11-第05章-3 基因组编辑1
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第5章 基因组序列诠释--
实验验证--基因组编辑
基因组编辑 (genome editing) 是一种人工靶向 诱导基因组目标DNA序列发生突变的遗传工 程。通过导入的核酸酶使DNA靶点发生双链 DNA断裂，再经细胞内DNA修复系统在靶点 引入突变。这一技术涉及两个问题： 1）如何实现靶向？ 2）怎样产生双链DNA断裂（DSB）？
ZFN—锌指核酸酶
什麽是ZFN: ZFN, Zinc-Finger Nucleases(锌指核酸酶) 的简称。 ZFN技术原理： PNAS 93：1156-1160，1996 转录因子锌指结合蛋白的D N A 结合域可专一性与基因 调控元件（element）结合，每个锌指基序可以专一性识 别并结合3个连续排列的碱基（-NNN-）。结合D N A 的锌指 多肽与核酸内切酶Fok1连接组成融合蛋白，称之锌指核 酸酶。锌指核酸酶可在体外或体内定点切割D N A 双链。如 果切割位置在基因编码区，即可定点打靶基因。
基因组编辑技术--Cas9
1) 发现CRISPR系统 2) CRISPR系统的结构 3) Cas9工作原理及应用
发现
CRISPR
嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)酸奶发酵 菌。抗噬菌体侵染的乳酸链球菌基因组中含有一种特 别的遗传成分—CRISPR (规律性簇集间隔分布短回文 重复序列)，具有DNA免疫的功能。 Science 315：1709 -1712，2007
ZFN 的 工 作 原 理
将锌指蛋白（Zif268）与内切核酸酶（Fok1）组成融合蛋白Zif-FN (ZFN)。当ZFN的锌指结构域识别并结合特定DNA序列时，连接 的Fok1内切核酸酶可非特异切割邻近DNA，造成DNA断裂，由 此启动DNA修复系统进行同源重组修复或非同源重组修复。这两 种修复均会造成修复DNA位点碱基缺失或插入，从而引起突变。 Nature Review Genetics 11:636-646, 2010
基 于
Zif268
锌指 基序 的
3碱基 识别 模块
每个锌指基序可结合3个碱基。当基序中的氨基酸残基发生 代换时，可改变基序结合的碱基顺序。据此可以进行锌指氨 基酸代换实验，并对识别碱基序列检测。由此可建立锌指基 序库，组成识别模块群。这些识别模块可排列组合，用于基 因打靶序列的选择参考。
基因组 编辑 技术 TALEN
TAL碱基结合模块与 模块组合
TAL效应子由33-34 aa 高 度保守的重复多肽组成。 重复多肽之间仅在第12和 13位置有两个aa差异，与 专一性识别碱基序列有关 。识别A, T,C和G的多肽 单元分别人工合成组成模 块，根据识别的DNA序列 组建工程多肽链。 Science 326 ：1501, 2009
谢谢!
基因组编辑技术
基因组编辑技术有4种： 1) meganuclease (罕见位点核酸酶) 2）ZFN 3) TALEN 4) CRISPR/Cas9 or CRISPRi
Meganulease罕见位点核酸酶
I-Sce是酵母线粒体基因组中一个 内含子编码的限制性内切酶 ，识别18 bp 序列。内含子两 侧含有I-Sce位点，当I-Sce基 因表达产生I-sce酶时：1）可 将I-Sce 内含子切离，产生无 内含子位点；2）寻找同源的 宿主内无内含子的等位位点 ，将其切开。然后通过同源 重组产生含有内含子的等位ISce位点。这一遗传现象称之 为内含子归巢 (homing)。 利用I-Sce专一性酶切并随之发生 双链断裂修复特点，可用来 进行基因组编辑。 由于I-Sce位点在绝大所数物种基 因组中极少存在，因而实际 应用价值不大。 Molecular Cell 10 895-905，2002
CRISPR 系统 重复 / 间隔 顺序
1，重复序列长约26-37nt, 5’和3’末端有部分回文对称序列; 2，间隔序列（数字编号）与重复顺序大小相似, 35-44 nt, 不同 间隔序列之间不重复; 3，间隔序列是细菌获取的外源侵染DNA序列（pro-spacer， 原间隔顺序），用于DNA免疫反应。
化脓性链球菌CRISPR的结构
化脓性链球菌（streptococcus pyogenes）有两个可转录 CRISPR座位： 1）下游CRISPR座位CRISPR01, 转录的产物为crRNA。 2）上游CRISPR座位反向转录，转录的产物为 tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)。 3） tracrRNA含有和crRNA重复序列完全匹配的序列，彼此 间可形成双链RNA。
-
什麽是TALEN: TALEN 是 Transcription activator-like effector nucleases (转录激活因子样效 应物核酸酶)的简称，与ZFN的技术原 理有相似之处。TALEN系统中，效 应子DNA结合域（TAL）取代了ZFN 中的锌指蛋白，与之连接的内切核酸 酶仍然是Fok1。
原核 生物
CRISPR
系统的 免疫机 制 （1）
CRISPR系统的免疫机制---获取外源原间隔序列： 来自病毒和质粒DNA的原间隔序列(pro -spacer)被切割整合 到CRISPR重复序列位置
Cas9打靶机制
当crRNA和tracrRNA转录后 即可在同源重复序列之间 形成RNA双链，随后 Cas9与crRNA/tracrRNA 结合组成打靶复合物。 crRNA的编码序列来自外 源DNA，因此可在外源 DNA侵入细胞时， crRNA可以搜寻并与外源 DNA配对形成互补双链 。一旦互补双链形成， Cas9即可执行核酸内切 酶功能，在外源DNA与 crRNA配对位置切割 DNA，完成DNA打靶。 Science 337, 816, 2012
基因组编辑技术进展
-
Cpf1系统
与Cas9相比，Cpf1有以下特点： 第一， 大小不同。Cas9剪切D N A 需要两个小R N A 分子，而Cpf1 只需要一个。Cpf1酶比标准的 SpCas9要小，更容易进入组织 和细胞。 第二， 剪切方式不同。Cas9在同 一个位置剪切D N A 分子双链， 形成平末端；Cpf1是交错剪切 目标DNA, 形成黏性末端。 第三， 剪切位置不同。Cpf1剪切 位点距离识别位点较远。 第四， Cpf1系统在目标位置的选 择上与Cas9不同。 Cas9 的 P A M 序列为5’- (NNA G A A W 3’（N表示任意碱基; W 表示A 或T) 或5’-NGGNG-3’，Cpf1 复合物的P A M 序列为-TTN-。靶 位与天然存在的P A M 序列相邻.
见 ：Zetsche et al., 2015, Cell 163： 1–13
新一代DNA介导的 基因组编辑技术
1）2014年Swarts D C 等报道采用嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）AGO蛋白以D N A 介导细菌D N A 的切割。 Nature. 2014; 507:258–261 2）2015年中国河北科技大学韩春雨团队报道利用格氏( 嗜) 盐 碱杆菌(Natrono- bacterium gregoryi)AGO蛋白以D N A 为 介导对人类细胞基因组进行编辑，称为NgAgo系统。 Nature Biotechnology doi:10.1038/ nbt.3547 3） NgAgo系统特点：1，利用D N A 而非R N A 介导基因组编辑； 2，在编辑位点去除数个核苷酸，而非仅仅产生断裂；3 ，引导序列24 nt，专一性更强；4，NgAgo系统不需要 P A M 位点序列，对打靶序列限制少。
Cas9打靶需注意的问题
1）引导RNA（gRNA） 与打靶DNA的配对碱 基数在20 nt。 2）打靶DNA序列与引导 gRNA的配对序列中 ，低于5 nt的差异会 出现脱靶效应。 3）原间隔顺序下游有3 个碱基组成的保守基 序（PAM），在设计 gRNA时必须含有 PAM序列。 4）在crRNA与接近PAM 靶DNA位点之间3-’ 端至少必须满足13个 碱基的精确配对。 Science 337, 816, 2012
锌指 基序 ຫໍສະໝຸດ Baidu锌 指蛋 白
锌指蛋白是真核生物中最丰富的转录因子之一。图示 TFIII A是5SrRNA 基因的转录调控因子, 含9个锌指基序, 可识别与结合启动子区33个碱 基序列，控制基因表达。 Zif268(小鼠蛋白)是最早用于基因打靶的锌指蛋白转录因子, 含3个锌指基 序，识别9 bp序列，与限制酶Fok1组成融合蛋白用于基因组编辑。
实验验证--基因组编辑
基因组编辑 (genome editing) 是一种人工靶向 诱导基因组目标DNA序列发生突变的遗传工 程。通过导入的核酸酶使DNA靶点发生双链 DNA断裂，再经细胞内DNA修复系统在靶点 引入突变。这一技术涉及两个问题： 1）如何实现靶向？ 2）怎样产生双链DNA断裂（DSB）？
ZFN—锌指核酸酶
什麽是ZFN: ZFN, Zinc-Finger Nucleases(锌指核酸酶) 的简称。 ZFN技术原理： PNAS 93：1156-1160，1996 转录因子锌指结合蛋白的D N A 结合域可专一性与基因 调控元件（element）结合，每个锌指基序可以专一性识 别并结合3个连续排列的碱基（-NNN-）。结合D N A 的锌指 多肽与核酸内切酶Fok1连接组成融合蛋白，称之锌指核 酸酶。锌指核酸酶可在体外或体内定点切割D N A 双链。如 果切割位置在基因编码区，即可定点打靶基因。
基因组编辑技术--Cas9
1) 发现CRISPR系统 2) CRISPR系统的结构 3) Cas9工作原理及应用
发现
CRISPR
嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)酸奶发酵 菌。抗噬菌体侵染的乳酸链球菌基因组中含有一种特 别的遗传成分—CRISPR (规律性簇集间隔分布短回文 重复序列)，具有DNA免疫的功能。 Science 315：1709 -1712，2007
ZFN 的 工 作 原 理
将锌指蛋白（Zif268）与内切核酸酶（Fok1）组成融合蛋白Zif-FN (ZFN)。当ZFN的锌指结构域识别并结合特定DNA序列时，连接 的Fok1内切核酸酶可非特异切割邻近DNA，造成DNA断裂，由 此启动DNA修复系统进行同源重组修复或非同源重组修复。这两 种修复均会造成修复DNA位点碱基缺失或插入，从而引起突变。 Nature Review Genetics 11:636-646, 2010
基 于
Zif268
锌指 基序 的
3碱基 识别 模块
每个锌指基序可结合3个碱基。当基序中的氨基酸残基发生 代换时，可改变基序结合的碱基顺序。据此可以进行锌指氨 基酸代换实验，并对识别碱基序列检测。由此可建立锌指基 序库，组成识别模块群。这些识别模块可排列组合，用于基 因打靶序列的选择参考。
基因组 编辑 技术 TALEN
TAL碱基结合模块与 模块组合
TAL效应子由33-34 aa 高 度保守的重复多肽组成。 重复多肽之间仅在第12和 13位置有两个aa差异，与 专一性识别碱基序列有关 。识别A, T,C和G的多肽 单元分别人工合成组成模 块，根据识别的DNA序列 组建工程多肽链。 Science 326 ：1501, 2009
谢谢!
基因组编辑技术
基因组编辑技术有4种： 1) meganuclease (罕见位点核酸酶) 2）ZFN 3) TALEN 4) CRISPR/Cas9 or CRISPRi
Meganulease罕见位点核酸酶
I-Sce是酵母线粒体基因组中一个 内含子编码的限制性内切酶 ，识别18 bp 序列。内含子两 侧含有I-Sce位点，当I-Sce基 因表达产生I-sce酶时：1）可 将I-Sce 内含子切离，产生无 内含子位点；2）寻找同源的 宿主内无内含子的等位位点 ，将其切开。然后通过同源 重组产生含有内含子的等位ISce位点。这一遗传现象称之 为内含子归巢 (homing)。 利用I-Sce专一性酶切并随之发生 双链断裂修复特点，可用来 进行基因组编辑。 由于I-Sce位点在绝大所数物种基 因组中极少存在，因而实际 应用价值不大。 Molecular Cell 10 895-905，2002
CRISPR 系统 重复 / 间隔 顺序
1，重复序列长约26-37nt, 5’和3’末端有部分回文对称序列; 2，间隔序列（数字编号）与重复顺序大小相似, 35-44 nt, 不同 间隔序列之间不重复; 3，间隔序列是细菌获取的外源侵染DNA序列（pro-spacer， 原间隔顺序），用于DNA免疫反应。
化脓性链球菌CRISPR的结构
化脓性链球菌（streptococcus pyogenes）有两个可转录 CRISPR座位： 1）下游CRISPR座位CRISPR01, 转录的产物为crRNA。 2）上游CRISPR座位反向转录，转录的产物为 tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)。 3） tracrRNA含有和crRNA重复序列完全匹配的序列，彼此 间可形成双链RNA。
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什麽是TALEN: TALEN 是 Transcription activator-like effector nucleases (转录激活因子样效 应物核酸酶)的简称，与ZFN的技术原 理有相似之处。TALEN系统中，效 应子DNA结合域（TAL）取代了ZFN 中的锌指蛋白，与之连接的内切核酸 酶仍然是Fok1。
原核 生物
CRISPR
系统的 免疫机 制 （1）
CRISPR系统的免疫机制---获取外源原间隔序列： 来自病毒和质粒DNA的原间隔序列(pro -spacer)被切割整合 到CRISPR重复序列位置
Cas9打靶机制
当crRNA和tracrRNA转录后 即可在同源重复序列之间 形成RNA双链，随后 Cas9与crRNA/tracrRNA 结合组成打靶复合物。 crRNA的编码序列来自外 源DNA，因此可在外源 DNA侵入细胞时， crRNA可以搜寻并与外源 DNA配对形成互补双链 。一旦互补双链形成， Cas9即可执行核酸内切 酶功能，在外源DNA与 crRNA配对位置切割 DNA，完成DNA打靶。 Science 337, 816, 2012
基因组编辑技术进展
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Cpf1系统
与Cas9相比，Cpf1有以下特点： 第一， 大小不同。Cas9剪切D N A 需要两个小R N A 分子，而Cpf1 只需要一个。Cpf1酶比标准的 SpCas9要小，更容易进入组织 和细胞。 第二， 剪切方式不同。Cas9在同 一个位置剪切D N A 分子双链， 形成平末端；Cpf1是交错剪切 目标DNA, 形成黏性末端。 第三， 剪切位置不同。Cpf1剪切 位点距离识别位点较远。 第四， Cpf1系统在目标位置的选 择上与Cas9不同。 Cas9 的 P A M 序列为5’- (NNA G A A W 3’（N表示任意碱基; W 表示A 或T) 或5’-NGGNG-3’，Cpf1 复合物的P A M 序列为-TTN-。靶 位与天然存在的P A M 序列相邻.
见 ：Zetsche et al., 2015, Cell 163： 1–13
新一代DNA介导的 基因组编辑技术
1）2014年Swarts D C 等报道采用嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）AGO蛋白以D N A 介导细菌D N A 的切割。 Nature. 2014; 507:258–261 2）2015年中国河北科技大学韩春雨团队报道利用格氏( 嗜) 盐 碱杆菌(Natrono- bacterium gregoryi)AGO蛋白以D N A 为 介导对人类细胞基因组进行编辑，称为NgAgo系统。 Nature Biotechnology doi:10.1038/ nbt.3547 3） NgAgo系统特点：1，利用D N A 而非R N A 介导基因组编辑； 2，在编辑位点去除数个核苷酸，而非仅仅产生断裂；3 ，引导序列24 nt，专一性更强；4，NgAgo系统不需要 P A M 位点序列，对打靶序列限制少。
Cas9打靶需注意的问题
1）引导RNA（gRNA） 与打靶DNA的配对碱 基数在20 nt。 2）打靶DNA序列与引导 gRNA的配对序列中 ，低于5 nt的差异会 出现脱靶效应。 3）原间隔顺序下游有3 个碱基组成的保守基 序（PAM），在设计 gRNA时必须含有 PAM序列。 4）在crRNA与接近PAM 靶DNA位点之间3-’ 端至少必须满足13个 碱基的精确配对。 Science 337, 816, 2012
锌指 基序 ຫໍສະໝຸດ Baidu锌 指蛋 白
锌指蛋白是真核生物中最丰富的转录因子之一。图示 TFIII A是5SrRNA 基因的转录调控因子, 含9个锌指基序, 可识别与结合启动子区33个碱 基序列，控制基因表达。 Zif268(小鼠蛋白)是最早用于基因打靶的锌指蛋白转录因子, 含3个锌指基 序，识别9 bp序列，与限制酶Fok1组成融合蛋白用于基因组编辑。