QBHHS JC003-2013 发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法

8%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 10mL 15mL 20mL 3.3 5.0 6.7 2.7 4.0 5.3 3.8 5.7 7.6 0.1 0.15 0.2 0.1 0.15 0.2 0.0060.0 8.0 11.4 0.3 0.3 0.018
50mL 16.7 13.3 19.0 0.5 0.5 0.03
6 6.1
结果判定 如右图所示： α、α 、β是未发酵豆粕中大豆抗原蛋白 7S 的三个亚
，
基， A1、A2、A3、A4、Basic 是未发酵豆粕中大豆抗原蛋白 11S 的五个亚基。 各亚基占大豆抗原蛋白总量的比例（表 3） 抗原 蛋白 7S 亚基 α α
，
在大豆抗原蛋白总量 中所占比例 5% 5% 17% 3% 34% 34%
β-巯基乙醇 1mL，0.5mL 1%溴酚蓝，可在 4℃存放数周，或在-20℃保存数月。 4.3.7 电泳缓冲液（1L） ：3.0g Tris 碱，14.4g 甘氨酸（电泳级） ，SDS1.0g，加蒸馏水至 1L， 4
℃冰箱保存。 4.3.8 4.3.9 固定液(1000mL)：甲醇 450ml，冰乙酸，100ml，蒸馏水 450ml 考马斯亮蓝染色液：1.0g 考马斯亮蓝 R-250，450mL 甲醇，100mL 冰醋酸，450mL 蒸馏水

表1 试剂名称 30%丙烯酰胺溶液 Tris-Hcl pH8.8 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 蒸馏水 合计
分离胶配制各成分体积 备注 TEMED 催化过硫酸铵产生自由 基， 加速丙烯酰胺凝胶的聚合， 制胶过程中最后添加。
含量/mL 12 11.4 0.3 0.3 0.012 6.0 30

7
附录 SDS-PAGE 分离胶浓度的最佳分离范围 不同样品的检测，需根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，不同分离胶浓度的最
7.1
佳分离范围如表 5 所示。 表5 SDS-PAGE 分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶 分离胶浓度与最佳分离范围对照表 最佳分离范围 备注 50-150kD 分子生物学中，kD 表示分子量 的单位道尔顿， 一般写的是 Da， 30-90kD kDa 就是 1000Da。 20-80kD 12-60kD 10-40kD
共配制 30mL 分离胶胶液，适合本实验室双垂直电泳槽两板胶用量。 5.2 浓缩胶的配制： 分子生物学中常用的浓缩胶浓度为 5%。 按照表 2 配制 SDS-PAGE 的浓缩胶(也称堆积胶、 积层 胶或上层胶)： 表2 试剂名称 30%丙烯酰胺溶液 Tris-Hcl pH6.6 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 蒸馏水 合计 5.3 SDS-PAGE 凝胶制备： 将洁净的玻璃片固定于电泳槽，防止分离胶漏胶情况发生。将洁净的玻璃片置于制胶支架上 （缺口朝里） ，放平、齐，压紧，将配好的 12%分离胶，用 1ml 枪头从矮口的一侧缓慢加入，操作 的过程中，禁止有气泡的生成，离矮面玻璃边缘 4cm 处（预留出梳子空间） ，用医用注射器吸取 无水乙醇，缓慢注入分离胶上，此时可以明显看出分离胶与无水乙醇的分层线，切不可过分晃动 胶板，防止乙醇进入分离胶内部，阻碍其凝结。待分离胶凝固后，倒出乙醇，并用滤纸轻轻吸干 乙醇，用同样的方法继续注入 5%浓缩胶，注满后插入进样梳，待其完全凝结，后拔掉进样梳， 备 用。 注意：温度的升高可加速胶的凝结速度，但是过高的温度会造成胶的皱缩，一般控制其凝结 温度为 30℃左右。制胶后用电泳缓冲液浸泡至少 3h。 浓缩胶配制各成分体积 备注 TEMED 催化过硫酸铵产生自由 基， 加速丙烯酰胺凝胶的聚合， 制胶过程中最后添加。
棕色瓶中， 4℃保存 1 个月左右。 （注意： 未聚合的丙烯酰胺有神经毒性， 须在通风橱内小心操作） 。 4.3.2 分离胶缓冲液（ 1.5mol/L Tris-HCl ，pH8.8） ： 18.15gTris， 加入约 80mL 重蒸水， 用 1mol/L
的 HCl 调 pH 到 8.8，用重蒸水定容至最终体积 100mL，4℃冰箱保存备用。 4.3.3 浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8） ：6gTris，加入约 60mL 重蒸水，用 1mol/L
50 5.0 25.0 19.0 0.5 0.5 0.02
7.3
不同体积的浓缩胶胶溶液配制(5%) 试剂名称 2mL 1.4 0.33 0.25 0.02 0.02 0.002 3mL 2.1 0.5 0.38 0.03 0.03 0.003 含量/mL 4mL 6mL 2.7 4.1 0.67 1.0 0.5 0.75 0.04 0.06 0.04 0.06 0.004 0.006 8mL 5.5 1.3 1.0 0.08 0.08 0.008 10mL 6.8 1.7 1.25 0.1 0.1 0.01
6%分离胶不同体积各成分含量详表 10 4.0 2.0 3.8 0.1 0.1 0.008 含量/mL 15 20 6.0 8.0 3.0 4.0 5.7 7.6 0.15 0.2 0.15 0.2 0.012 0.016 30 12.0 6.0 11.4 0.3 0.3 0.024 50 20.0 10.0 19.0 0.5 0.5 0.04

5.4
上样及电泳： 以 10μl 微量移液器上样 20μl。电泳条件主要采用稳压的方式：浓缩胶的电压 80V，电泳
时间至蓝色条带刚进入分离胶（整齐蓝线出现） 。分离胶的电压 120V，电泳时间 4~5 h（蓝色条 带接近分离胶末端） 。 5.5 染色、脱色： 结束电泳后，撤下胶板，切去浓缩胶，小心揭下凝胶，37℃以上，固定液漂洗 20min，放入 适量新鲜染色液染色 45 min。 倾去染色液， 用自来水漂洗直到水流无颜色， 倒入适量脱色液脱色， 每隔 2h 换一次脱色液，直至蛋白亚基条带清晰为止。
的 HCl 调 pH 到 6.8，用重蒸水定容至最终体积 100mL，4℃冰箱保存备用。 4.3.4 4.3.5 4.3.6 10% 过硫酸铵： 0.5g 过硫酸铵， 加 5mL 蒸馏水，新鲜配置，-20℃保存一个月左右。 10%（w/v）SDS：10g SDS 加蒸馏水 100mL，室温保存。 2×上样缓冲液（10mL） ：2.5mL 0.5mol/L Tris-HCL (pH6.8)，2mL 甘油，4mL 10% SDS，
定容至 1000mL。 4.3.10 4.3.11 考马斯亮蓝脱色液：100mL 甲醇，100mL 冰醋酸，800mL 蒸馏水。 提取液：取 3.63gTris，加 1000ml 水溶解，加 0.7mlβ-巯基乙醇，用盐酸调 pH 至 8.0。
5 5.1
实验方法与步骤 分离胶的配制： 根据蛋白质分子量的大小，选择分离胶浓度 12%的凝胶最为合适，配制方法见下表 1：
含量/mL 1.66 1.26 0.1 0.1 0.01 6.8 10
共配制 10mL 分离胶胶液，适合本实验室双垂直电泳槽两板胶用量。
5.3
样品的制备： 取发酵豆粕 1.0g，加入 20.00ml 提取液在室温下浸泡 1 小时后（每 10 分钟搅拌一次） ，离心
20 分钟，取上清液 40μl，加入 40μl 2×上样缓冲液，沸水浴 3 分钟后，进行 SDS-PAGE 电泳。
β A3 11S A1、A2、A4 Basic
6.2 对比豆粕的抗原条带上，直接判读发酵豆粕中抗原蛋白 的降解情况。
定性判定标准如下： （表 4） 判定结果 — 基本标准 完全没有降解 基本没有降解 降解不完全 基本降解 完全降解 解释 图谱斑点与豆粕几乎相同 与豆粕中的五个斑点相同，颜色稍暗 与豆粕相同有五个斑点，和 段个别斑 点很暗 对应豆粕中的五个样品亮度较暗或很浅 图谱上无斑点，表现为图谱中非常干净 20%左右 40%左右 60%左右 80%左右 90%以上 估算大豆抗原蛋白 总量降解比例
7.2
不同浓度的分离胶溶液配制：
表6 试剂名称 蒸馏水 30%Acr-Bis(29:1) 1M Tris, pH8.8 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 5 2.0 1.0 1.9 0.05 0.05 0.004 表7 试剂名称 蒸馏水 30%Acr-Bis(29:1) 1M Tris,pH8.8 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 5mL 1.7 1.3 1.9 0.05 0.05 0.003 表8
electrophoresis, SDS-PAGE)的主要用途是分离蛋白质和测定其亚基的分子质量。SDS-聚丙烯酰 胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。在电泳的过程中，能根据蛋白质亚基分子量的不同而逐渐 呈梯度分开蛋白质。
3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
仪器 DYCZ-24EN 双垂直电泳仪（基本参数：外型尺寸（L×W×D） ：190×120×170mm； 凝胶板：规格(L×W)：130×100mm； 试样格：12 齿，1.0mm 厚； 电泳槽：能容纳 2Kg 缓冲液，总容量约 1200mL； DYY-8C 双稳定时电泳仪电源 （基本参数： 并联输出： 2 组； 输出范围 （显示分辨率） ： 5-600V(1V) 120W；外形尺寸（W×D×H） ：315×290×128 mm；重量：约 5Kg） ；
试剂名称 蒸馏水 30%Acr-Bis(29:1) 1M Tris,pH8.8 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED
10%分离胶不同体积各成分含量详表 含量/mL 5 10 15 20 1.3 2.7 4.0 5.3 1.7 3.3 5.0 6.7 1.9 3.8 5.7 7.6 0.05 0.1 0.15 0.2 0.05 0.1 0.15 0.2 0.002 0.004 0.006 0.008
检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC003-2013 修订：第 1 版 起草：赵丽霞 第 2 次修改 审核：刘永垒
发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法
批准： 执行日期：2013 年 06 月 15 日