QBHHS JC006-2013 发酵豆粕中小肽的检测办法(三氯乙酸法)
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】
您须知道的发酵豆粕真正品质评判的测定方法说明【五】发酵豆粕中的小肽与抗原蛋白是衡量品质优劣的两项重要指标，长期以来国内的发酵豆粕产品主要由乳酸菌通过厌氧发酵生产，而出于便捷考虑，业内通常使用酸溶蛋白法测定小肽含量，使用ELISA法测定抗原蛋白含量，但随着发酵豆粕使用普遍性提高，并且芽孢杆菌通过有氧发酵生产的发酵豆粕在国内市场上渐露锋芒，这两种测定方法是否适用，是否能作为客观反映小肽和抗原蛋白真实含量的指标，引起了关注与讨论。
1 小肽-酸溶蛋白法①不同pH 发酵(或酶解)的豆粕在酸中的溶解度不同微生物发酵过程中对蛋白质的分解，实质上就是微生物产蛋白酶的作用。
但是，不同酸碱性的蛋白酶酶解豆粕所得的小肽在酸中的溶解度不同，其中酸性蛋白酶酶解小肽高达96%可以溶于三氯乙酸，而碱性蛋白酶酶解小肽不到 50%。
因此，酸溶蛋白更适合评估酸性发酵或酶解的豆粕产品，将低估希杰速益肽这类芽孢杆菌发酵的中偏碱性产品的小肽含量(刘慧珍，江南大学硕士论文，2007)。
速益肽 55%CP 产品酸溶蛋白相对低(6-10%)。
②小肽应有明确的分子量定义食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008 版将小肽的定义由③酸溶蛋白只体现了速益肽小肽含量的一小部分希杰研究所实验发现，同时测定的发酵豆粕样品整体蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布结果(蓝色峰)。
三氯乙酸提取的分子量5kDa 以下蛋白质部分，而红色图谱和蓝色图谱之间存在一个灰色的面积区域是三氯乙酸没有办法提取出来的样品中的肽含量的部分，即三氯乙酸并不能完全溶解出样品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分(如下图)。
2 抗原蛋白-ELISA 法和SDS 法①ELISA 法测定加工豆类产品的缺陷致敏性不确定：目前已有商品化大豆抗原蛋白的检测试剂有大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒，但是另两种大豆抗原蛋白 Gly m Bd 30K 和 Gly m Bd 28K 并没有商品化试剂盒。
发酵豆粕检测方法
发酵豆粕检测方法（参考）目录1.检测用仪器简介 (2)2.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳 (3)3.Elisa 大豆球蛋白（酶联免疫法） (6)4.小肽的检测（酸溶蛋白） (10)5.寡糖的检测——薄板层析法（TLC） (11)6.乳酸的检测 (12)7.蛋白溶解度的检测（PS） (13)8.发酵豆粕蛋白溶解度的检测（改良） (14)9.水溶性蛋白的检测 (15)10.挥发性盐基氮（VBN） (17)11.PH 值测定 (19)12.水苏糖含量的测定 (20)13.水分、粗蛋白、粗灰分、粗纤维、尿素酶活性的检测 (20)1、检测用仪器简介2、变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速而且可重复的方法。
通过对电泳条带的观察和分析，可以很明显的看出发酵前后或不同产品的抗原蛋白含量。
一、 原理SDS —聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE ）电泳主要依据蛋白质的分子量对豆粕中的抗原蛋白进行分离。
SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折迭结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS —蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS —PAGE 因易于操作和用途广泛， 成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
二、 仪器 1、电泳仪及电泳槽 2、振荡器3、离心机（10000 转）4、移液枪（大、中、小）5、离心管（7ml 、5ml 或 1.5ml 、1ml ）三、 试剂： 1、单体母液： 100ml 丙烯酰胺（ACR ） 30g 甲叉双丙烯酰胺 0.8g去离子水定容至 100ml ，棕色瓶 4℃下存放。
可保存 3 个月。
2、分离胶缓冲液（（PH=8.8） 100mlTris-base （1.5mol/L ） 18.17gSDS 0.4g 浓 HCL 调节 PH 至 8.8，定容至 100ml ，过滤，4℃存放。
发酵豆粕的检测方法
发酵豆粕的检测方法引言发酵豆粕是一种富含营养的饲料原料，通过发酵过程可以改变其营养成分和口感等特性。
为了确保发酵豆粕的品质和安全性，需要进行一系列的检测方法。
本文将介绍发酵豆粕的检测方法，并重点讨论营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
营养成分是评价饲料品质的重要指标之一、以下是一些常用的发酵豆粕营养成分的检测方法：1.水分含量检测：采用干燥法测定。
2. 粗蛋白含量检测：采用Kjeldahl法测定。
3. 粗脂肪含量检测：采用Soxhlet萃取法测定。
4. 粗纤维含量检测：采用Weende方法、AOAC方法或Van Soest方法测定。
5.粗灰分含量检测：采用高温炉燃烧法测定。
微生物含量是评估发酵豆粕安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕微生物检测方法：1.总菌落计数：采用平板计数法或膜过滤法。
2.酵母和霉菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
3.大肠菌群检测：采用MPN法或膜过滤法。
4.乳酸菌计数：采用平板计数法或膜过滤法。
重金属含量是评估发酵豆粕的环境污染程度的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕重金属检测方法：1.铅和镉的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
2.汞的测定：采用氢化物液相色谱法或电感耦合等离子体质谱法。
3.铬、镍、锰和锌的测定：采用火焰原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法。
有害物质的含量是评估发酵豆粕的安全性的重要指标。
以下是一些常用的发酵豆粕有害物质检测方法：1.黄曲霉毒素的测定：采用高效液相色谱法或气相色谱法。
2.农药残留的测定：采用气相色谱法或液相色谱法。
3.病原体的检测：采用PCR法或快速培养法。
结论发酵豆粕的检测方法包括营养成分、微生物、重金属以及有害物质的检测方法。
这些方法可以评估发酵豆粕的品质和安全性，确保其在畜牧养殖中的应用效果。
在实际应用中，还需要根据具体情况选择合适的检测方法，并严格执行相关的检测标准，保证检测结果的准确性和可靠性。
发酵豆粕各项指标检测方法
发酵豆粕各项指标检测方法发酵豆粕是一种常见的饲料原料，其发酵过程可以提高饲料的消化率和营养价值。
为了确保发酵豆粕质量符合要求，需要进行各项指标的检测。
下面将介绍发酵豆粕各项指标的检测方法。
1.水分水分是判断发酵豆粕是否存在霉变和变质的重要指标。
水分的测定可以通过烘干法和红外干燥法进行。
烘干法是将样品在105℃下加热，然后进行重量测定，计算得到水分含量。
红外干燥法是利用红外辐射对样品进行加热，通过光学传感器测定样品的水分含量。
2.粗蛋白粗蛋白是发酵豆粕中的重要营养成分。
常用的粗蛋白检测方法有凯氏消解法和红外消解法。
凯氏消解法是将样品与酸和碱进行消解，然后利用定量分析方法测定样品中的氮含量，通过乘以样品的氮蛋白转化系数来计算粗蛋白含量。
红外消解法则是通过红外光谱仪测定样品中的氮谱带，然后根据标准曲线计算粗蛋白含量。
3.粗脂肪4.粗纤维粗纤维是发酵豆粕中的非消化性纤维成分。
常用的粗纤维检测方法有酸碱消解法和中性洗涤法。
酸碱消解法是将样品先用酸和碱进行消解，然后进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
中性洗涤法则是将样品浸泡在中性洗涤液中，进行过滤和洗涤，最后干燥、称重，计算得到粗纤维含量。
5.灰分灰分是发酵豆粕中的矿物质成分。
灰分的测定可以通过加热、烘干和称重来进行。
将样品在高温下加热，使有机物燃烧殆尽，然后进行干燥和称重，计算得到灰分含量。
6.外观和色泽外观和色泽是发酵豆粕的质量指标之一，可以通过目测来判断。
良好的发酵豆粕应该具有均匀的颜色和无异物的外观。
综上所述，发酵豆粕各项指标的检测方法主要包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分以及外观和色泽的检测。
这些检测方法能够全面评估发酵豆粕的质量，并确保其适合作为优质饲料原料使用。
发酵豆粕各项指标检测方法与标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵豆粕各项指标检测方法与标准1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
3、计算氢氧化钠标准溶液的浓度按下式计算c（NaOH）=m/（V1-V2）×0.2042式中c（NaOH）——氢氧化钠标准溶液之物质的量的浓度，mol/l；V1——滴定用邻苯二甲酸氢钾之用量，ml；V0——空白试验氢氧化钠溶液之用量，ml；m——邻苯二甲氢钾之质量，g；• 0.2042——与1.00ml氢氧化钠标准液[c（NaOH）=1.000mol/l]相当的以克表示的邻苯二甲氢钾之用量。
发酵豆粕品质检测方法适用性
发酵豆粕品质检测方法适用性发酵豆粕是一种用微生物菌种发酵过的豆粕产物。
由于发酵过程中豆粕中的蛋白质、纤维等成分有所改变，以及微生物的介入，因此其品质特征也有所不同。
因此，为了评估和控制发酵豆粕的品质，需要进行相应的检测方法。
1.水分检测：水分是豆粕中的重要指标之一，也是影响其稳定性和保存期限的因素之一、常用的水分检测方法有称重法、烘箱法、红外干燥法等，其中红外干燥法由于其快速、准确、无需前处理等优点，适用于发酵豆粕的水分检测。
2. 蛋白质检测：蛋白质是豆粕的主要成分之一，也是发酵豆粕的重要品质指标。
常用的蛋白质检测方法有Kjeldahl法、紫外光谱法、近红外光谱法等。
其中，Kjeldahl法是目前广泛使用的方法，适用于发酵豆粕蛋白质的检测。
3.纤维检测：纤维是发酵豆粕中的另一个重要成分，对其品质和使用效果有一定影响。
常用的纤维检测方法有酸性洗涤法、中和洗涤法、NDF 含量测定法等。
其中，酸性洗涤法是一种相对简单、准确的方法，适用于发酵豆粕中纤维的检测。
5.氨基酸检测：氨基酸是豆粕中的重要营养成分之一，对动物的生长和发育具有重要影响。
常用的氨基酸检测方法有高效液相色谱法、离子交换色谱法等。
这些方法适用于发酵豆粕中氨基酸的检测。
6.微生物检测：豆粕发酵过程中存在大量的微生物，对产品的品质和安全性有重要影响。
常用的微生物检测方法有菌落计数法、PCR法、气相色谱法等。
这些方法适用于发酵豆粕中微生物的检测。
通过上述方法的组合应用，可以对发酵豆粕的水分、蛋白质、纤维、脂肪、氨基酸等多个指标进行综合评估，从而判断其品质特征和适用性。
在实际应用中，可以根据不同需求和使用目的，灵活选择适合的检测方法，进行品质评估和控制，以确保发酵豆粕的品质和安全性。
需要注意的是，以上只是一些常用的检测方法，随着检测技术的不断发展，可能会出现更加快速、准确的检测方法。
因此，建议在实际应用中关注和引入最新的检测技术和方法，以提高豆粕品质的检测水平和评估精度。
发酵豆粕评判标准_测定程序和鉴别方法_葛向阳
蛋白源饲料新研究利用现代生物技术将豆粕转化为优质蛋白质饲料原料，是国际研究开发热点，产品问世不到十年，技术和产业化水平在国际上以丹麦最为突出。
我国在这方面的研究始于上世纪九十年代末，目前国内仍处于大规模产业化的初期，已有几十家企业生产发酵豆粕，但品质参差不齐，也没有统一标准，饲料企业在选择产品上缺乏科学的依据，因此制定发酵豆粕行业标准已成为必要。
1 豆粕发酵的目的明确豆粕发酵的目的，才能够确定评判发酵豆粕质量的主要指标。
豆粕经过发酵其主要目的有以下四个方面：1.1 破坏豆粕中抗营养因子豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、凝集素、植酸、脲酶等抗营养因子，发酵过程中通过微生物、酶及发酵产生的有机酸的作用，使得抗营养因子被降解或者钝化，从而得到破坏。
1.2 消除豆粕蛋白的抗原性豆粕中含有的7S和11S蛋白具有很强的抗原性，幼龄动物对其尤为敏感。
在发酵过程中，主要是通过将其降解而使其失去抗原性。
1.3 降解大分子蛋白质豆粕中11S和7S蛋白分子量分别为350KD和180KD，通过发酵酶解，被降解为氨基酸及各种多肽，有利于动物的吸收利用。
1.4 形成各种有益发酵产物目前豆粕发酵均采用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等安全菌株，产品发酵后往往含有较高数量的有益菌和有机酸、蛋白酶等代谢产物。
2 发酵豆粕评判程序对发酵豆粕的评判，可以按四个步骤进行，需要检测的指标如下：2.1 感官评判包括细度、色泽、粘度、气味。
2.2 常规理化分析包括蛋白含量、水分、灰分、酸度、TCA-N。
2.3 非常规理化分析包括SDS-PAGE电泳、挥发性盐基氮、胰蛋白酶抑制因子、脲酶活性、有益活菌数。
2.4 深度分析包括抗原定量、低聚糖（棉籽糖和水苏糖）、大豆凝集素、全氨基酸组成分析、蛋白酶活性、尿素氮等。
3 发酵豆粕评判指标的检测和判定3.1 色、香、味和粘度豆粕维持一定的温度经过发酵、干燥后颜色变深，国内外优质的发酵豆粕皆为棕黄色，如果颜色浅而与豆粕一致，有可能发酵程度不够或掺入其他浅色蛋白原料。
发酵豆粕常见指标检测方法
实用标准文档粗蛋白含量检测(GB/T6432)一、原理：凯氏法测定样中的含氮量、即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。
加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。
二、仪器设备：1.高速粉碎机，粉碎时间1分钟。
2.分样筛； 0.45mm、40目3.分析天平；感量0.0001g4.消化炉5.滴定管；酸式50mL6.锥形瓶；250mL7.定氮仪；以凯氏原理制造的半自动蛋白测定仪三、试剂1.硫酸：含量98%2.氢氧化钠：40%水溶液（m/V）3.硼酸：2%水溶液（m/V）4.混合催化剂：0.4g硫酸铜(5个结晶水)，6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。
5.混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
6.0.1mol/L盐酸标准溶液：8.3 mL盐酸注入1000 mL蒸馏水中。
标定：减量法称取0.8g左右在270-300℃灼烧2h的无水NaCO3，加水50mL溶解，加10滴混合指示剂，用配好的盐酸滴定成暗红色，煮沸2min，冷却(水中)后再滴至暗红色，同时作空白试验(不加Na2C03)。
计算：m×1000C=(V1-V2)M式中: C——硫代硫酸钠标准溶液之物质的量浓度（mol/L）m ——无水碳酸钠的质量，gV 1 ——盐酸溶液的用量，mLV 2——空白试验盐酸溶液的用量，mLM ——无水碳酸钠的摩尔质量数值，单位为克每摩尔（g/mol ）〔M(1/2NaCO 3)=52.994〕7. 蔗糖8. 硫酸铵：分析纯，干燥四、分析步骤：（国标推荐法）1. 试样的消煮2. 称取试0.5g （含氮量5～80mg ）准确至0.0002g ，放入消化管中，加入6.4g 混合催化剂，与试样混合均匀，再加入12mL 硫酸，于420℃消化炉中消化3小时。
冷却后，加入蒸馏水20ml ，待用。
酶解蛋白粉中小肽含量的检测方法
发酵豆粕的检测除常规指标外，还应检测下列指标酶解蛋白粉中小肽含量的检测方法1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将酶解蛋白粉中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质量。
本方法是参照中华人民共和国轻工业标准大豆肽粉标准(QB/T2653-2004)基础上修订而来。
2、试剂及仪器：１）100ml烧杯；２）10ml，25ml移液管；３）干过滤装置；４）半微量粗蛋白质测定试剂和装置；５）15%三氯醋酸溶液（TCA溶液）；６）4000转／分钟的离心机。
3、方法：准确称取样品3克于100ml烧杯中，加入15%（三氯乙酸）溶液25毫升，混合均匀，静置5分钟。
将溶液定量转移，在4000转／分钟下离心10分钟后，取全部上清夜，用干的滤纸过滤，准确移取其滤液10ml于消化管中，按测定粗蛋白质方法消化、定容（100ml）、移取10ml消化液蒸馏，测定其粗蛋白质含量（半微量定氮法）。
同时做空白试剂。
4、结果：小肽％（占干基）＝｛(V－V。
)×C(HCI)×6.25×0.014×2.5(25ml÷10ml)×10(100ml÷10ml)｝÷m×100%式中：V---样品消耗HCI的体积，ml；V。
---空白消耗HCI的体积，ml；C(HCI)---盐酸的摩尔浓度moN；6.25×0.014---蛋白质转换系数。
m---称取样品质量，g。
小肽％（占蛋白质）＝小肽％（占干基）÷粗蛋白质％×100重复性：A)每个试样取两个平行进行测定，以其算术平均值为结果；B)允许绝对便差为10%C)以小肽占粗蛋白质的百分含量上报结果。
注：小肽含量还应减去氨基酸态氮氨基酸态氮含量检测1、原理利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。
发酵豆粕的检测方法
2.3 酚酞指示液：取酚酞 1g，加乙醇 100mL 使溶解，即得。
3.仪器、设备
3.1 分析天平，感量 0.001g。 3.2 容量瓶：100、1000mL。 3.3 烧杯：100 mL。 3.4 磁力搅拌器。 3.5 高速离心机。 3.6 离心管：50mL。
称取粉碎试样 3-5g（精确至 0.01g）于 250mL 三角瓶中。吸取 100mL 20℃ 蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温 度控制在(20 士 2)℃.，振荡 60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过 滤。过滤完毕后，取 10mL 上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或 半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中： V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。 4.2 小肽含量的测定 4.2.1 操作步骤 称取发酵豆粕 m 3～5g（准确至 0.0001 g）于 250mL 具塞三角瓶内，准确加 入 100.00mL 150g/L 的三氯乙酸溶液。摇匀后，室温振荡 30min，静置 5min，将 上清液倒入 50mL 离心管内,4800r/min，离心 15min。 取上清液 10.00mL 于消化管内，加入 2g～3g 混合催化剂，12mL 浓硫酸，420℃ 消化 1.5h。冷却后，缓慢向消化管内加入约 10mL 蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。 2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L 的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积 V。 4.2.2. 计算：
发酵豆粕过程中氨基酸和小肽的含量变化
发酵豆粕过程中氨基酸和小肽的含量变化豆粕价格一路上涨，现已达到4800元/吨价位，而且呈上涨趋势，这与豆粕的营养价值是相关的，豆粕相对其他饲料蛋白质来说，具体蛋白质含量高，蛋白质中氨基酸比例好，赖氨酸含量高，适口性好，蛋白消化吸收率高达82%左右，如何发挥豆粕的最大功效，并带动配方中其他饲料的消化吸收，增强猪只的健康和生产性能，成为不得不考虑的问题，必竟它涨得太贵了，必须好好利用好它。
发酵豆粕不失为一种好的方法，发酵豆粕最早在欧洲研究并进入实践，后在台湾有了更好的发展，并传入大陆，当初研究开发发酵豆粕的初衷只是因为鱼粉太贵，来代替鱼粉的，不过，在养殖实践中，养殖场发现发酵豆粕不仅仅有替代鱼粉的功能，不仅其粗蛋白消化吸收提高到了95%以上，而且增加了猪的抗病能力，增强了植物饲料中微量元素的利用效率和生物效价，最后终于把产生这些功能的物质锁定在小肽这种物质上，业已证明，小肽可以直接被动物肠道所吸收，其消化吸收率比氨基酸还要高，同时，小肽与微量元素的结合，可以显著促进微量元素的生物效价，从而减少微量元素和矿物质元素的添加量，降低成本和环境污染；小肽还具体增强动物免疫功能的作用，目前早已用于人食用的有：胸腺肽、干扰素、免疫球蛋白等肽类产品，不仅效果突出，而且没有副作用，这对于目前规模化养猪业来说，是一个好消息，养猪技术的发展，造成的一个最大的弊端就是猪只容易应激，而小肽在解决断奶仔猪应激方面有独到的功效；发酵还产生益生菌，酸化剂，香味剂，多维等等，上面已讲述很清楚，这里不再累述，总之，高企的价格，迫使我们不得不尽其所能，提高其饲喂效率。
为了确定最佳发酵时间和发酵加水量，我们做了大量的发酵试验，试验方案中包括料水比的确定，最终确定料水比为1比2，在这种料水比情况下，发酵料中空气更少，同时有利于厌氧发酵进行，另外，发酵产热量少，即使有产热，也由于加入的水比较多，而水的蓄热性能极好（比热高），可以大大缓解温度的上升，而料水比为1比1时，往往发热量比较大，可能对发酵不利，实践证明，料水比在1比2时，在夏天，料内温度也最多在32度左右（需要避免放置于太阳底下发酵）。
发酵豆粕的品质评定
发酵豆粕的品质评定作者：李旺，孙二刚，李建恩，等来源：《江西饲料》 2015年第4期李旺1,2孙二刚2李建恩2赵丽霞2程传红2（1. 河南科技大学动物科技学院洛阳471003；2. 河南宏翔生物科技有限公司汝州467500）摘要：本文就发酵豆粕评价的几个主要指标：粗蛋白、小肽、挥发性盐基氮、蛋白质溶解度、大豆抗原和总有机酸进行关联分析。
指出评价发酵豆粕的品质评定不能只关注几个指标，要对相关指标进行关联分析和综合评价才能全面客观确定发酵豆粕的品质。
关键词：动物营养；发酵豆粕；品质评定中图分类号：S816.17文献标识码：A文章编号：1008-6137（2015）04-0001-040 引言众所周知，蛋白质饲料是饲料原料中非常重要的一类，优质蛋白原料短缺是短期内无法解决的问题。
优质蛋白原料的缺乏，导致鱼粉、优质肉粉、乳清粉等动物性原料成为动物养殖业的奢侈品。
人们逐步考虑用植物性蛋白原料在特殊动物群体中（如仔猪）使用，大豆粕作为主要的蛋白原料在大部分动物饲料中使用，然而豆粕中含有多种抗营养因子，其蛋白质生物转化率较低。
目前已在豆粕中发现了10余种抗营养因子(ANFS)，这些特点决定了豆粕在幼龄动物中使用受到限制[1]。
微生物在生长繁殖过程中能够产生丰富的酶系，并且产生维生素、寡糖、氨基酸、脂肪酸等代谢产物，这些酶可以分解豆粕中的大分子蛋白变为小肽，代谢产物能够改善豆粕的风味和适口性，使豆粕的营养价值进一步提高[2]。
因此，国内外已有很多饲料原料企业开始发酵豆粕的生产和销售，虽然产品名称都是发酵豆粕，但产品营养成分差异很大、品质良莠不齐。
由于产品没有国家标准，现行的行业标准出台较晚，相应发酵指标的检测复杂，用户缺乏参考，在产品的选择上存在盲目性。
有些企业甚至为了美化主要指标而采用了添加无机氮、热处理、后加有机酸等手段迷惑市场。
本文围绕发酵豆粕的几个关键指标建立起几个指标的综合评定方法，确保全面完整的评定发酵豆粕的品质。
小肽含量测定方法
2.2.2 小肽含量的测定
（1）原理
三氯乙酸（TCA）可以去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀。
余下的蛋白为低分子量的小肽类物质和氨基酸。
（2）测定方法
将待测样品0.5g，加入10mL 的10%三氯乙酸（TCA），160 r/min振荡30 min，而后4000 r/min离心15 min，取上清液做适当稀释后用Folin-酚法测定蛋白质总量。
2.2.3 Folin-酚法（lorry法）测定蛋白质总量
（1）原理
蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色。
在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比。
（2）试剂
甲液：A、B液的混合物，A液50份，B液1份。
A液为10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25 g酒石酸钾钠，定容到500 mL；B液为0.5 g CuSO4定容到100 mL。
乙液：Folin-酚试剂。
（3）测定方法
标准曲线的制作：在分析天平上精确称取0.0250 g结晶牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶中，配成250 μg/mL的牛血清白蛋白溶液。
按一定的比例配成蛋白质含量为0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，总体积为1 mL的溶液。
各加入5 mL甲试剂，混合后室温下放置10 min，再各加入0.5 mL乙液，立即混匀。
30 min后，以不含蛋白质的溶液做对照，在650 nm处测定各溶液的吸光度，做出标准曲线。
样品的测定：同标准曲线。
发酵豆粕质量评价方法
发酵豆粕质量评价方法豆粕发酵通常采用固体发酵法，由于传统意义上的固体发酵较粗放，从而容易导致产品的不均匀，产品外观的观测也是判断产品优劣的基本条件，对发酵豆粕的评判，主要可通过以下几方面进行评价。
1.感官评判优质发酵豆粕的产品粒度均匀，色泽一致，较原豆粕略深（产品粒度越细，颜色越浅），有淡淡发酵香味，无豆腥味，且因同一批次的产品加工条件和原料较一致，产品感官的一致性可反映出其生产工艺的稳定性。
2.抗腐败能力好的发酵豆粕在整个发酵生产过程的卫生状况非常好，但如果发酵过程中没有做好消毒卫生工作，染菌情况会非常严重。
判断是否染菌可用清水浸泡，优质的发酵豆粕在25℃环境中，1周内不会变味，气味依然芬芳；而染菌不良者，同样条件，2天就会发臭冒泡。
3.粗蛋白质发酵豆粕的粗蛋白质含量达到50%，是由于去除了不良寡糖和降低了水分浓缩而成的，发酵程度越好，粗蛋白质含量越高。
以46%的豆粕为原料来发酵的话，发酵豆粕成品的粗蛋白质含量一般为48%－51%。
粗蛋白质含量也不是越高越好，发酵豆粕成品的粗蛋白质超过51%的话，一来有掺假的嫌疑，二来发酵损耗过大，得率不高。
3.小肽（酸溶蛋白）可间接地反映地反映发酵豆粕抗原的降解情况。
发酵豆粕的小肽含量大概在8%－12%左右（相对于所含蛋白质的比例），发酵程度越好，小肽含量越高，但如果小肽含量超过15%，则产品粘度过高，干燥困难。
4.酸度（以乳酸计）反映发酵情况。
酸度应大于2%，过低则可能发酵程度不足或发酵控制不当而产氨。
5.氢氧化钾蛋白质溶解度(PS)反映大豆粕产品加热过度的情况。
发酵豆粕是豆粕的二次加工产品，选择合适的烘干工艺可有效防止产品蛋白溶解度的降低，保证产品的营养品质，一般应为65－85%。
蛋白溶解度低于65%几乎可以肯定豆粕加热过度，营养价值已受到破坏，大于85%则表示加热不足，豆粕的一些抗营养因子还未完全失去活性，降低了豆粕的品质。
6.挥发性盐基氮（VBN)反映发酵豆粕非蛋白氮添加情况和杂菌污染情况。
响应面优化三氯乙酸沉淀测定豆酱游离氨基酸中蛋白质
响应面优化三氯乙酸沉淀测定豆酱游离氨基酸中蛋白质张苗;武俊瑞;代金月;邱小玉;岳喜庆【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2013(034)010【摘要】采用三氯乙酸(TCA)沉淀法结合双缩脲比色法除去并测定蛋白质,探讨TCA质量浓度、沉淀温度、离心转数对蛋白质沉淀效果的影响,并采用Box-Behnken试验设计建立数学模型,进行响应面分析优化,确定最佳沉淀蛋白质条件.结果表明:TCA质量浓度8.3g/100mL、沉淀温度47℃、离心转数1726r/min时蛋白质沉淀效果量佳,蛋白质沉淀量为23.29g/100g,对游离氨基酸含量测定影响最小.【总页数】5页(P16-20)【作者】张苗;武俊瑞;代金月;邱小玉;岳喜庆【作者单位】沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866【正文语种】中文【中图分类】TS207.2【相关文献】1.三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法在液态奶蛋白质检测中适用性研究 [J], 牛巍;侯彩云;祝晓芳;刘莹2.甲醛-三氯乙酸沉淀-凯氏定氮法测定牛奶中真蛋白质 [J], 徐纬;聂四平;李军;胡勇;杨顺远3.维药制剂药渣中蛋白质及游离氨基酸的含量测定 [J], 张凤雪;文娥;李柯翱;季志红;田树革4.响应面法优化郫县豆瓣游离氨基酸的提取工艺及呈味特性分析 [J], 林洪斌; 方佳兴; 毕小朋; 于筱雨; 何强; 刘平; 丁文武; 车振明5.超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法测定梅花鹿茸中总游离氨基酸与游离氨基酸含量 [J], 臧彬如;周改莲;单国顺;贾天柱;孟莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
QBHHS JC006-2013 发酵豆粕中小肽的检测办法(三氯乙酸法)
1原理利用三氯乙酸作蛋白质沉淀剂，将发酵大豆蛋白中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。
本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/T 2653-2004)基础上修订而来。
2试剂及仪器2.1100ml 烧杯；2.210ml，50ml 移液管；2.3干过滤装置；2.4半微量法或全量法粗蛋白质测定的试剂和装置；2.515％三氯乙酸溶液；2.64000r/min 的离心机。
3操作步骤准确称取样品6g 于100mL 烧杯中，准确加入15%三氯乙酸溶液50mL，混合均匀，静置5min，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000r/min 下离心10min，准确移取其上清液10mL 于消化管中，按半微量法（消化后定容至100mL，准确移取其中10mL 进行蒸馏）或全量法粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。
同时做空白试验、测定样品的粗蛋白质的含量。
4结果与计算小肽%（半微量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×10×5÷m×100%÷cp×100%小肽%（全量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×5÷m×100%÷cp×100%式中：V1-----------------馏出液消耗盐酸标准液的体积，ml；V0-----------------空白试验消耗盐酸标准液的体积，ml；检测技术规范与标准方法编号：QB/HHS JC006-2013修订：第1版第1次修改发酵豆粕中小肽的测定方法（三氯乙酸法）起草：赵丽霞审核：刘永垒批准：执行日期：2013年6月15日C------------------盐酸的摩尔浓度，mol/l；6.25×0.014--------蛋白质转换系数；m-----------------称取样品质量，ｇ；cp-----------------样品的粗蛋白质含量，%。
QBHHS JC003-2013 发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法
8%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 10mL 15mL 20mL 3.3 5.0 6.7 2.7 4.0 5.3 3.8 5.7 7.6 0.1 0.15 0.2 0.1 0.15 0.2 0.006 0.009 0.012
30mL 10.0 8.0 11.4 0.3 0.3 0.018
50mL 16.7 13.3 19.0 0.5 0.5 0.03
表9
30 6.0 12.0 11.4 0.3 0.3 0.012
50 10.0 20.0 19.0 0.5 0.5 0.02
15%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 试剂名称 5 10 15 20 30 蒸馏水 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 30%Acr-Bis(29:1) 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 1M Tris,pH8.8 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 10%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加 10%SDS 即可配制成非变性 PAGE 胶。
7
附录 SDS-PAGE 分离胶浓度的最佳分离范围 不同样品的检测，需根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同分离胶浓度的最
7.1
佳分离范围如表 5 所示。 表5 SDS-PAGE 分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶 分离胶浓度与最佳分离范围对照表 最佳分离范围 备注 50-150kD 分子生物学中，kD 表示分子量 的单位道尔顿， 一般写的是 Da， 30-90kD kDa 就是 1000Da。 20-80kD 12-60kD 10-40kD
QBHHS JC002-2013 发酵豆粕中不良寡糖的定性检测方法
1方法薄板层析法（TLC）。
2原理利用不同大小的糖分子在硅胶薄板上的扩散速度的大小不同，将发酵豆粕中的寡糖分开。
3仪器及试剂3.1硅胶板：10*10cm；3.2层析缸（可供放置硅胶板）与硅胶板配套；3.3烘箱；3.4移液枪(10μl)以及其配套枪头；3.5高速离心机；3.6250ml 具塞锥形瓶；3.7乙醇（分析纯）3.8正丙醇（分析纯）3.9乙酸（分析纯）3.10α-萘酚（分析纯）3.11正磷酸（分析纯）4试剂的配制4.1展开液：正丙醇：乙酸：水＝1:1:0.1(V/V/V)4.2显色液：α-萘酚1ml 正磷酸10ml 乙醇989ml 共1000ml5实验方法及步骤检测技术规范与标准方法编号：QB/HHS JC002-2013修订：第1版第1次修改发酵豆粕中不良寡糖的定性检测方法起草：赵丽霞审核：刘永垒批准：执行日期：2013年06月15日5.1寡糖标样：用豆粕代替。
5.2样品的预处理准确称取发酵豆粕样品5.0g于250mL三角瓶中，加入50.0mL80％的乙醇溶液，70℃水浴浸提1h。
取2mL浸提液，10000r/min离心10min，4℃保藏备用。
5.3样品的测定在预制硅胶板上点样，点样量为5μL，点样干燥后在展开液中展开，展开至离硅胶板前沿2cm处。
自然晾干后，喷淋显色液，在140℃下烘5min显色。
6结果判定对比硅胶层析板上，样品和标样的条带，直接判读发酵豆粕中寡糖的降解情况。
不同发酵豆粕样品的TLC图谱6.1样品中寡糖的定性检测结果：1-4号：++++5-6号：+++7号：—8号：++6.2定性判定标准如下：++++：完全没有降解；(图谱斑点与豆粕相同，表现为三个斑点)+++：基本没有降解；(除了豆粕中的三个斑点外，蔗糖上方还多了一个单糖)++：降解不完全；(与豆粕相同有三个斑点，但亮度较暗，如8号样品)+：基本降解；(对应豆粕中的三个样品亮度较暗或很浅)—：完全降解；(图谱上无斑点，表现为图谱中非常干净)。
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1原理
利用三氯乙酸作蛋白质沉淀剂，将发酵大豆蛋白中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。
本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/T 2653-2004)基础上修订而来。
2
试剂及仪器2.1
100ml 烧杯；2.2
10ml，50ml 移液管；2.3
干过滤装置；2.4
半微量法或全量法粗蛋白质测定的试剂和装置；2.5
15％三氯乙酸溶液；2.64000r/min 的离心机。
3操作步骤
准确称取样品6g 于100mL 烧杯中，准确加入15%三氯乙酸溶液50mL，混合均匀，静置5min，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000r/min 下离心10min，准确移取其上清液10mL 于消化管中，按半微量法（消化后定容至100mL，准确移取其中10mL 进行蒸馏）或全量法粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。
同时做空白试验、测定样品的粗蛋白质的含量。
4结果与计算
小肽%（半微量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×10×5÷m×100%÷cp×100%
小肽%（全量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×5÷m×100%÷cp×100%
式中：
V1-----------------馏出液消耗盐酸标准液的体积，ml；V0-----------------空白试验消耗盐酸标准液的体积，ml；检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC006-2013修订：第1版第1次修改发酵豆粕中小肽的测定方法
（三氯乙酸法）起草：赵丽霞审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日
C------------------盐酸的摩尔浓度，mol/l；
6.25×0.014--------蛋白质转换系数；
m-----------------称取样品质量，ｇ；
cp-----------------样品的粗蛋白质含量，%。
5重复性
5.1每个试样的两个平行样间允许相对偏差为其算术平均值的10%，以其算术平均值上报结果；
5.2所得的结果是指小肽占粗蛋白质的百分含量。
6备注
因其中含有无机氮，测得结果应减去无机氮。