生化分离技术复习部分题答案

一、名词解释：

1、梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

或者答流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。（可在离子交换层析中查)。

2、分辨率：是相邻两个峰的分开程度，用相邻两峰对应的洗脱体积之差比上两个半峰宽之和的平均值表示。

3、亲和层析：利用生物分子与其配体间特异性的、可逆性的亲和结合作用而对样品进行分离，配体被固定在载体上，特异性结合经过的与其亲和性的生物分子的一种层析技术。

4、等电聚焦：使电泳的介质中形成一个连续的、稳定并有一定范围的线性pH梯度，电泳时蛋白质等待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移，直到迁移聚集于与其等电点（pI）相同的区域，从而形成一种分辨率极高的电泳聚焦效应。

5、盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低，以致使电解质类物质从溶液里沉淀出来的一种作用现象。

附资料：它是蛋白质分离纯化中经常使用的方法，最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等。

6、保留时间tR：从开始进样至柱出口处被测组分出现浓度最大值时所需的时间,称为保留时间。层析分离技术的一个参数。

7、双向电泳：等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合的电泳方法，即先进行第一向水平电泳——等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行第二向垂直电泳——SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

8、密度梯度离心：在呈密度梯度的惰性介质中以一定的离心力进行离心，让各组分会依其密度分布在梯度中与其自身密度相同的液层中的依密度而分离的离心法。

附资料：密度梯度可以离心前预先制备(如叠加不同浓度蔗糖、甘油)或在离心中自然形成(如使用氯化铯时)。可用于分析型或制备型的离心分离。通常分为差速区带离心和等密度离心两种方式。

二、填空题（要点)：

2、最常用的几种蛋白质的沉淀方法:盐析法(中性盐沉淀)、有机溶剂沉淀、选择性沉淀(热变性沉淀和酸碱变性沉淀)、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。

4、细胞破碎的方法：1)物理：高压匀浆法、珠磨法、超声波破碎法、渗透压冲击法；2)化学：外加酶法、酶自溶法、化学试剂法。

5、聚丙烯酰胺凝胶单体：（一些资料）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）

聚丙烯酰氨凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者

引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

6、DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为7～9，然后提高盐浓度（使蛋白质与交换剂的结合键减弱）或降低pH使之洗脱

7、毛细管电泳：HPCE中电渗流的作用电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象和电渗流现象，电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍。各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致，在电渗加速度的作用下，在负极最先流出。ν0=ν电渗流中性粒子无电泳现象，运动方向与电渗流一致；受电渗流影响，在阳离子后流出ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反，受电渗反作用力影响，阴离子在负极最后流出。随着迁移速度不同，逐渐形成样品谱带。

8、转速与离心力倍数的转换公式：RCF=F离心力／F重力=mω2r/mg=ω2r/g=（2*π*r/r*rpm）^2*r=（0.10471*rpm)^2*r

9、亲和层析是利用配体与其目标蛋白间进行特殊的、可逆性的亲和结合作用而实现分离纯化，通常用凝集素对糖蛋白进行色谱分离，用抗原或金黄色葡萄球菌蛋白A（ProteinA）？配体对制备的抗体（lgG）进行色谱分离。

10、？

11、白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析和凝胶过滤的办法除盐

12、离子交换层析装柱时，树脂在柱内有明显的分界线，这是由于什么原因造成的？

答：

附资料：

装柱

转型再生好的交换剂先放人烧杯，加入少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的1／3，再加人交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。

13、亲和层析中常用的糖基化活化的方法有溴化氰法和环氧法。糖蛋白常用的配体是凝集素，用于抗体纯化的配体通常是抗原或者金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。

附资料：

介绍一些常用的活性基团及活化方法。

(1).溴化氰活化

溴化氰活化法是常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大

(2).环氧乙烷基活化

这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。

上面两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：N－羟基琥珀酰亚胺活化、三嗪活化、高碘酸盐活化、羰酰二咪唑活化等