生物质谱技术与方法共50页
生物质谱技术
生命科学被誉为２１世纪的最前沿科学之一，随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学，即蛋白质组学时代。
正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样，后基因组研究也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。
本文拟简述生物质谱技术及其在生命科学领域研究中的应用。
１．质谱技术质谱（ＭａｓｓＳＰｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。
质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。
质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。
质谱分析的基本原理用于分析的样品分子（或原子）在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。
与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱。
通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。
质谱技术的发展质谱的开发历史要追溯到２０世纪初Ｊ．Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ创制的抛物线质谱装置，１９１９年Ａｓｔｏｎ制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。
最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到２０世纪５０年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。
生物质谱技术与方法
A
3
The Nobel Prize in Chemistry 2002
"for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules"
"for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
A
7
质谱仪
质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析器 和检测系统。为了获得离子的良好分析，必须 避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在 和通过的地方，必须处于真空状态。
在进行质谱分析时，一般过程是：通过合适的 进样装置将样品引入并进行气化。气化后的样 品引入到离子源进行电离。电离后的离子经过
适当的加速后进入质量分析器，按不同的m／z
"for his development of nuclear magnetic resonance
spectroscopy for determining the three-dimensional
structure of biological macroon"
通常将能给样品较大能量、生成较多碎片离
子的电离方法称为硬电离方法（如电子轰击
离子化，EI），而给样品较小能量、碎片离
子较少或不生成碎片离子的电离方法称为软
电离方法。
A
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生物质谱中有代表性的离子源
1．电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI) 2．离子喷雾电离（Ion spray Ionization，ISI ）
生物质谱技术与方法
质谱图
质谱分析中，按各离子m/z的顺序及相对 强度大小记录分析结果的图谱即为质谱 图。由于图谱中离子的质量及相对强度 是各物质所特有的，即反映了物质的性 质和结构特点，因此通过质谱解析可以 进行物质的成分和结构分析。
常见的质谱图是经过计算机处理后得到 的棒图（bar graph）。
棒图(bar graph)
0 799.0
1209.84 1239.4
2044.21
1570.45 1439.65
1738.35 1894.26 2047.21
1391.67 1574.12 1724.38
1923.27
2210.10
2066.13
1679.8
2120.2
Mass (m/z)
2470.78 2560.6
2661.87 2807.67 0
3．大气压化学电离(Atmospheric Pressure
Chemical Ionization，APCI)
4．基质辅助激光解吸电离(Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization，MALDI)
5．快原子轰击电离(Fast Atom Bonbardment
Ionization，FAB)
质量精度 = ∣M－M0∣/ m×106 (ppm)
（m为离子质量数的整数）
仪器的质量精度一般应小于10 ppm。
分辨率(resolution，R)
分辨率是指仪器能分离相邻两质谱峰的能力。若 将强度近似相等、质量分别为M和M+M 的两个 相邻峰恰好分开，则质谱仪的分辨率定义为：
R＝m1 / (m2 - m1) ＝m1 / △M
•Quadrupole •Time-of-flight •Ion trap •Magnetic sector •FTMS
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生物质谱技术与方法全解
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
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43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
ห้องสมุดไป่ตู้
生物质谱技术与方法全解
21、静念园林好，人间良可辞。 22、步步寻往迹，有处特依依。 23、望云惭高鸟，临木愧游鱼。 24、结庐在人境，而无车马喧；问君 何能尔 ？心远 地自偏 。 25、人生归有道，衣食固其端。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
生物质谱法
主要作用： ①确定化合物准确的分子式（分子量） ②提供某些一级结构信息 一级→构造 二级→构型 三级→构象
一、质谱计
三个功能： 1）使挥发性不同的化合物气化 2）把气化的分子电离 3）将形成的离子按质-荷比（m/z）分离，
随后检出并记录
构成：
真空系统，进样系统，离子源，质量分析器，
离子检测器，记录器
ABCD ABCD 2e
e
分子离子
ABCD (ABCD)
e
e
n
n1 e （ ）
多电荷离子
ABCD A BCD
AB CD
碎片离子
ABC D
AD BC
ABCD
重排离子
[ABCD ABCD ]
4 快原子轰击（Fast atom bombardment FAB）
三、质量分析器
扇形磁场仪器 ( Magnetic-sector instruments
m B 2r 2 z 2V
四、质谱中术语及离子 1、质谱术语 基峰 质荷比
2、质谱中离子 分子离子 碎片离子 准分子离子
第二节 生物质谱法
四 激光解吸离子化质谱的特征
第三节 电喷雾离子化质谱法
一 ESI原理
1 静电喷雾 2 去溶剂化和离子蒸发
二 影响ESI的因素
1 样品的PKa和溶液的PH值
2 溶剂的性质
3 去溶剂时干燥气体的温度与流速
三 生物分子的ESIMS 1 正离子质谱
2 蛋白质分子量的测定
①系列中相邻峰值相差1个电荷 ②电荷是由于阳离子的加成(通常为质子所致, 因而, 每一个峰代表蛋白质分子加上一定数目 的质子所形成的离子,即[Mr+nH]n+
生物质谱分析技术
2001年，Science杂志把蛋白质组学列为 21世纪六大研究热点之一。
2003年4月14日，科学家宣布人类基因组 计划已经顺利完成，99%的人类遗传密 码被破译，人类基因组图谱提前2年完成 。蛋白质组学被进一步提上日程。
蛋白质组学定义
蛋白质组学(Proteomics) ：是通过大规模研 究蛋白质的表达水平的变化、翻译后修饰、蛋 白质与蛋白质之间的相互作用，以获取蛋白质 水平上疾病变化、细胞进程及蛋白质网络相互 作用的整体综合信息的科学研究。
蛋白质组学常用的两大技术平台
第三部分
生物质谱技术的原理及应用
质谱技术特点
质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，实际上 质谱仪提供的是分子的质量与电荷比(m/z or m/e).
质谱法是一强有力的分析技术。它可用于未知化合物 的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方 面；
所需化合物的量非常低：10-12g, 或10-15 mole； 应用范围广: (1) 有机质谱法：生物、医药、聚合物、
蛋白质研究的复杂性
转录水平调控
蛋白质表达调控 翻译水平调控
翻译后水平调控 蛋白质存在复杂的翻译后修饰，作为生命功能 的行使者，它比基因更能直接地反映生理过程及其 变化。 蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象 复杂性的真实体现。
蛋白质研究的复杂性
细胞周期信号转导图
传统的蛋白质研究方法中存在的问题
面对子系统不独立的可能性，希望寻找新 的 方法来解决子系统间交互作用的问题。
基因组 转录组
合成生物学
蛋白质组 相互作用组
数据整合
模型构建
代谢组
系统干涉
表型组
组学实验
理论计算
系统生物学研究的两大技术方法：组学实验和理论计算
第五章 生物质谱仪器与技术PPT课件
计
检
算
测
机
器
系
统
电子倍增器， 闪烁计数器，等
闪烁计数器：由闪烁体(也称荧光体)和光电倍增管构成
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二、质谱仪的组成
（一）真空系统
覆盖区：凡是有样品分子和离子存在的区域。 作用：降低背景；减少离子间或离子与分子间碰撞所 产生的干扰，如散射、离子飞行偏离、质谱图变宽等； 延长灯丝寿命（残余空气中的氧能烧坏离子源的灯 丝）。 真空度： 1.0×10-4～1.0×10-7Pa。特别是质量分析 器要求高真空度。
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（三）离子源
8.基质辅助激光解吸电离（MALDI）
MALDI： matrix-assisted laser desportion ionization
将样品溶液和基质混匀，干燥成为晶体或半晶 体，在激光（如337nm紫外氮激光）照射下，基 质吸收能量后瞬间由固态转化为气态，将质子转 移给样品分子使其离子化 .
进样系统
真空系统
离子源
质量分析器
检测器
加速器
计算机系统
质谱仪的基本结构框图
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二、质谱仪的组成
进样系统 eg样品板 LC或GC
离子源
++ ++
++
质量分析器
加 速 器
++ + ++++++ ++ ++ +
+++++ + + + +
真空系统
EI源 FAB源 MALDI源 ESI源，等
quadrupole Ion trap time-of-flight, etc
质谱技术
质谱实验质谱分析法（mass spectrometry）是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比（m/z）的不同进行分离测定，来进行成分和结构分析的一种方法。
所得结果用质谱图(亦称质谱，Mass Spectrum)表示。
根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、生物大分子的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。
生物质谱（Bio-mass spectrometry，Bio-MS）是用于生物分子分析的质谱技术。
随着电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MAILDI）技术的完善和成熟，生物大分子的质谱分析才得以实现。
创造这两项技术的美国人约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和日本人田中耕一(Koichi.Tanaka)为此获得了2002年诺贝尔化学奖。
近年来，随着人类基因组计划的实施和“组学”研究日益受到重视，生物质谱在生物分子的分析方面取得了突破性的进展，其技术水平不断提高，应用面不断扩大，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段。
本章主要讨论用于生物样品分析的质谱基本理论及其在生命科学中的应用。
一、实验目的1、通过学习和实验，掌握质谱仪的基本原理2、熟悉仪器软件操作界面3、掌握使用实验设备的技能技巧和程序的调试方法二、实验原理使所研究的混合物或单体形成离子，然后使形成的离子按质荷比(mass-charge ratio)m／z进行分离。
质谱分析法是按照离子的质核比（m/z）大小对离子进行分离和测定从而对样品进行定性和定量分析的一种方法。
质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的分子－离子反应。
离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，汇聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离，当气体或蒸汽分子（原子）进入离子源时，受到电子宏基而形成各种类型的离子，如分子离子，碎片离子，离子分子等。
生物质谱法
功于三大技术的突破:
固相化的pH梯度二维电泳的发明与完善 生物质谱(boi-mass spectrometry)的发展 生物信息学的出现和应用
目前商业化的生物质谱仪的组合分为
离子化方式主要是电喷雾电离与四极杆质量分析器所构成
的仪器称为电喷雾（四极杆）质谱仪（ESI-MS）；
基质辅助激光解吸电离与飞行时间作为质量分析器所构成
常用的ESI的质量分析器，它属于扫描型分析器，大部分离子
在同一时间不能利用，灵敏度相对较低。四极质谱仪检测的 M/Z范围有限，大分子化合物由于ESI过程可形成多电荷离子， 这些离子的M/Z有可能落在四极质谱仪可测定的范围内。因此， 利用价格低廉的四极质谱仪可以测定数万道尔顿的蛋白质的分
子量，测定的质量准确度达到O.1%。四极质谱仪在离子传输区
Ultra EMR Proteomics, Oligonucleotides
1 电喷雾质谱ESI—MS
电喷雾技术由Zeleny于1917年发明，1984年美国耶鲁大 学John Fenn研究首次发表ESI—MS的研究成果，并于4年 后报道运用ESI—MS 首次成功地进行蛋白质分析，从此揭 开ESI—MS 用于生物大分子的研究的一页。 ESI具有从液相中直接取样的优点，对分析物施加相当小 的内能(所以完整的大分子能被检测)并有效的将样品带上极 性和电荷带入气相。含有多于5个或6个残基的多肽几乎总被 观测到呈多质子状态；其电荷状态与其大小和碱性氨基酸存 在的数目成正比。分子量远远超过质谱仪所具有的质量范围 的蛋白质通常可被检测到，因携带足够多的电荷使其产生m ／z小于2000的样峰。且可以方便地与高效液相色谱和毛细 管电泳(CE)等分离技术在线联用，在分析复杂混合物时很有 优势 。
生物质谱分析
质谱仪的发展历史
1906年 在 J.JThomson在实验中发现带电荷离子 电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关 并于1912年制造出第一台质谱仪 飞行时间质量分析器 四极杆质量分析器 质谱仪首次用于多肽测序 离子共振质谱 电喷雾离子源 傅里叶变换离子回旋共振分析器 基质辅助激光解吸电离质谱
1946年 1953年 1959年 1965年 1968年 1974年 1987年
(3)毛细管进样 气相色谱-质谱联用仪
从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引 入质谱仪的离子化室。
液相色谱-质谱联用仪 采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样 品离子进入质谱分析仪。
3. 离子源
质谱仪中产生离子的装臵称为离子源，其功能 是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。 不同的分子离子化所需要的能量不同，因此， 应选择不同的离解方式： 硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。 软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易 破裂或易电离的样品。
质谱技术中的离子源
(1) 电子轰击电离源 样品需经过汽化进入电离区，用约70e V能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使 分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离 ，为硬电离方法。1980年以 前的主要离子化方式， 只能用于有机小分子 (400Da以下)的电离。
第二节
质谱仪
一、质谱仪的工作原理
二、质谱仪的基本结构 1. 真空系统 2. 进样系统 3. 离子源 4. 质量分析器 5. 检测与记录
一、质谱仪的工作原理
样品导 入系统
离子源
质量过滤/分析器
检测器
+ + +
+++ + + + + +++ + ++ + + + + + + + + + + + + + ++ +++ +++
第七章 生物质谱技术
等离子体解吸（plasma desorption, PD） 、快原子轰击（fast atom bombardment, FAB）：几千Da 80 年代末发明了两相软电离质谱技术ESIMS 和 MALDI-TOF-MS.出现生物质谱，使质谱 仪的应用又发生了一次飞跃，开始分析生物 大分子
给生命科学研究带来的影响是革命性的！
由一定能量的一次离子（离子枪）打在样 品靶上溅射产生出二次离子的质谱。如：FAB、 MALDI等。 适合于分析不易挥发、热不稳定的有机大 分子。
离子源 一次离子 样品 质量分析器 检 测 器
二次离子
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分析物质类型
小分子物质：磁质谱、四极质谱、离子阱 提供碎片信息：磁质谱（电子轰击源）、三级四极 质谱、飞行时间质谱（PSD）、电 喷雾串联质谱（Q-TOF）等 大分子物质：生物质谱：基质辅助激光解吸附飞行 时间质谱（MALDI-TOF-MS）、液 相色谱-电喷雾-串联质谱（CapLCESI-Q-TOF-MS）、液相色谱-离子 阱质谱（MDLC-Ion Trap）
19基质简称中文名称英文名称波长sa芥子酸35二甲氧基4羟基肉桂酸sinapinicacid35dimethoxy4hydroxycinnamicacid337nm355nmdhb龙胆酸25二羟基苯甲酸gentisicacid25dihydroxybenzoicacidcca氰基4羟基肉桂酸cyano4hydroxycinnamicacidpa吡啶甲酸picolinicacid3hpa3羟基吡啶甲酸3hydroxypicolinicacid常用基质一些小分子有机酸及其衍生物能很好吸收激光能量20cyanocyano44hydroxycinnamicacidhydroxycinnamicacidpeptidessinapinicacidsinapinicacidfulllengthproteinsfulllengthproteins2525dihydroxybenzoicaciddihydroxybenzoicacidpeptides显微镜下不同基质在靶体上形成的晶体21maldi源激光是脉冲式每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图一般的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累maldi源离子为单电荷离子谱锋与样品组分质量数有一一对应关系适合于多肽与蛋白质混合物分析灵敏度高fmol1015amol101822高灵敏度分析浓度至低fmol或高amoltof分析器可分析大分子量的物质软电离方式主要产生单电荷离子谱图易解析容忍盐浓度