简并引物列表
用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段
1 材料与方法
1. 1 菌株及培养液 反刍月形单胞菌 K6 由本课 题组从健康奶牛瘤胃中分离得到 。
培养液 :胰酶解酪蛋白 5. 0 g ,蛋白胨 5. 0 g ,酵 母提取物 10. 0 g ,牛肉浸膏 5. 0 g ,葡萄糖 5. 0 g , K2 H PO4 2. 0 g ,刃天青 1. 0 mg ,盐溶液 40 mL ,双馏 水 950 mL ,通入 N2 和 CO2 后煮沸 ,冷却后加入氯 化血红素溶液 10 mL ,维生素 K1 溶液 0. 2 mL , L2 半胱氨酸 0. 5 g ,调 p H 值至 7. 0 ,在 N2 条件下分 装 ,高压灭菌 。 1. 2 工具酶与生化试剂 Ex Taq 聚合酶 ( 5 U/ μL) ,DNA Marker ,dN TPs (2. 5 mmol/ L ) 均购自宝 生物工程 (大连) 公司 ; 总 DNA 提取试剂盒 、DNA 回收纯化试剂盒均购于杭州维特洁生物技术公司 ; 氯化血红素 、维生素 K 等购自 Sigma 公司 ,蛋白胨 、 酵母提取物购自 Oxoid 公司 。p MD182T 载体购自 宝生物工程 (大连) 有限公司 。 1. 3 主要数据库与软件 NCB I ( ht tp :/ / www . ncbi. nlm. nih. gov/ ) 、U nip rot 蛋白质序列查询数据 库 ( ht tp :/ / www . unip rot . org/ ) 、Blockemaker ( ht2 tp :/ / blocks. f hcrc. o rg/ blocks/ make_ blocks. ht2 ml ) 、Co de Hop ( ht tp :/ / blocks. f hcrc. org / blocks/ codehop . ht ml) 、M E GA 4. 0 。用 COD E HO P 检索 乙酸激酶简并引物时 ,检索主要设定参数为 “: Max2 imum core degeneracy :128 , Target clamp tempera2 t ure :60 ℃,codo n usage table :Bacillus subtilis”。 1. 4 序列比较 K6 的 16S rDNA 序列为本研究室 提交 ( GenBank 数据库上的登陆号为 DQ079866. 1) , 利用对 K6 16S rDNA 序列在 GenBank 中进行检索 同 源 rDNA 序 列 , 应 用 M E GA 软 件 中 Boot 2 st rap
引物及简并引物2013.11.13
(4)再利用Oligo6.0进行引物自身的分析:引物自身 有无发夹结构;引物之间有无引物二聚体;引物的 Tm值丌宜过高,且两条引物的Tm值丌要相差5e以 上。
(5) 2条引物间的距离以500~800bp之间为宜,有利于 提高PCR反应的特异性。
常用软件
• Primer Premier 5.0 • Oligo 6.22 • DNAClub • Dnasis • Dnastar • DNAMAN 等
密码子表
简并引物
• 简并引物是指用来编码一段短肽序列的 丌同碱基序列的混合物。 • 主要用来同源克隆未知的基因，或用来 分析某一种基因多态性的一种方法。
• 4、简并引物的筛选 (1)根据引物设计的普遍原则和 Target clamp temper-ature值,先筛选出一些分值较高的引物。
(2)看引物在氨基酸保守区内的位置,确保其简并度 低。 (3)再以其中1条鱼的mRNA序列为模板,利用 DNAMAN看引物在模板中的位置,确定它不模板 mRNA的匹配性,匹配度越高越好。
引物设计原则
• 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27bp，但丌应 大于38 • 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3‘端相似 性较高的序列，否则容易导致错配。 • 引物3’ 端避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC ，会使错误引发机率增加。
• 引物3’端的末位碱基应当避免在引物的3’端使用碱基A 。
简并核苷酸
•R=A/G，Y=C /，M=A/C， K=G/T，S=C/G，W=A/T， H=A/C/T，B=C/G/T， V=A/C/G D=A/G /T， N=A/C/G/T
设计步骤
• 1、利用NCBI搜索丌同物种中同一目的基因的蛋白 或cDNA编码的氨基酸序列。首先找到一种蛋白。 随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白) ，在整个Nr数据库中中查找不之相似的氨基酸序 列。 • 2、对所找到的序列进行多序列比对，确定合适的 保守区域。利用BlockMaker • 3、利用CODEHOP设计引物，从Block Maker Results网页直接登录CODEHOP数据库进行引物 设计。
通用引物列表
序列(5'-3') CAG GAA ACA GCT ATG ACC TGT AAA ACG ACG GCC AGT
M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96) SP6 CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG ATT TAG GTG ACA CTA TAG
TAT GGC TGA TTA TGA TCA GT AAG AAG GGC AGC ATT CAA AG ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA AGG CGA TTA AGT TGG GTA GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGC GAA CGC CAG CAC ATG GAC CTC CGA GAT CTG GAC GAG C GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC GTT CTG AGG TCA TTA CTG G TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG T3 pGEX-4T5' pGEX-4T3' GLp1 GLp2 RVp3 RVp4 pcDNA3.1 R PinPoint primer pCMV-F ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG TAG AAG GCA CAG TCG AGG CGT GAC GCG GTG CAG GGC G TCT AAA AGC TGC GGA ATT GT
优化简并引物 PCR 克隆 Candida glycerinogenes 磷酸甘 …
第27卷第4期2008年7月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.27 No.4J ul. 2008 文章编号:167321689(2008)0420091206 收稿日期:2007210225. 基金项目:国家自然科学基金项目(30570142).作者简介:陈献忠(19802),男,安徽界首人,工业微生物博士研究生.3通讯作者:诸葛健(19392),男,浙江金华人,教授,博士生导师,主要从事发酵工程和工业微生物学方面的研究.Email :jianzhuge @优化简并引物PCR 克隆Can di da gl yceri nogenes32磷酸甘油脱氢酶基因片段陈献忠, 饶志明, 沈微, 诸葛斌, 方慧英, 王正祥, 诸葛健3(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)摘 要:为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Can di da gl yceri nogenes )克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD +232磷酸甘油脱氢酶基因(ct GPD ),对不同酵母和其他真核生物的NAD +232磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.gl yceri nogenes 的NAD +232磷酸甘油脱氢酶(GPD )基因片段,经过优化PCR 反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出Cg GPD 基因中约600bp 的保守核心片段。
DNA 序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD +232磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPD 基因相似性较高。
关键词:PCR ;NAD +依赖32磷酸甘油脱氢酶;产甘油假丝酵母;克隆;简并引物中图分类号:Q 785文献标识码:ACloning of NAD +2Dependent G lycerol 32Phosphate DehydrogenaseG ene Fragment from Ca ndida gl yceri nogenes withDegenerate Oligonucleoide PrimersC H EN Xian 2Zhong , RAO Zhi 2Ming , SH EN Wei , ZHU GE Bin ,FAN G Hui 2Y ing , WAN G Zheng 2Xiang , ZHU GE Jian 3(Key Lab of Industrial Biotechnology ,Ministry of Education ,Jiangnan University ,Wuxi 214122,China )Abstract :In S accharom yces cerevisi ae ,glycerol is synt hesized in cytosol by reduction of t he glycolytic intermediate dihydroxyacetone p ho sp hate (D HA P )to glycerol 32p hosp hate (G3P )followed by dep hosp horylation of G3P to glycerol.Furt her st udies had revealed t hat cytol NAD +2dependent glycerol 32p ho sp hate dehydrogenase (ct GPD )is t he rate 2limiting enzymes for glycerol synt hesis.However ,it is unclear whet herGPD has similar role in Candi dagl yceri nogenes WL200225,a novel o smotolerant yeast species used in glycerol p roduction.So ,itis essential to clone GPD gene from C.gl yceri nogenes ,for investigation of glycerol bio synt hesis in molecular level.After comparison of t he amino acid sequence of t he GPD H p roteins in several species ,degenerate oligonucleoide p rimers were designed for PCR based on conservative regions in t he amino acid sequence.PCR was performed on t he genomic DNA of C.gl yceri nogenes andparameters involved in amplification efficiency were optimized.U sing one moderate degeneracy pair of p rimers,a degenerate PCR p roduct of ca.0.6kb was amplified and sequenced.Which homologous to GPD1of S accharom yces cerevisi ae.This provides a t hreshold of st udying glycerol p roduction pat hway and osmotic st ress response mechanism at genetic and molecular level in t his yeast.K ey w ords:PCR;NAD+2dependent glycerol32p ho sp hate dehydrogeanse;Candi da gl yceri nogenes;clone;degenerate oligonucleoide primers 当细胞处于高渗透压环境中时,为了保持胞内的水分和小分子物质向环境中外泄,就需要通过自身合成一些生物相容性物质来提高胞内的渗透压来平衡胞内和胞外的压力差,从而起到保护和防御的作用。
简并引物设计方法与技巧
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密 码子的简并性，引物3’端最后一个碱基 最好不与密码子第三个碱基配对。
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generaer 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
常用引物序列
常用引物序列引言引物序列是指在分子生物学实验中用来特异性引导DNA或RNA复制和扩增的短链核酸序列。
常用的引物序列在科研和实验室工作中起着重要作用。
本文将介绍几种常用引物序列及其在实验中的应用。
1. 通用引物序列通用引物序列是指适用于多种物种的引物序列。
常见的通用引物序列包括16S rRNA引物序列用于细菌和古细菌的分析，18S rRNA引物序列用于真核生物的分析，以及ITS引物序列用于真菌的分析。
这些通用引物序列具有高度保守性，可以用于不同物种的物种鉴定和进化分析。
2. 物种特异引物序列物种特异引物序列是指只在特定物种中存在的引物序列。
这些引物序列通常用于物种鉴定和种群遗传分析。
例如，人类特异引物序列可以用于人类DNA的特异扩增，从而进行人类个体的鉴定。
物种特异引物序列的选择和设计需要根据目标物种的基因组序列进行。
3. 定量引物序列定量引物序列是指用于定量PCR实验的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以通过PCR扩增目标基因的特定片段，并通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
定量引物序列的设计需要考虑引物的特异性和扩增效率，以确保准确的定量结果。
4. 荧光标记引物序列荧光标记引物序列是指在引物序列上加入荧光标记分子，用于检测和定量特定基因的表达水平。
常用的荧光标记引物序列包括荧光探针和荧光引物。
荧光标记引物序列可以通过荧光定量PCR或原位杂交等技术进行检测。
5. 反向引物序列反向引物序列是指用于反转录PCR实验的引物序列。
反转录PCR是一种将RNA转录成cDNA的技术，常用于研究基因的表达调控和mRNA的定量分析。
反向引物序列通常与反向转录酶结合，将RNA逆转录成cDNA，并通过PCR扩增特定基因的cDNA片段。
6. 基因特异引物序列基因特异引物序列是指用于特定基因扩增的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以选择性地扩增目标基因，从而进行基因型鉴定和基因表达分析。
常见载体引物表
无
pDSRED-PRESS-C1
pDSRED -C1-F
pDSRED-C1-R
pCR-Blunt
M13R
M13F/T7
pMT/V5-His_A (_B,_C)
MT-Profor
BGHrev
pEASY-T3
T7/M13F
SP6/M13R
PSILENCE-1.0-U6
T7
2.0REV(同P2(pCAMBIA 1301))
pMSCV
MSCV5'
MSCV-rev
pBABE
pBABE5’
pBABE3’
pFastBac HT_A (_B, _C)
pFastBac-F
pFastBac-R
pFastBac1
PH-Profor/BaculoVfor
pFastBac-R
pACYCDuet-1 (MCS I)
ACYCDuetUP 1
T7/S.tag
T7 Ter
pET-42a (-b, -c)(+)
Stag
T7 Ter
pET50(amp+)
T7/s.tag
T7TER
pET44(AMP+)
T7/s.tag
T7 Ter
pEYFP-N1
pEGFP-N-5’
pEGFP-N-3’
PETBlue
PETBlueT7UP(太靠前，在T7前)/ PETBlueUP
pLEXA-R
pCDH
pCDH-EF1
无
PVX
LBA
LBB
pAcGP67 (_A, _B, _C)
PH
pAcGP67rv
pAD-Track
实例图解简并引物设计
裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导 出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
2. 引物设计
推荐先设计 3′端引物， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。 （1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端位置选取一段合适 的序列（ 784-803bp ）， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的最 关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考 虑以下几个内容： 1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A； 3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
（3）BLAST 比对回检
点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显 示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特 异性良好。
（4）两引物互补性检查
• 同 样 方 式 ， 得 到 5' 端 序 列 ： GSAAAYGAYACAATYGATGC ，根据引物设计原则， 需要检测两引物之间是否存在序列互补。 • 打 开 DNAMAN ， 依 次 在 “ Primer ” - “ Load primer ”，粘贴任意一端引物序列，如： 5' 端序列 GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。
通 过 Web Logo 生 成 的 多 重 比 对 图 片 可 以 很 直 观 得 到 3' 端 序 列 为 CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ，查询简并碱基代码表（下图），可 知 C/T/G=B ， G/A=R ， 简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为 CTTGGAGTBAARAACATGTG ， 故 而 需 要 合 成 的 3′ 端 引 物 序 列 ： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。
常用引物序列(分子生物学)
常用引物序列（分子生物学）序列(5'-3') GGTTACCTTGTTACGACTT AGAGTTTGATCCTGGCTCA GACGCACAATCCCACTATCC AGATGGTGCACGATGCACAG GGCAAATGGCATTCTGACAT TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATAC TACCACTACAATGGATGATG GACTGGTTCCAATTGACAAGC TCATCGGAAGAGAGTAG CCCTCATAGTTAGCGTAACG TACTATTGCCAGCATTGCTGC AACCATCTCGCAAATAAATA ACGCACAGAATCTAGCGCTT TAGAAGGCACAGTCGAGG TTAGGACAAGGCTGGTGG ATAACCCCGCCCCGTTGCGCAAATGGGCGGTAGGCGTG\ATGGGCGGTAGGCGT G TCGTTGGGCGGTCAGC GATTATGCGGCCGTGTACAA GATCTCGACGCTCTCCCT TTGTACACGGCCGCATAATC GTGGTTTGTCCAAACTCATC AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC CGTCGCCGTCCAGCTC AACATTTTCGGTTTGTATTACTTC TGTATCTTATGGTACTGTAACTG CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA GLP4 H1-F\H1 HSVtk-pArev IRES-R ITS4 ITS5 M13-47M13F\TrxReverse\M13-20\M13F-4 0 M13R malE MT-Profor mU6F2(mouse) NL1 NL4 NOSR-primer P1 p10-Profor P2 pBABE3' PBABE5' pBADfw pBADrv\pTrcHis-rv PBV220F pCDNA3.1F pCMV5F pCMV5R PCMV-F PCMV-R GCCCTTCTTAATGTTTTTG TCGCTATGTGTTCTGGGAAAGTCTCCTTCCGTGTTTCAG CCTCACATTGCCAAAAGACG TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC TGTAAAACGACGGCCAGT CAGGAAACAGCTATGACC GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC CATCTCAGTGCAACTAAA TAGTATCCGACGCCGCCATC GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG GGTCCGTGTTTCAAGACGG CGTCCAGCTCCATGTTGC CCAGGCTTTACACTTTATGC CGGACCTTTAATTCAACCC GCGATTAAGTTGGGTAACGC ACCCTAACTGACACACATTCC CTTTATCCAGCCCTCAC CCATAGCATTTTTATCCATAAG ATCTGTATCAGGCTGAAAATC AAGAAGGGCAGCATTCAAAG CTAGAGAACCCACTGCTTAC TTCCAAAATGTCGTAATAAC ATTATAGAGGACACCTAGTC TCTAAAAGCTGCGGAATTGT TCCAAACTCATCAATGTATCpcoldI-R\pCold-SUMO-R pCold-TF-F1 pDBLeu-F pDEST22-F pDEST22-R PDONR-F PDONR-R pDsRED-ex-C1-FPEF-F\EF-1aForward pEGFP-C-3' pEGFP-C-5’ pEGFP-N-3’\EGFP-Nrev pEGFP-N-5'pFastBac-fw pFastBac-R pFastBac-rev pFlag-CMV-F pFlag-CMV-R PGEX-F PGEX-R PH-Profor pIRESrv PJET1.2-F PJET1.2-R pLNCX-F pLXSN-F pLXSN-R pMAL-C2X-FpMAL-C2X-RGGCAGGGATCTTAGATTCTG CCACTTTCAACGAGCTGATGGAATAAGTGCGACATCATCATC TCGATGATGAAGATACCCCACC CTCGACGTCTTACTTACTTAGC TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC TCCCACAACGAGGACTACAC TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC TATGGCTGATTATGATCAGT CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG GTCCGAAACCATGTCGTAC TGGACAAACCACAACTAGAATG CCTCTACAAATGTGGTATGG GGTAGGCGTGTACGGTGG GCACTGGAGTGGCAACTT GGCAAGCCACGTTTGGTG GAGCTGCATGTGTCAGAGG AAATGATAACCATCTCGC GCCCTAGATGCATGCTCG CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG CTTGAACCTCCTCGTTCGAC GTTGCTGACTAATTGAGATG TGCGTACTGCGGTGATCAAC CTGCAAGGCGATTAAGTTGGpMAL-C5x-R PPC86-F\pDEST22-F2018 PPC86-R\pDBLeu-R pQE30-F pQE30-R pSHUTTLE-CMV-R pSilencer4.1-F\2.0rev PTRC99C-F PTRC99C-R\PBV220R pYes2.R\CYC1-Terminator RFP-Nrev RV-M RVP3 RVP4 S.tag SeqL-A SeqL-B SP6 SV40 SV40-pArev\pSG5rv T3 T7 T7(17base) T7terU6-promoter(human) v1.5 V5rev WPRE-R XL39\CMV-24 TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC TATAACGCGTTTGGAATCACT GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC TGAGCGGATAACAATTTCACGTTCTGAGGTCATTACTGG GTGGTATGGCTGATTATGATCAG AGGCGATTAAGTTGGGTA TTGCGCCGACATCATAAC CTGCGTTCTGATTTAATCTG GCGTGAATGTAAGCGTGAC GTTCACGGTGCCCTCC AGCGGATAACAATTTCACACAGGA CTAGCAAAATAGGCTGTCCC GACGATAGTCATGCCCCGCG GAACGCCAGCACATGGAC GCAGTTCCCTACTCTCGC CATCAGAGATTTTGAGACAC ATTTAGGTGACACTATAG GGAGGCTTTTTTGGAGGC GAAATTTGTGATGCTATTGC ATTAACCCTCACTAAAGGGA TAATACGACTCACTATAGG ACATCCACTTTGCCTTTCTC TGCTAGTTATTGCTCAGCGG CCGTAACTTGAAAGTATTTCG GGACTTTCCAAAATGTCG ATCGAGACCGAGGAGAGG CATAGCGTAAAAGGAGCAACA ATTAGGACAAGGCTGGTGGGITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG。
简并引物设计
简并引物设计PCR（聚合酶链反应）是一种基础而重要的技术，在生物学、医学、检测等领域都有着广泛的应用。
然而，PCR技术在实际应用过程中，常常会遇到一些问题，例如引物设计不合理、多重特异性等。
简并引物设计便是为了解决这些问题而产生的技术。
本文将介绍简并引物设计的原理、方法、优缺点及应用。
一、简并引物设计的原理简并引物是一种含有多个碱基的引物，其中每个碱基的位置都可以存在多种可能性。
简并引物的设计原理是根据目标序列的多态性，将可能出现的碱基变异情况考虑在内，从而设计出能够特异性扩增目标序列的引物。
二、简并引物设计的方法简并引物设计可以通过人工设计或计算机辅助设计完成。
1. 人工设计人工设计简并引物需要根据目标序列的多态性情况，逐个考虑每个碱基的变异情况，然后选择合适的碱基组合作为简并引物的设计。
例如，对于一段序列“ATGCTAGC”，在第三个碱基位置上存在两种可能性“A”和“T”，在第七个碱基位置上存在三种可能性“A”、“C”和“G”，则可以设计出两个简并引物：ATGCTAGC和ATGCTAGN。
2. 计算机辅助设计计算机辅助设计可以通过在线工具或软件完成，例如Primer3、Primer-BLAST等。
这些工具可以根据用户输入的目标序列信息和扩增条件，自动生成合适的简并引物设计方案。
三、简并引物设计的优缺点简并引物设计相比于传统引物设计有以下优点：1. 提高特异性简并引物设计可以考虑到目标序列的多态性，从而提高扩增的特异性。
特别是对于高度变异的序列，简并引物设计可以有效地避免非特异性扩增。
2. 减少设计时间传统引物设计需要逐个考虑每个碱基的变异情况，而简并引物设计可以通过在线工具或软件自动生成设计方案，大大减少了设计时间。
3. 降低成本简并引物设计可以减少试验重复次数和材料浪费，从而降低实验成本。
简并引物设计的缺点包括：1. 扩增效率可能降低由于简并引物设计需要考虑目标序列的多态性，因此引物长度可能会增加，扩增效率可能会降低。
常见载体引物表
pLXSNfw
pLXSNrv
pLEXA
pLEXA-F
pLEXA-R
pCDH
pCDH-EF1
无
PVX
LBA
LBB
pAcGP67 (_A, _B, _C)
PH
pAcGP67rv
pAD-Track
pAD-Track-F
无
PLPC
PLPC-F/CMV-F
PLPC-R
pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen
pLVX-IRES-ZsGreen1
PIRES2-EGFP-F
PIRES2-EGFP-R
pDC316
pDC316F
pDC316R
PLXSN-5
PLXSN-3
PVAX1
T7/CMV-F
BGH
PSHUTTLE-CMV
pShuttle-CMV-F
pShuttle-CMV-R
pSilencer™ 4.1-CMV neo
此载体无反向引物
CMV-F/T7
SP6/BGH
CMV-F/T7
BGH
pcDNA4
T7/CMV-F
BGH
pcDNA6
T7/CMV-F(J21025在T7前面〕
BGH
pcDNAII
T7
SP6
M13F
M13R
pCEP4
pCEP-F
EBV-R
pCF-T
M13F
M13R
pCI
T7〔17Base〕
此载体无反向引物
T7
pTWIN-1
T7
T7TER(客户确认再用〕
pUC18(19)/118(119)
M13F(-47)
简并引物文档
简并引物引言简并引物是一种在分子生物学研究和实验室技术中常用的工具。
简并引物是一组具有部分序列差异但具有相似特性的引物序列，用于扩增目标DNA序列。
简并引物通常由多个互补碱基序列组成，这些引物序列可以与目标DNA序列的多个可能序列匹配。
简并引物的广泛应用促进了分子生物学研究的发展，并在基因组学、遗传学和医学诊断中扮演着重要的角色。
简并引物的设计原理简并引物的设计原理基于核酸序列间的碱基互补配对。
在DNA复制和PCR扩增的过程中，引物需要与DNA模板中的特定序列互补，使得DNA聚合酶能够以引物为起始点开始合成新的DNA链。
为了确保引物能够选择性地与目标DNA序列互补，并且不与其他非目标序列互补，简并引物的设计需要考虑到以下几个因素：1.碱基互补：引物序列中的碱基需要与目标DNA序列完全互补，以确保引物能够牢固地结合并启动DNA链的合成过程。
2.简并性：引物序列需要包含多个互补碱基序列，以使得引物能够与目标DNA序列的多个可能序列匹配。
这样的设计可以增加引物与目标DNA序列杂交的特异性和选择性。
3.长度：引物的长度需要适当，一般为15-25个碱基。
过短的引物可能导致非特异性引物杂交，而过长的引物可能影响反应的效率。
4.碱基组成：引物的碱基组成需要均衡，避免引物序列中存在偏向某种碱基的情况。
碱基组成的不均衡可能导致引物的特异性降低。
任何一个简并引物的设计都需要综合考虑以上因素，以确保引物能够准确、特异地扩增目标DNA序列。
简并引物的应用简并引物具有广泛的应用领域，包括但不限于以下几个方面：1.PCR扩增：PCR是分子生物学中最常用的实验技术之一，简并引物在PCR扩增中起到至关重要的作用。
通过使用简并引物，可以扩增出多个不同但相关的目标DNA片段，从而快速、准确地分析目标序列的多态性和变异情况。
2.遗传标记：简并引物可以用于遗传标记的设计和分析。
通过引物的简并性，可以覆盖目标DNA序列的各种可能序列，从而提高遗传标记的准确性和信息量。
HPV病毒的常用通用引物检测
HPV病毒的常用通用引物检测摘要研究表明，HPV病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关。
对感染个体的病毒检测具有重要的疾病诊断、治疗、预防意义。
但目前缺乏可以兼顾敏感性、特异性、操作简单，可以大规模推广使用的可靠检测方法。
对待测样本进行PCR 检测仍是目前实验室最多采用的检测方法。
PCR具有高敏感、易操作的优点，但其反应的灵活性和极高的敏感性，也带来了假阳性和假阴性的问题。
针对HPV 病毒L1序列保守区域设计的通用引物检测，最常被应用于大样本检测。
通用引物可以在一次PCR反应中同时检测多种型别的HPV病毒感染，与序列特异PCR 检测相比，可以大大减少检测的工作量。
但其缺点在于，通用引物仅与某个或少数HPV型序列匹配，而对于多数型别HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。
这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同。
因此，使用通用引物检测HPV感染时，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。
目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三类：1）单一引物如：GP5+/6+。
2）简并引物如：、MY09/11。
3）混合引物如：SPF1/2。
个型通用引物都有其各自的优缺点，需要根据特定试验的目的、条件选用合适的通用引物进行检测。
【关键词】HPV病毒；通用引物；单一引物；简并引物；混合引物HPV病毒是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，其基因组长约7900bp。
目前约共发现约200多型HPV病毒。
该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化[1] [2] [3]。
人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV，其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关，如：16、18、31、33、35等，这部分HPV病毒被称为高危型[4][5]。
而HPV6、11等型别主要存在于良性病变中，多造成生殖道疣等疾病，被称为低危型[6][7]。
但人为区分的高危型和低危型并不是绝对的，因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型HPV[8]。
引物归类
鸟类1.雀形目38种鸟类线粒体cytb引物：通过软件设计, 得到了cytb 的通用引物, 引物序列为: 5‘- CCTACTTAGGATCATTCGCCCT – 3’和5‘-GTCTTCATCTCCGGTTTACAAGAC – 3‘。
7.鹤的性别鉴定8.鸟类的通用引物（我国部分家鸭品种的DNA条形码初步分析）两栖类通用引物龟类3.亚洲淡水和陆生龟鳖类12S r R N A 基因片段的序列分析和系统发生研究PC R 扩增所用引物为L 1 0 9 1 (5 ’一A A A A A G C T T C A A A C T G G G A T T A G A T A C C CC A C T A T 一3 ’)和H 1 4 7 8 (5 ’一T G A C T G C A G A G G G T G A CG G G CG G T G T G T 一3 ’) (K o e he r e t a l. , 1 9 8 9 ) ,L、H 分别为轻链和重链, 数字与人m tD N A 序列对应P C R 反应体积为1 0 0 拜l, 反应液中含1 om m o l/ L T r is 一H C I, p H 5 . 3 , 5 0 m m o l/ L K C I, 0. 1 % T r ito nx一1 0 0 , 2 .5 m m o l/ L Mg C 12 , 2 0 0 拜m o l/ L 4 种d N T P , 1 0 p m o l z 条引物, zU T a q 酶。
p C R 反应在PE 2 4 0 型PC R 仪上进行, 循环参数为95 ℃变性40 秒, 5 ℃退火60 秒, 72 ℃延伸60 秒, 循环次数为3 5 次。
4.福尔马林保存的龟鳖类动物基因组DNA的提取方法5.Limited efficiency of universal mini-barcode primers for DNA amplification from desert reptiles, birds and mammalsThe mini-barcode (130 bp) was amplified using the primer pair Uni-MinibarF1 (TCC ACT AAT CAC AAR GAT ATT GGT AC) and Uni-MinibarR1 (GAA AAT CAT AAT GAA GGC ATG AGC), as reported earlier (Meusnier et al., 2008). The reactants contained 12 mL FideliTaq PCR master mix (USB Corporation, USA), template DNA (2 mL), each primer (50 nmol in 0.5 mL) in a reaction volume of 25 mL. Besides the standard protocol based on two sequential annealing temperatures (Meusnier et al 2008), we also tested the PCR amplifications using a more stringent (single-annealing) protocol. The thermal cycling conditions for both these protocols are summarized in Table 2. The PCR products were electrophoresed on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide. The bands in the gel were visualized under UV light and evaluated using a Proxima C16 Phi+ gel imaging system (Isogen Life Science, The Netherlands昆虫本研究运用常规的DNA条形码通用引物(Lep-F1, 5’-ATTCAACCAATCATAAAGA TA T-3’; 和Lep-R1, 5’-TAAACTTCTGGA TGTCCAAAAA-3’) (Hebert et al., 2004a)，得到片断长度为652bp。
PCR和简并引物设计
PCR反应体系与反应条件
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在 一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L 时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度 过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度 过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
PCR技术及其在基因同源克隆 中的应用
缪恒彬 2007.05.15
PCR技术的基本原理
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室 的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合 酶链反应( Polymorphism Chain Reaction )。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试 管中给DNA的体外合成提供一种合适的条 件---模板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合 酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及 延伸的温度与时间。
/ 引物分析评价软件：
Oligo 6.0
/BLAST/
选择相关的 氨基酸序列
/blocks/make_blocks.html 递交服务器 进行Block Maker
2.5ul 1.5ul 2.0ul 2.0ul 1.0ul 1.0ul 0.2ul
PCR反应体系与反应条件
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异 性取决于引物与模板DNA互补的程度。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特 别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的 扩增条带。 ④引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严 格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑤引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无 明显同源性。
混合简并引物
混合简并引物1. 简介混合简并引物是一种在分子生物学研究中广泛应用的技术，用于扩增特定DNA序列。
通过使用多个引物的混合，可以提高扩增反应的特异性和灵敏度，从而增加目标序列的检测准确性和成功率。
本文将介绍混合简并引物的原理、设计方法和应用领域。
2. 原理混合简并引物的设计基于引物的碱基序列和碱基对的配对规则。
在DNA扩增反应中，引物与目标DNA序列的两个互补部分结合，形成一个稳定的双链结构。
引物的碱基序列决定了扩增反应的特异性和选择性。
通过引入简并位点，即允许多个碱基在同一位点出现，可以增加引物的变异性，从而提高目标序列的扩增准确性。
混合简并引物的设计过程包括以下步骤：1.确定目标DNA序列：根据研究需要，确定待扩增的目标DNA序列。
2.引物设计：根据目标DNA序列，设计一组简并引物，其中包含多个简并位点。
简并位点可以使用IUPAC碱基代码表示，例如R表示A或G，S表示C或G。
3.引物评估：使用计算工具或软件评估引物的特异性和选择性。
确保引物与目标DNA序列的互补部分匹配，并避免与非目标序列的互补部分匹配。
4.引物合成：将设计好的引物合成，并进行质量检测。
3. 设计方法混合简并引物的设计方法可以根据目标DNA序列的长度和复杂性进行调整。
以下是常用的设计方法：1.单简并位点设计：适用于目标DNA序列较短且没有复杂结构的情况。
在引物的特定位点引入一个简并位点，例如使用Y表示C或T。
这种方法简单快捷，但对于复杂的目标序列可能不够灵活。
2.多简并位点设计：适用于目标DNA序列较长或具有复杂结构的情况。
在引物的多个位点引入简并位点，可以使用多个不同的IUPAC码。
例如，可以使用R、Y、S等表示不同的碱基组合。
这种方法可以增加引物的变异性，提高扩增反应的特异性。
3.引物长度调整：根据目标DNA序列的长度和复杂性，调整引物的长度。
较长的引物可以提高特异性，但也增加了非特异性扩增的风险。
4. 应用领域混合简并引物在分子生物学研究中有广泛的应用，包括：1.基因突变检测：通过扩增目标基因的特定区域，可以检测和鉴定基因突变。
HPV病毒的常用通用引物检测
HPV病毒的常用通用引物检测摘要研究表明，HPV病毒感染与人体多种肿瘤的发生相关。
对感染个体的病毒检测具有重要的疾病诊断、治疗、预防意义。
但目前缺乏可以兼顾敏感性、特异性、操作简单，可以大规模推广使用的可靠检测方法。
对待测样本进行PCR 检测仍是目前实验室最多采用的检测方法。
PCR具有高敏感、易操作的优点，但其反应的灵活性和极高的敏感性，也带来了假阳性和假阴性的问题。
针对HPV 病毒L1序列保守区域设计的通用引物检测，最常被应用于大样本检测。
通用引物可以在一次PCR反应中同时检测多种型别的HPV病毒感染，与序列特异PCR 检测相比，可以大大减少检测的工作量。
但其缺点在于，通用引物仅与某个或少数HPV型序列匹配，而对于多数型别HPV，引物结合区都存在或多或少的碱基错配。
这使得通用引物对不同型别的HPV扩增效率不同。
因此，使用通用引物检测HPV感染时，对于某些与引物匹配较差的HPV型别，其感染情况往往可能被低估。
目前常用的通用引物根据设计原则不同分为三类：1）单一引物如：GP5+/6+。
2）简并引物如：、MY09/11。
3）混合引物如：SPF1/2。
个型通用引物都有其各自的优缺点，需要根据特定试验的目的、条件选用合适的通用引物进行检测。
【关键词】 HPV病毒；通用引物；单一引物；简并引物；混合引物HPV病毒是一种亲上皮细胞的双链DNA病毒，其基因组长约7900bp。
目前约共发现约200多型HPV病毒。
该病毒主要感染皮肤和粘膜的上皮细胞，造成上皮增生甚至恶性转化[1] [2] [3]。
人们已经在生殖道检测到超过40型的HPV，其中许多与宫颈内皮增生及宫颈癌密切相关，如：16、18、31、33、35等，这部分HPV 病毒被称为高危型[4][5]。
而HPV6、11等型别主要存在于良性病变中，多造成生殖道疣等疾病，被称为低危型[6][7]。
但人为区分的高危型和低危型并不是绝对的，因为在一些癌变中确实也存在所谓的低危型HPV[8]。
混合简并引物
混合简并引物【最新版】目录1.混合简并引物的概念和特点2.混合简并引物的应用领域3.混合简并引物的发展前景正文一、混合简并引物的概念和特点混合简并引物（Mixed Hairpin Primers，MHPs）是一种特殊的引物设计方法，它能同时针对多个目标序列进行扩增。
这种方法有效地解决了传统引物设计中特异性和效率的问题，提高了基因检测、基因克隆和基因表达分析等领域的研究效率。
混合简并引物具有以下特点：1.高特异性：混合简并引物能够针对多个目标序列设计，减少了非特异性扩增的可能性。
2.高效率：混合简并引物能够在一次反应中扩增多个目标序列，提高了实验效率。
3.可调控性：通过调整引物浓度和反应条件，可以控制混合简并引物的扩增效果。
二、混合简并引物的应用领域混合简并引物技术广泛应用于以下领域：1.基因克隆：在基因克隆中，混合简并引物可以有效地扩增目的基因，提高克隆成功率。
2.基因表达分析：在基因表达分析中，混合简并引物可以用于实时荧光定量 PCR（qPCR），以研究基因的表达水平。
3.基因突变检测：在基因突变检测中，混合简并引物可以用于扩增特定突变位点，提高检测灵敏度。
4.微生物检测：在微生物检测中，混合简并引物可以用于扩增微生物的特定基因序列，实现快速鉴定和溯源。
三、混合简并引物的发展前景随着生物科学研究的深入，对高效、特异的分子生物学技术需求不断增加。
混合简并引物技术凭借其独特的优势，在基因检测、基因克隆和基因表达分析等领域具有广泛的应用前景。
在未来的发展中，混合简并引物技术有望在以下方面取得突破：1.设计算法的优化：通过优化引物设计算法，提高混合简并引物的特异性和效率。
2.多重扩增技术的发展：发展多重扩增技术，实现在一次反应中对更多目标序列的扩增。
3.应用领域的拓展：将混合简并引物技术应用于更多生物学研究领域，如表观遗传学、蛋白质组学等。