、亲缘关系和遗传多样性鉴定、品种(系)指纹图谱构建、杂种纯度鉴定、目标性状的连锁和分子标记辅助育种等研究中。
1分子标记的主要类型及特点1．1RFLP标记RFLP多态性是由于DNA序列中单碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位引起的。
目前已广泛应用于基因定位、指纹分析、亲缘关系确定、遗传多样性分析等方面，是发现最早、具有代表性的DNA标记技术。
RFLP具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点，但操作繁琐、技术难度高、污染大、有放射性危害等缺点。
1.2 RAPD标记RAPD通常以10碱基的寡核苷酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增，从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。
RAPD技术所需模板DNA的量极少，分析步骤简单，不需要事先知道基因组的任何分子信息，合成一套引物可以用于不同生物的基因组，能快速检测大量的遗传多态性等优点。
分子标记技术
技术路线
DNA的提取
选择随机引物
PCR反应
凝胶电泳
图谱分析
与RFLP的比较
❖ 相同之处：都从琼脂糖凝胶上DAN条带的多态性 来反映基因结构上的多态性；
❖ 不同之处：RFLP用限制性内切酶消化DNA，通 过分析限制性酶切片端的多态性，来显示DNA的 结构的多态性；而RAPD是利用PCR技术从扩增 的DNA片段上分析多态性。由于片段被引物选择 地扩增，并不是所有序列都扩增，扩增了的片断 能在凝胶上清晰地显现出来，这样就可以通过同 种引物扩增条带的多态性，反映出模板的多态性。
三、DNA分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可 分为三大类。
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括：
★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）；
★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
基本原理
采用随机合成的寡核苷酸（通常10bp）作 PCR反应的引物，对所研究生物基因组DNA进 行PCR扩增，经过30－40个循环，即可得到大 量的DNA片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 EB染色、紫外下显示RAPD带纹。
❖ 由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须 对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向 重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。 引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之 间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片 段数目和长度的差异，导致PCR产物增加、缺少 或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则 产生RAPD标记。
电泳
植物DNA分子标记
In situ hybridization
For in situ hybridization, a tissue sample is incubated with a labeled nucleic acid probe, excess probe is washed away and the location of hybridized probe is examined.
(a) Bx350-184, a 28-chromosome
genome with at least 14 intergeneric translocations, some of which have two breakpoints in an arm (arrows). Bar: 10 μm.
(b) Bx351-160, a 28-chromosome
The technique enables the spatial localization of gene expression to be determined as well as the location of individual genes on chromosomes.
Guo et Βιβλιοθήκη l. 2005ab
c
d
Fig. 5 GISH images of chromosomes of tetraploid and diploid Festulolium progenies. The DNA of L. perenne was used as probe, and shown as blue color. The chromosomes of F. pratensis were shown as pale blue color. Translocation breakpoints are indicated in a and c by arrows.
分子标记技术
食安0801 02 邓凯近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。
本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。
位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。
广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（geneticmarkers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。
蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。
在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。
分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。
理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点：①多态性高；②遍布整个基因③检测手段简单、迅速；④无基因多效性；⑤能够明确辨别等位基因；⑥实验重复性好；⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。
第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。
分子标记名词解释
分子标记名词解释
分子标记 ( Molecular Marker) 是指用于遗传分析、基因组学研究、生物信息学等方面的一类技术工具。
它可以是 DNA、RNA、蛋白质等分子，也可以是其他生物分子，如多糖、脂类等。
分子标记既可以是标记基因 (marker gene),也可以是其他非编码 RNA(ncRNA) 或蛋白质。
分子标记技术广泛应用于遗传多样性分析、基因组学研究、生物信息学等领域。
其中，遗传多样性分析包括遗传图谱构建、单核苷酸多态性 (SNP) 分析、微卫星标记分析等;基因组学研究包括基因组组装、基因组注释、基因组比对等;生物信息学则利用分子标记进行基因预测、蛋白质结构预测、基因表达分析等。
常见的分子标记技术包括：基因测序、分子标记辅助选择、基因组芯片、蛋白质组芯片、生物信息学分析等。
其中，基因测序是目前分子标记技术中最前沿、最常用的技术之一。
它可以通过测序获取基因组序列信息，为基因组学研究和生物信息学分析提供更多的信息资源。
动物遗传育种Chapter 19 育种实践中的分子标记技术
随机扩增多态DNA random amplified polymorphic DNA，RAPD
（1）原理 1990年，美杜邦公司Williams推出。 PCR技术基础上发展起来的，利用一系列单个随机引物（通常为 10个核苷酸），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，然后电泳 检测PCR产物的多态性。 RAPD引物： I. 为随机引物 II. 序列较短（通常为10个核苷酸） III. 为一个寡核苷酸单链引物
第一节 分子标记的类型与原理
2、分子标记的类型
以PCR为基础的分子标记： 随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA, RAPD） 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP) 简单重复序列多态性（simple sequence repeat, SSR） 单链构型多态性（single strand conformation polymorphism, SSCP）
（1）原理 不同物种、品种、甚至同一品种的不同个体间，DNA会发生变异 ，其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动，从而产生了限制 片段长度的多态性； 限制性酶酶解核DNA会产生数万个片段，其大小变化是连续的， 如进行电泳分离，只能看到弥散状的连成一片的电泳结果； Southern印迹转移操作，用特定探针与滤膜上的DNA杂交，经过 放射自显影就能检测到核DNA的RFLP
Chapter 19 育种实践中的分子标记技术
贝类遗传育种研究室 2012/11/30
Chapter 19 育种实践中的分子标记技术
第一节 分子标记的类型与原理
第一节 分子标记的类型与原理
DNA分子标记的种类
1.2.4 单引物扩增反应 (single primer amplification reaction SPAR )
SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用一个引物， 但SPAR分析中所用的引物不是随机的，而是在SSR 的基础上设计的，例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。 扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP— PCR(microsatellite—primed PCR)。分析其多态性。 另外，还有一种与SPAR技术非常相似的标记技术， 即ISTR (Inverse Sequence—tagged Repeat）技术， ISTR所用的引物是在反向重复序列基础上设计的， PCR扩增的是反向重复序列之间的DNA序列。
1.1.1随机扩增多态性DNA(RAPD)
该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8～10个碱基)非 定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分开扩增片段。不需要 DNA探针，用一个引物可扩增多个片段，技术简单，只需少量 的DNA样本，成本较低，RAPD标记一般是显性遗传（极少数 是共显性），但是RAPD分析中重复性不高，由于共迁移的存 在，在不同个体中出现相同分子量的滞后，并不能保证这些个 体拥有同一条(同源）的片段
STMS的发展和相近的分子标记种类
(1)把与SSR互补的寡核苷酸作为多位点RFLP技术中 的探针； (2)把与SSR互朴的寡核苷酸作为PCR引物(可单独作 引物或与随机引物配合使用)，扩增的是基因组DNA 的特定片段，即MP— PCR和RAMPs： (3)用标记的SSR探针与RAPD扩增片段杂交．即 RAMPO或称为RAHM 或RAMS； (4)用5 ‘或3 ‘端加锚的SSR 作引物(如GG[CA] )，即 ISSR。
DAMD (directed amplification of minisatellite region DNA)
分子标记技术
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
RAPD技术流程：
RAPD分子标记的应用
RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东 栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花， 月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉 米，水稻等多种植物中广泛应用。
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA 概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础 之上，它是利用一系列不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研 究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引 物在一定的退火条件下，
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
三. 几种分子标记介绍
1.限制性片段长度多态性标记 Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代 多态性记。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA， 随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代 分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
第九章 分子标记
列；
用于转基因植物鉴定的含目的基因的BAC和YAC
克隆。
果蝇唾液染色体
荧光原位杂交
第二节 以PCR反应为核心的分 子标记
单引物PCR标记
类型
3’端具有选择性的双引物PCR标记
基于特异双引物PCR的标记
单引物PCR标记
•随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism
限制性片段长度多态性
（restriction fragment length polymorphism,RFLP ）
类型
数目可变的串联重复多态性
（Varible number of tandem repeats，VNTR)
限制性片段长度多态性标记
(Restricton fragment length polymorphism, RFLP)
Chapter 9 Molecular Marker
分子标记概念的界定
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗 传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由 一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式） 及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因 编码的酶的不同分子形式）。 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个 界定现在被广泛采纳。 本章中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。
Southern印迹
在20世纪60年代，Southern首先发现卫星DNA由很多短 的重复片段串联在一起。 与此同时， Ham Simth 发现的Ⅱ型核酸内切酶。 southern纯化EcoRⅡ。 Southern用EcoRⅡ酶切卫星DNA，电泳后凝胶中出现了 梯状条带（ladder）。 他将5S rRNA基因组DNA通过一种或几种限制酶消化后， 通过琼脂糖电泳按照大小分离，然后将DNA经过原位变 性后，转移到硝酸纤维膜上，再与有放射性标记的5S rRNA杂交，通过放射性自显影确定了5S RNA基因在基 因组上的位臵。
分子标记及CDDP技术简介
分子标记及CDDP技术简介1.1.1 分子标记介绍分子标记Molecular Markers 是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
分子标记(Molecular marker) 与形态标记(Morphological marker) 、细胞标记(Cytological marker) 、生化标记(Biochemical marker) 共同组成遗传标记的四大标记。
后3种标记是基因表达的结果，是对基因的间接反映。
标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响；而分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映，能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞进行检测，数量多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因是否表达的限制。
DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速在近30年里，分子标记技术得到了快速发展，目前DNA分子标记已达几十种，在植物遗传多样性分析及鉴别、基因作图、基因定位、遗传育种及基因克隆等方面已经得到了广泛的应用[20]。
分子标记在动物、植物和微生物的结构及功能基因方面的研究也有很重要的作用。
两种广泛应用的分子标记技术是随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）[21]）和扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）[22]。
1.1.2 CDDP技术简介1.1.2．1早在20世纪90年代初，RADP法生成DNA marker 被广泛用在多种农作物上，如基因多样性分析和数量性状基因座定位。
分子标记参考资料
分子标记技术及其应用I. Term Explanation (10%, 2 points for each)1. Probe：是一段具有特异碱基序列的单链DNA或RNA分子，经过放射性或非放射性标记、杂交，用于检测互补碱基序列（Single-stranded DNA or RNA molecules of specific basesequence, labeled either radioactively or non- labeled, that are used to detect the complementary base sequence by hybridization.）2. Marker-assisted selection (MAS)：通过对分子标记检测目标基因与某个分子标记的连锁，获知目标基因的基因型。
借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这称为MAS。
3. Gene pyramiding：通过分子标记，选择与目标基因连锁的基因型，将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中。
4. Molecular marker：是指能反映生物个体或种群问基因组中某种差异特征的DNA片段。
这种DNA片段的特性可通过将基因组DNA经限制性内切酶酶切、PCR扩增、分子杂交等技术在电泳凝胶上检测出来。
DNA分子标记是遗传变异在DNA水平上的直接反映。
5. Recombination inbred Lines (RIL)：由两个亲本杂交后，从F2代开始采用SSD等方法经连续多代自交或姊妹交而育成的近交系。
6. Quantitative trait loci (QTL)：控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。
7. Primer：一段DNA或RNA序列。
通过复性结合到模板单链DNA，在DNA聚合酶作用下，能使核苷酸数目得到增加。
（A short DNA or RNA fragment annealed to a singled-strandedDNA and to which further nucleotides can be added by DNA polymerase. ）8. Genetic marker：指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。
分子标记和QTL定位分析
一、分子标记
第三类 ：基于DNA测序的的分子标记
类型
单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称ESTs标记）。
二、遗传图谱
概念
遗传图谱（genetic map）又叫连锁图谱（linkage map）是
指对遗传重组结果进行连锁分析得到的基因标记或其他遗传标记在染色 体上相对位置的排列图。
分子遗传图谱：以分子标记所构建的遗传图谱。
二、遗传图谱
理论依据
指染色体的交换和重组
在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立、自由组合，同源 染色体上的两个非姊妹染色单体之间发生交换，产生非等位基因间的重 组，形成了重组子。重组型配子所占总配子的比例称为重组率，用 r 表 示。重组率的高低取决于减数分裂细胞中发生交换的频率，两对基因之 间的直线距离决定它们之间的交换率，交换率越高，则重组率越大。遗 传图谱的构建就是用重组率来表示基因的遗传距离，图距单位用厘摩 （Centi-Morgan，c M）表示，1c M 的大小大致表示 1%的重组率 （Bohn et al，1996）。但遗传图谱只是显示基因在染色体上的相对位 置，并不能代表 DNA 的实际长度。
2.要考虑杂交后代的可育性；亲本间的差异不能过大，否则染色体
之间的配对和重组会受到抑制，严重的会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分 离群体的创建。
3.在选配亲本时还应对亲本及其 F1 杂种进行细胞
学鉴定；若双亲间存在相互易位，或多倍体材料（如小麦）存在单体或部分染色体
缺失等问题，那么其后代就不宜用来构建连锁图谱。
四、举例
分子标记技术
College of Life Sciences
1
内容
分子标记的背景 第一代分子标记
2
遗传标记(Genetic 遗传标记(Genetic marker)
遗传标记(Genetic marker) 指可追踪染色体 、 染 指可追踪染色体、 遗传标记 色体某一节段或者某一个基因座在家系中传递的 任何一种遗传特性。 任何一种遗传特性。 类型： 类型： marker） 形态标记（ 形态标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular 分子标记(molecular marker)
对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分 对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分 子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳 通过合适的限制性内切酶酶切， 分析后有可能直接检测出DNA片段的差异 分析后有可能直接检测出DNA片段的差异， 片段的差异， 就不需Southern杂交。 就不需Southern杂交。 杂交
26
实验注意事项
电泳时要用低压电泳； 电泳时要用低压电泳； 杂交前探针必须充分变性； 杂交前探针必须充分变性； 要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列 要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列 互补的程度和G 互补的程度和G、C的含量来掌握杂交和洗膜的条 件； 作放射自显影时， 作放射自显影时，要根据杂交后膜上的放射活性 等因素决定曝光的时间。 等因素决定曝光的时间。
19
Hale Waihona Puke RFLP探针 探针RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的， 分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的， 分析的探针 否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型， 否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表 现为弥散状，不易进行观察分析。 现为弥散状，不易进行观察分析。 RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植 探针主要有三种来源， 克隆、 探针主要有三种来源 克隆 物基因组克隆(Random Genome克隆，简称 克隆， 物基因组克隆 克隆 简称RG 克隆)和 克隆。 克隆 和PCR克隆。 克隆
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AFLP标记
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AFLP标记PAGE电泳结果
AFLP标记的主要特点：
（1）由于AFLP分析采用的限制性内切酶及选择性碱基种 类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多 的；
细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因 相互独立，自由组合，而位于同源染色体 上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色 单体间的交换而发生基因重组，用重组率 来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显 示基因间在染色体上的位置，并不反映 DNA的实际长度。
构建遗传图谱的主要环节： ① 根据遗传材料之间的多态性确定亲本 组合，建立作图群体。 ② 对群体中不同植株的标记进行基因性 分析。 ③ 借助计算机程序构建连锁群
（2）每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分 析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；
（3）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传； （4）分辩率高，结果可靠； （5）目前该技术受专利保护。
（简单重复序列） SSR标记
SSR标记的主要特点：
（1）数量丰富，广泛分布于整个基因 （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端 的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也 较高。
BC1群体的特点
BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它 直接反映了F1代配子的分离比例，因而BC1群体的 作图效率是最高的。
由于该群体的配子类型较少，统计及作图分析较 为简单，但提供的信息量少于F2群体，且可供作图 的材料有限，不能多代使用。
对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1群体不太 适合用来作图，一是难以建立较大的BC1群体，二 是容易出现假杂种，造成作图的误差。
等。。。。。。。
分子标记辅助选 择的遗传学基础
标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有 人称之为前景选择（foreground selection）。 前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连 锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选 择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才
能够达到较高的正确率。
不干扰 D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上
几乎不受限制 E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的
育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP 转换成以PCR为基础的标记。
RAPD标记
S104GGAAGTCGCC S105AGTCGTCCCC S106ACGCATCGCA S107CTGCATCGTG S108GAAACACCCC S109TGTAGCTGGG S110CCTACGTCAG S111CTTCCGCAGT S112ACGCGCATGT
植物的花培能力跟基因型关系较大，因而花培过程 会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH 群体的遗传结构，造成严重的偏分离现象，影响到 遗传作图的准确性。
群体 形成 性状研究 对象 准确度
必要的群 体规模 分离比例
F2
F1自交后代
个体
低 大
1:2:3或3:1
BC1
F1回交后代
个体
低 大
1:1
简单重复间序列（ISSR）标记
SNP标记
SNP密度高，分布广，平均约每1000对碱基出现 一个SNP。 两个无关个体间约有300万个SNPs。
其它分子标记技术
DAF (DNA amplification fingerprinting，DNA扩增指纹) AP-PCR (arbitrary primer PCR) SCAR (sequence characterized amplified region，序列 特异性扩增区) STS (sequence tagged site，序列标签位点)、 SSCP (single strand confirmation polymorphism，单链 构象多态性)、 CAPS (cleave amplified polymorphic sequence)。
F1 花药培养等途径
双单倍体(DH)群体
DH群体的特点
DH植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此DH群体 能够稳定繁殖，长期使用。
DH群体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的分离 和重组，因此DH群体与BC1群体一样其作图效率是最 高的。
构建DH群体需精湛的花培技术和染色体加倍技术， 同时所提供的信息量也明显低于F2群体。
供体
M R
M R
受体
m r
m r
目标基因与DNA标记间的遗传距离位p
亲本中DNA标记的带型
M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因
F1杂种中DNA标记的带型
在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm
利 用
MAS 的 遗 传 基 础
（以
RFLP 为
例）
RR Rr rr
(1-r)2 2r(1-r) r2
新组装的杂合体。
分子标记的优越性
1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高
育种效率
开展分子标记辅助选 择应具备的主要条件
A：与目标基因紧密连锁的分子 标记 B: 简便快捷的标记检测方法
分子标记的特点：
（1）直接以DNA的形式表现，表现稳定 （2）数量多 （3）多态性高 （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别
纯合体和杂合体。 （6）成本不太高
RFLP标记
植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
DNA提取 基
用DNA限制性内切酶消化
本 凝胶电泳分离，转移到滤膜上
步 Southern杂交
骤 放射性自显影或酶学检测
RFLP标记的特点
A 无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响。 B 等位基因之间是共显性的，在配制杂交组合时不受
杂交方式的影响。 C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互
RIL群体
亲本1 × 亲本2
F1 F2
多代自交一粒传 F6或F7
RIL的特点
• RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保 存，有利于不同实验室的协同研究，而 且作图的准确度更高。
• 异花授粉植物由于存在自交衰退和不结 实现象，构建RIL群体比较困难。
• 建立RIL群体相当费时。
DH群体
亲本1 × 亲本2
MM类型的分子标记所代表的目标基 因型及其频率
选择的正确率随 重组率的增加而 迅速下降。重组 值越小，其错选 率越低。
如果要求至少选到 一株目标基因型的 概率为P，则必须选 择具有标记基因型 MM的植株至少为：
n＝log（1-P）/log（1-p）
式中p＝（1－r）2
对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为 背景选择（background selections）。背景选 择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵 涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中， 由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生 交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重
RAPD引物扩增电泳检测结果
RAPD标记的主要特点：
（1）不需DNA探针，引物设计无须知道序列信息； （2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子
和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等
技术； （4）样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
分离 群体
抗性 鉴定
分子 标记 辅助 选择
结果 抗 感 杂 杂 杂 感 杂 抗 感 杂 抗 杂 杂 抗 感
作物MAS育种须具备的条件
分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要 求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。 具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手 段，主要是应用PCR技术。 筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、 易操作的特点。 具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计 算机数据处理软件。
分子标记及辅助育种技术
分子标记的类型：
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包 括RFLP、DNA指纹技术等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括 RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、 序列特征化扩增区域SCAR等； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、 表达序列标签EST标记等。
目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行 分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于 MAS育种的分子标记须具备三个条件：
①分子标记与目标基因紧密连 锁
②标记实用性强，重复性好， 而且能够经济简便地检测大 量个体。
③不同遗记
遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在
延长F2使用时间的措施
• 采用无性繁殖，如进行组织培养扩繁、留蔸再生等。 • 使用F2单株的衍生系（F3株系或F4家系），将衍生
系内多个单株混合提取DNA，则能代表原F2单株的 DNA组成。从衍生系中选取单株必须是随机的，且 株数要足够多。
BC1群体
亲本1 × 亲本2 F1 × 亲本1或2 BC1
DH
F1花粉分化 个体 品系
高 中
1:1
RIL
F2个体自交 后代 品系
高 中
1:1
不同作物群体的特点
近等基因系的培育与农艺性状基因的标记