微生物实验

实验一细菌涂片的制备及革兰氏染色

1、制备细菌染色标本时应注意什么？

涂片不要太厚，要均匀，固定的时候一定按照要求，快速，染色脱色时间要控制好2涂片2、固定的意义何在？固定时应注意什么问题？

固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

3、革兰氏染色的原理及染色成败的关键？

机制：结果为阳性（紫色）和阴性（红色）两大类，与细菌细胞壁的结构组成有关。细菌经结晶紫初染和碘液媒染之后，所有细菌都染上不溶于水的结晶紫与碘的复合物，呈深紫色；阴菌的细胞壁含脂类较多，当以95%乙醇脱色时，脂类被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交联疏松，不易收缩，在细胞壁中形成的孔隙较大，复合物极易被乙醇溶解洗脱，最后被红色的染料复染成红色；阳菌与阴菌相反，复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。｛（碱）结晶染色→碘媒染→酒精脱色→①可脱为G+②不脱为G—｝

关键：革兰氏染色四大基本步骤：结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色沙黄复染其中乙醇脱色是关键因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性

实验二培养基的制备

1、为什么在校正培养基pH时,少量培养基时用0.1摩尔每升氢氧化钠,而大量时用1摩尔每升氢氧化钠?

少量培养基在校正时，需要的氢氧化钠少，所以用浓度底的校正的结果会更准确。而大量的就需要大量的，如果还用浓度低得话，结果会准确，但是工作量极大，而换1mol/L的话，结果误差不会很大，综合考虑：在校正大量的培养基时，应使用浓度高的。

2、为什么肉汤培养基在高压灭菌之前ph要略调高些？

牛肉膏中有些物质在加热后会分解出酸性物质导致pH下降。因此初始pH应比需要值高0.2左右。

3、试述普通肉汤和琼脂培养基的主要用途？

琼脂培养基是在实验室做实验时专门配置的，一般植物源琼脂培养基适用于培养真菌一类的微生物；动物源琼脂培养基适用于细菌类微生物培养。动物源琼脂培养基主要成分与肉汤差不多，只是培养基可以根据实验的要求进行调整营养成分，以适应实验要求。琼脂培养基一定会成“冻”，肉汤不一定。

实验三细菌分离培养、移植及培养特性观察

五、注意事项

1、接种环必须做得圆整平滑，使用前后须烧灼灭菌。

2、接种培养基时应严格无菌操作，要尽一切可能防止外界微生物的进入。

3、选择适宜的培养基，如果培养基选择不当，则材料中的细菌就可能难以分离。

4、要注意记录好接种名称及时间。

六、思考题

1、分离培养的目的是什么?何谓纯培养?

分离培养的目的是：主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。

纯培养:把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。

2、在挑取固体培养物上的细菌作平板分区划线时，为什么在每区之间都要将接种环上剩余的细菌烧掉?

在对下一个区划线之前灼烧接种环，可以杀死接种环上剩余的细菌，这样，当接种环再从上个区拉出一条线的时候，环上的细菌数目就少了很多，经过这样的灼烧、划线，环上的细菌数目逐渐减少，最终达到分离出单菌落的目的。

3、培养皿培养时为什么要倒置?

原因1：防止凝结在皿盖上的水蒸气流到培养基表面导致染菌！

2：有利于菌种利用培养基营养，加快生长速度！

实验四细菌的生化实验

1.解释所做生化试验的原理

（1）细菌生化试验

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。（2）糖（醇）类发酵试验

不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。（3）甲基红试验（该试验简称MR 试验）

很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。（4）大分子物质代谢实验．

靛基质（口引睬）试验

某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。

硫化氢试验

某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。

明胶液化实验

某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）

细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

（5）有机酸盐及氨盐利用试验

柠檬酸盐利用试验

柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。