蛋白质含量测定(凯氏定氮法)资料
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1一、实验原理蛋白质是生物体内重要的营养成分，因此测定样品中蛋白质含量是生物学领域中的一项基础性工作。
凯氏定氮法是测定蛋白质含量的一种常用方法。
由于蛋白质中氮元素的含量较高，因此凯氏定氮法以氮元素计算蛋白质含量，具有简便、准确、重现性好等特点，广泛应用于蛋白质含量的测定中。
该法的基本原理是：将待测样品中蛋白质水解后，将产生的氨基酸再通过氧化还原反应以生成气态氨，利用碱性铜离子氧化氨生成蓝色化合物，蓝色化合物的浓度与样品中氮的含量成正比，从而计算出样品中蛋白质的含量。
二、实验仪器和试剂1. 仪器：水浴器、移液器、分析天平。
2. 试剂：包括0.1mol/L NaOH、1% CuSO4、1% KNaC4H4O6、1% Na2SO4、 Na2CO3和测定氯离子的盐酸铵铁Ⅲ溶液等。
三、实验步骤1. 准备样品：首先将待测样品去除水分，将10mg的样品放入烘箱中加热到60℃，持续4h使其干燥。
取出后冷却，称取约10mg-20mg样品，转移到干净、干燥的燃烧器中。
2. 水解：加入3ml的6mol/L HCl，进行加热水解。
将燃烧器放到水浴器中，加入适量的水，然后用酒精灯或燃气灯加热至沸腾。
持续水解1h，注意不要使燃烧器干燥，需要时加入适量的水。
3. 去除氨：过滤水解液，将滤液倒入容量瓶中，并加入足量的NaOH溶液，使pH值达到9-10。
再加入10ml的Na2SO4溶液，混匀。
然后将瓶口拔开，将瓶口放在水浴器中并加入适量的NaOH溶液，使瓶内的氨气完全挥发，待液面稳定后用盖子盖好。
4. 确定还原态铜离子的数量：取一定量的0.1mol/L NaOH溶液，加入CuSO4和KNaC4H4O6，混匀后加入约1g的Na2CO3，加水定容，制成标准CuSO4溶液。
5. 滴定：取出约5ml水解液，放入锥形瓶中加清水至刻度线，加入50μl的盐酸铵铁Ⅲ溶液，混匀。
用标准CuSO4溶液滴定至液体颜色由黄变蓝。
蛋白质制备及含量测定（凯氏定氮法）分析
蛋⽩质制备及含量测定（凯⽒定氮法）分析实验六蛋⽩质制备及含量测定——微量凯⽒（Mirco-Kjeldahl）定氮法⼀、实验⽬的要求1、了解蛋⽩质提取的⼀般⽅法和原理2、了解蛋⽩质含量测定的常⽤⽅法3、学习微量凯⽒定氮法的原理4、掌握微量凯⽒定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋⽩质含量的换算等。
⼆、实验原理1、蛋⽩质的提取与制备蛋⽩质的提取与制备⽅法与⽣物材料的类型及蛋⽩质的存在部位有关。
如果是胞内蛋⽩，⾸先必须要进⾏细胞破碎。
细胞破碎的⽅法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋⽩，可以根据相应蛋⽩质的性质进⾏提取分离纯化。
如果待提取的蛋⽩质是具有⽣物活性的蛋⽩质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防⽌蛋⽩质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋⽩质含量测定蛋⽩质含量测定的⽅法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染⾊法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯⽒定氮法等。
3、凯⽒定氮⽣物材料的含氮量测定在⽣物化学研究中具有⼀定的意义，如蛋⽩质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋⽩含量。
⽣物材料总氮量的测定，通常采⽤微量凯⽒定氮法。
凯⽒定氮法由于具有测定准确度⾼，可测定各种不同形态样品等两⼤优点，因⽽被公认为是测定⾷品、饲料、种⼦、⽣物制品、药品中蛋⽩质含量的标准分析⽅法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为⽆机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提⾼硫酸沸点。
这⼀步约需2～3h，视样品的性质⽽定。
天然的含氮有机物（如蛋⽩质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢⼆元素被氧化成⼆氧化碳和⽔；蛋⽩质分解，⽽有机氮则变成氨（⽆机氮），并进⼀步与硫酸作⽤⽣成硫酸铵。
此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进⾏得⽐较缓慢，通常需要加⼊硫酸钾或硫酸钠以提⾼反应的沸点，并加⼊硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进⾏。
蛋白质含量测定微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
５ ． 试样准备
５．１ 样液：ｌｇ卵清蛋白溶于９ｍｇ ｍＬ－１的ＮａＣｌ液 并稀释至ｌ００ｍＬ 如有不溶物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ离心取上清液
备用 ５．２ 硫酸钾 硫酸铜 ３ １ ｗ ｗ 混匀研成粉末 ５．３ ３０ｍｇ ｍＬ－１氢氧化钠溶液 ３ＯｇＮａＯＨ溶于蒸馏水 释至ｌ００ｍＬ ５．４ ２０ｍｇ ｍＬ－１硼酸溶液 ２ｇ硼酸溶于蒸馏水 释至１Ｏ０ｍＬ 混合指示剂 １ｍｇ ｍＬ－１的甲基红酒精溶液和１ｍｇ ｍＬ－１的甲烯蓝酒精溶液按４ ｌ比例 ｖ ｖ 混合 本指示剂在ｐＨ５．２时为紫红色 ｐＨ４．５时为暗蓝 或灰色 色 ｐＨ５．６时为绿色 变色点 ｐＩ为５．４ ５．６ ０．０１ｍｏｌ Ｌ－１标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释
２．２．２ 直接法 用硼酸作为氨的吸收溶液 结果使溶液中［Ｈ ］降低 混合指示剂 ＰＨ４．３ ５． ０ 由黑紫色变为绿色 再用标准酸来滴定 使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止 指示剂 出现淡紫色为终点 此时所耗的盐酸量即为氨的量
ＮＨ２ Ｈ３Ｂ０４ ＮＨ４Ｈ２Ｂ０４ ＮＨ４Ｈ２Ｂ０４ ＨＣｌ ＮＨ４Ｃｌ Ｈ３Ｂ０４
ＮＨ４０Ｈ ＮＨ Ｈ Ｏ
ＮＨ３ ＨＣｌ ＮＨ４Ｃｌ
中和程度用滴定法来判断 分回滴法和直接法两种
２．２．１ 回滴法 用过量的标准酸吸收氨 其剩余的酸可用标准ＮａＯＨ滴定 由盐酸量减去滴定 所耗ＮａＯＨ的量即为被吸收的氨之量 此法采用甲基红作指示剂
ＹＹＳＷＤＢ００９２蛋白质含量测定微量凯氏定氮法
YY-SW-DB-0092
蛋白质 含量测定 微量凯氏（ Ｋ ｊ ｅ ｌ ｄ ａ ｈ ｌ ） 定氮法
１． 范围
本方法采用微量凯氏（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）定氮法测定蛋白质的含量 本方法适用于各类蛋白质 测定范围０．２毫克 ２．０毫克的氮
蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一.目标与请求1.进修凯氏定氮法测定蛋白质的道理.2.控制凯氏定氮法的操纵技巧,包含样品的消化处理.蒸馏.滴定及蛋白质含量盘算等.二.试验道理蛋白质是含氮的化合物.食物与浓硫酸和催化剂配合加热消化,使蛋白质分化,产生的氨与硫酸联合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸接收后,再用盐酸尺度溶液滴定,依据酸的消费量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量.因为食物中除蛋白质外,还含有其它含氮物资,所以此蛋白质称为粗蛋白.三.仪器与试剂硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为 1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）氢氧化钠溶液（400g/L） 0.01mol/L盐酸尺度滴定溶液.混杂指导试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份,与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混杂.微量定氮蒸馏装配：如图3- 所示.图3- 微量凯氏定氮装配1.电炉;2.水蒸气产生器（2L平底烧瓶）;3.螺旋夹a;4.小漏斗及棒状玻璃塞（样品进口处）;5.反响室;6.反响室外层;7.橡皮管及螺旋夹b;8.冷凝管;9.蒸馏液接收瓶.四.试验步调1.样品消化称取样品约2.00g（±0.001g）,移入湿润的100mL凯氏烧瓶中,参加0.2g硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,参加20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,应用万用电炉,在通风橱中加热消化,开端时用低温加热,待内容物全体炭化,泡沫停滞后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,持续加热0.5h,取下放冷,当心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液.试剂空白试验：取与样品消化雷同的硫酸铜.硫酸钾.浓硫酸,按以上同样办法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液.2.定氮装配的检讨与洗涤检讨微量定氮装配是否装好.在蒸气产生瓶内装水约三分之二,加甲基红指导剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,参加数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸.测定前定氮装配如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反响管三分之一体积）通入蒸汽煮沸,产生的蒸汽冲洗冷凝管,数分钟后封闭夹子a,使反响管中的废液倒吸流到反响室外层,打开夹子b由橡皮管排出,如斯数次,即可应用.3.碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中,参加混杂指导剂2~3滴,并使冷凝管的下端拔出硼酸液面下,在螺旋夹a封闭,螺旋夹b开启的状况下,精确汲取10.0mL样品消化液,由小漏斗流入反响室,并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反响室,棒状玻塞塞紧.使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其徐徐流入反响室,用少量水冲洗立刻将玻塞盖坚,并加水于小玻杯以防漏气,开启螺旋夹a,封闭螺旋夹b,开端蒸馏.通入蒸汽蒸腾10min后,移动接收瓶,液面分开凝管下端,再蒸馏2min.然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下三角瓶,预备滴定.同时汲取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操纵.4.样品滴定以0.01mol/L盐酸尺度溶液滴定至灰色为终点.5.数据记载五.成果盘算式中 X——样品蛋白质含量（g/100g）;V1——样品滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;V2——空白滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;c——盐酸尺度滴定溶液浓度（mol/L）;0.0140 ——][Lmolc 尺度滴定溶液相当的氮的质HCl()000/.1量（g）;m——样品的质量（g）;F——氮换算为蛋白质的系数,一般食物为 6.25;乳成品为6.38;面粉为5.70;高梁为 6.24;花生为 5.46;米为5.95;大豆及其成品为5.71;肉与肉成品为6.25;大麦.小米.燕麦.裸麦为 5.83;芝麻.向日葵5.30.盘算成果保存三位有用数字.六.留意事项及解释1.本法也实用于半固体试样以及液体样品检测.半固体试样一般取样规模为2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）.若检测液体样品,成果以g/100mL暗示.2.消化时,若样品含糖高或含脂及较多时,留意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损掉.可参加少量辛醇或液体白腊,或硅消泡剂削减泡沫产生.3.消化时应留意扭转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品完整消化.若样品不轻易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,参加数滴过氧化氢后,再持续加热消化至完整.4.硼酸接收液的温度不该超出40℃,不然氨接收削弱,造成检测成果偏低.可把接收瓶置于冷水浴中.5.在反复性前提下获得两次自力测定成果的绝对差值不得超出算术平均值的10%。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量【凯氏定氮法测定蛋白质含量】引言：蛋白质是生物体中非常重要的一类有机物质，它在细胞结构、代谢调节、酶催化等方面都起到至关重要的作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于研究生物体的生理功能和代谢过程十分重要。
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它利用蛋白质中的氮元素与含氮化合物反应，通过测定反应生成物中的氨基氮含量来确定蛋白质的含量。
本文将一步一步地介绍凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理、实验步骤以及注意事项。
一、原理：凯氏定氮法的原理基于蛋白质是含有较高比例的氮元素的化合物。
测定蛋白质的含量可以通过测定样品中氨基氮的含量来实现，其中氨基氮与蛋白质的含量呈线性关系。
凯氏定氮法的核心步骤是将蛋白质样品与含有氧化剂的酸溶液一起加热，使蛋白质中的氮元素被氧化转化为氨基氮，然后用氨盐指示剂反应形成带有颜色的化合物，最后通过比色分析来测定蛋白质中氮元素的含量。
二、实验步骤：1. 实验前准备：根据实验需求准备蛋白质样品、凯氏试剂、氨盐指示剂等。
2. 样品制备：将蛋白质样品称取适量，加入酸性溶液中溶解，使其完全溶解。
注意保持溶液的酸性，并避免样品中的氨基酸被过度氧化。
3. 氮元素的氧化：将样品溶液与凯氏试剂混合，在适当的温度下加热，使样品中的氮元素被氧化转化为氨基氮。
反应时间根据样品的性质而定，一般为1-2小时。
4. 反应结束：冷却样品溶液，使其达到室温。
反应结束后，样品中的蛋白质会被转化为氨基氮。
5. 比色分析：将反应溶液与氨盐指示剂进行反应，形成带有颜色的化合物。
然后使用分光光度计测定化合物的吸光值。
通过与标准曲线进行比较，可以确定样品中氨基氮的含量，进而计算出蛋白质的含量。
三、注意事项：1. 样品的选择：样品的选择取决于实验的目的，可以是纯蛋白质样品，也可以是含有蛋白质的复杂混合物。
样品的含量和浓度应该适当，以保证实验结果的准确性。
2. 温度和时间的控制：样品与凯氏试剂的加热温度一般为75-105摄氏度，反应时间根据样品的性质而定。
蛋白质测定-凯氏定氮法
精品课件
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消 化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
精品Байду номын сангаас件
凯氏定氮蒸馏装置
传统装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
精品课件
水蒸气发生器： 装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇
指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色（保持酸性 以防水中氨的逸出）→按上图所示搭好装置
精品课件
凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的 测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉 以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为 粗蛋白质含量。
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
实验 奶粉中蛋白质的测定
——凯氏定氮法
精品课件
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量 接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份氮 相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意： 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，由凯氏于1883
年提出。
它的原理是：将样品中的蛋白质氨基酸氧化分解为氨态水，
测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量。
2 凯氏定氮法的基本原理
凯氏定氮法的基本原理是将蛋白质氨基酸浓度通过离子交换树脂
提取，然后将氨基酸氧化分解为氨态水，再测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量，凯氏定氮法公式如下：
3 凯氏定氮法公式
蛋白质的实际含量=样品内的氨态氮的总量（毫克）÷6.25
其中6.25是认为蛋白质中的结构基元氨基酸的比例为1:6.25，也就是说，100毫克蛋白质中含有16毫克氨基酸，以此类推。
4 凯氏定氮法的优势
凯氏定氮法具有准确、快速、重现性好等特点，在实时测定立即
分析模式中，仍是最常用的技术。
从实验时间上看，凯氏定氮法比其
他定氮方式更加快捷，且准确率较高，受其实验程序简单、复杂材料
分离容易使用的优势受到广大研究人员的青睐。
5 凯氏定氮法的应用
凯氏定氮法大多用于测定含氨基酸的蛋白质，应用范围很广，一般应用在动物、植物的分子的氨基酸的分析，主要用于衡量蛋白质含量，便于计算组分，如果其他物质也能被氧化，也可以用它进行测定计算。
另外，凯氏定氮法也可以用于研究病毒、细菌等非蛋白质有机物的含氮量。
蛋白质测定-凯氏定氮法
在蒸馏过程中，要确保冷凝器 工作正常，以免造成氨气泄漏
。
在滴定过程中，要控制好滴定 速度，避免过快或过慢，影响
测定结果的准确性。
实验环境要求与维护
实验室应保持整洁、干燥、通风良好。
实验器具应妥善保管，避免损坏和污 染。
实验台面应定期清洁，保持无尘状态。
实验室的电源和加热设备应定期检查 和维护，确保安全可靠。
体积误差、氮换算系数误差等。
误差传递
02
根据误差来源，评估其对最终结果的影响程度，并计算误差传
递系数。
结果可靠性评估
03
根据误差传递结果，对测定结果的可靠性进行评估，判断是否
需要重新进行实验或采取其他措施来减小误差。
05
注意事项与安全
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中 进行，以避免吸入有害 气体。
结果计算
根据实验数据，计算样品 中的蛋白质含量。
误差分析
对实验结果进行误差分析， 确保测定结果的准确性和 可靠性。
04
结果分析与解读
数据记录与整理
实验数据
在实验过程中，需要准确记录每 个步骤中的数据，包括样品质量 、滴定体积、空白实验滴定体积 等。
数据整理
将实验数据整理成表格，列出每 个样品的各个测量值，以便后续 计算和分析。
限制
由于凯氏定氮法操作繁琐、耗时长、试剂消耗量大等缺点，对于一些低蛋白质含量的样 品或者特殊样品（如含有大量非蛋白质氮的样品），该方法可能不太适用。同时，凯氏 定氮法测定的结果受样品处理和操作过程的影响较大，需要严格控制实验条件和操作步
骤。
02
实验材料与设备
实验材料
硫酸铜
用于样品消化，提 供催化剂。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量摘要：凯氏定氮法被广泛应用于测定蛋白质含量。
本文主要介绍凯氏定氮法的原理、步骤和应用，并对该方法的优缺点进行了分析和讨论。
结果表明，凯氏定氮法具有简便、灵敏度高、重现性好等优点，适用于各种样品的蛋白质含量测定。
关键词：凯氏定氮法，蛋白质含量，测定方法，优缺点引言：蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，对于了解生物过程、疾病诊断和治疗等方面具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于科学研究和医学实践具有重要意义。
目前，常用的蛋白质测定方法包括比色法、光谱法、生物学活性法和凯氏定氮法等。
其中，凯氏定氮法因其简便、灵敏度高、重现性好等优点而被广泛应用。
一、凯氏定氮法的原理凯氏定氮法是基于蛋白质中含有氮元素这一特点进行测定的。
该方法的原理是将样品中的蛋白质完全燃烧后，收集生成的氮气，并用浓碱溶液吸收氮气生成氨水。
然后使用酸滴定法测定可滴定酸的用量，从而间接计算出样品中蛋白质的含量。
二、凯氏定氮法的步骤凯氏定氮法的步骤主要包括样品的预处理、加热燃烧、氨水吸收和酸滴定等。
1. 样品的预处理：将待测样品称取适量，根据样品的特性选择适当的方法进行分解或加热处理，以使蛋白质完全释放出来。
2. 加热燃烧：将经过预处理的样品放入燃烧器中，加热到适当温度，使样品中的蛋白质完全燃烧产生氮气。
3. 氨水吸收：将生成的氮气通过吸收瓶中的浓碱溶液，生成氨水。
氨水的生成量与样品中蛋白质的含量成正比。
4. 酸滴定：用标准酸溶液滴定氨水中的可滴定酸，测定可滴定酸的用量，进而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的应用凯氏定氮法广泛应用于生物化学、食品科学、环境监测等领域的蛋白质含量测定。
其应用范围包括但不限于以下几个方面：1. 食品科学：凯氏定氮法可以用于测定食品中的蛋白质含量，包括肉类、豆类、谷物等。
2. 生物化学：凯氏定氮法可用于测定细胞培养基中蛋白质的含量，用于生物过程的研究和细胞培养的质量控制。
3. 环境监测：凯氏定氮法可用于测定水样中蛋白质的含量，用于环境污染的监测和评价。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量(一)方法原理样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。
在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备1. 仪器分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。
2. 试剂(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月。
(三) 操作步骤1. 样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。
将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
.凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种测定食物、饮料或饲料中蛋白质含量的经典方法。
这个实验方法需要使用浓硫酸和催化剂，将样品中的有机氮转化为氨，然后通过蒸馏将氨分离出来，最后用酸滴定液滴定，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的步骤如下：
1. 样品处理：将样品研磨并干燥，然后加入硫酸和催化剂，进行消化反应。
这个过程需要控制温度和时间，以免样品烧焦或硫酸过度氧化。
2. 蒸馏：将消化液进行蒸馏，使氨气从溶液中分离出来。
蒸馏过程中需要控制温度和压力，以确保氨气能够完全分离。
3. 滴定：将蒸馏后的溶液用酸滴定液进行滴定，根据颜色变化判断滴定终点。
终点判断需要准确控制，否则会影响测定结果。
4. 计算：根据滴定的酸滴定液的体积和浓度，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的优点是准确性高、可重复性好，可以用于测定各种食物、饮料和饲料中的蛋白质含量。
但是，该方法也存在一些缺点，例如需要使用浓硫酸和催化剂，操作比较危险，而且实验过程中会产生有害气体。
此外，凯氏定氮法测定的是样品中的总氮含量，而并非所有的氮都以蛋白质的形式存在。
因此，在某些情况下，可能需要采用其他方法来测定样品中的蛋白质含量。
总之，凯氏定氮法是一种经典的蛋白质测定方法，具有较高的准确性和可重复性。
但是，在操作过程中需要注意安全问题，并且需要控制好各个实验条件，以保证测定结果的准确性。
实验八植物样品蛋白质含量测定（微量凯氏定氮法）
实验八植物样品蛋白质含量测定（微量凯氏定氮法）一、目的：学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、原理：常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氨基酸等)的含氮量。
含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此过程通常称之为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。
甘氨酸的消化过程可表示如下：浓碱可使消化液中的硫酸按分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到—定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)计算出待测物中的总氮量。
三、器材：1. 100毫升凯氏烧瓶2. 凯氏定氮蒸馏装置。
3. 50毫升容量瓶。
4. 3毫升微量滴定管。
5. 分析天平。
6. 烘箱。
·7. 电炉。
8. 1000毫升蒸馏烷瓶。
9. 小玻璃珠。
四、试剂：1．化学纯浓硫酸200毫升2．粉末硫酸钾—硫酸铜混合物16克K2S04与CuS04·5H20以3：1配比研磨混合。
3．30％氢氧化钠溶液1000毫升4．2％硼酸溶液500毫升5．标准盐酸溶液(约0．01当量／升) 600毫升6．混合指示剂(田氏指示剂) 50毫升由50毫升0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200毫升0．1％甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。
这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。
变色范围很窄且灵敏。
7．植物组织干粉2克五、操作方法：1．凯氏定氮仪的构造和安装凯氏定氦仪由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成。
见图。
蒸气发生器包括电炉及一个1～2升容积的烧瓶(图中1，2)。
蒸气发生器借橡皮管(图中3)与反应管相连。
反应管上端有一个玻璃杯(图中4)，样品和碱液可由此加入到反应室(图中5)中，反应室中心有一长玻璃管，其上端通过反应室外层(图中6)与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。
蛋白质—凯氏定氮法
蛋白质—凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种常用的蛋白质测定方法，通过测定样品中氮的含量来间接确定蛋白质的含量。
该方法的原理是利用氮含量与蛋白质含量之间的定量关系来进行测定。
具体操作步骤如下：
1. 将待测样品溶解于一定体积的酸溶液中，通常选择硫酸和过氧化氢的混合溶液作为溶解剂。
这一步的目的是将样品中的有机氮完全转化为无机氮。
2. 在样品溶液中加入硫酸溴化钾溶液，将样品中的氮转化为含有共价键的二价氨离子（NH2-）。
3. 在碱性条件下，使用酚酸指示剂对溶液进行反应，这一步的目的是将二价氨离子氧化为氨气。
4. 将生成的氨气通过蒸馏装置析出，然后通过硼酸水溶液捕集氨气。
5. 最后，使用酚酞指示剂对硼酸溶液中的氨气进行滴定，从而确定氮的含量。
根据测定结果，可以通过一定的计算公式来计算出样品中蛋白质的含量。
凯氏定氮法操作简单、准确度高，是一种广泛应用于科学研究和食品工业的蛋白质测定方法。
蛋白质测定-凯氏定氮法
大火加热 保持瓶中液体微沸
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
仪2器、及蒸试馏剂、的吸准收备
仪器：
100mL 3只
试剂（混合指示剂）： 2份甲基红乙醇液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇液（1g/L）
临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈 灰色,在酸性溶液中呈红色。
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
④ 在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得 停火断汽,否则会发生倒吸。
⑤ 蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1分钟 ，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸 收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则 吸收液将发生倒吸。
⑥所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
3、盐酸滴定
接收瓶 以HCL标准滴定液滴定 灰色终点
注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生 物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物， 故称为粗pro。
【三、实验步骤】
1、消化
仪器及试剂的准备
仪器：
试剂
作用
硫酸铜 硫酸钾
a催化作用：加速有机物的氧化分解。 b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明； c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀
蛋白质的测定方法(剀氏定氮法)
蛋白质的测定方法（凯氏定氮法）一、原理有机物与硫酸共热，其中的氮转变为硫酸铵，然后测定氮量，然后乘以 6.25，即可得到有机物中粗蛋白含量。
二、试剂1.浓硫酸（98%、18mol/l）2.0.1N稀硫酸溶液：取浓硫酸（98%、18mol/l）2.8ml稀释，定容至1000ml。
3.40%氢氧化钠溶液4.0.1N标准氢氧化钠溶液：（1）配制：取氢氧化钠（分析纯）4克溶于蒸馏水中，定容至1000ml。
（2）标定：取配制的氢氧化钠溶液15ml、酚酞指示剂2-3滴，用0.1N的草酸溶液标定，至溶液变为无色时，记下耗用草酸溶液的量，换算成氢氧化钠的实际浓度，记录。
5．混合指示剂（亚甲基蓝+甲基红）：由2倍体积0.1%甲基红无水乙醇溶液与1倍体积0.1%亚甲基蓝水溶液混合而成。
（此指示剂碱性时呈绿色，中性时呈灰色，酸性时呈红色）。
6.混合催化剂：称取硫酸钾100克、硫酸铜10克、硒粉1克均匀混合后研细待用。
7.酚酞指示剂：溶酚酞1.000克于100ml95%乙醇中。
三、操作规程：Ⅰ.样品预处理：将待测物质烘至恒重（70℃条件下）、磨碎，再烘至恒重制成样品装如广口瓶保存于干燥器中以备测定。
Ⅱ.消化（1）取样：准确称取样品0.2000-0.3000克，装入50ml凯氏烧瓶中（将称量纸卷为圆筒状转入），同时加入浓硫酸6ml以及0.5克催化剂。
（2）将凯氏烧瓶放入通风橱中的消化炉，将炉温调至450℃开始消化，开始10分钟左右注意经常摇动凯氏烧瓶以防止样品经碳化变黑后产生的大量炮沫溅出。
注意不能让泡沫及黑色物质上升到烧瓶颈部）。
消化时间一般为5小时，消化完全后样品消化液呈淡蓝绿色。
（3）冷却消化液，将样品消化液无损地转入50ml容量瓶（注意要用蒸馏水把凯氏烧瓶冲洗干净3-4次，洗涤液也转入容量瓶），定容至50ml、摇匀，待测。
Ⅲ.蒸馏（凯氏蒸馏）（1）清洗装置：测定前用自来水冲洗反应室3次，然后空蒸1分钟，以备测定开始。
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食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）
一、目的与要求
1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理
蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂
硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）
氢氧化钠溶液（400g/L）0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮装置
1、电炉；
2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；
3、螺旋夹a；
4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；
5、反应室；
6、反应室外层；
7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤
1、样品消化
称取样品约2.00g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤
检查微量定氮装置是否装好。
在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a ，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
3、碱化蒸馏
量取硼酸试剂20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a 关闭，螺旋夹b 开启的状态下，准确吸取10.0mL 样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。
使10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a ，关闭螺旋夹b ，开始蒸馏。
通入蒸汽蒸腾10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min 。
然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
同时吸取10.0mL 试剂空白消化液按上法蒸馏操作。
4、样品滴定
以0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。
5、数据记录
五、结果计算 10010100
0140.0)(21⨯⨯⨯⨯⨯-=F m c V V X 式中 X ——样品蛋白质含量（g/100g ）；
V 1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）； V 2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）；
c ——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L ）；
0.0140 ——1.0mL 盐酸]/000.1)([L mol HCl c 标准滴定溶液相当的氮的质量（g ）； m ——样品的质量（g ）；
F ——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；
高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为
6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明
1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g ；液体样品取样10.0mL~25.0mL （约相当氮30mg~40mg ）。
若检测液体样品，结果以g/100mL 表示。
2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。
可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。
若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
4、硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。
可把接收瓶置于冷水浴中。
5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。