尿激酶的制取和检验

尿激酶的制取和检验

摘要：尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH 8.7左右。目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。成品尿激酶为无色（或米色）澄清或白色冻干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。

关键词：尿激酶；性质；工艺；检验方法；质量标准；

正文：

尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物。它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶, 纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽,从而使血栓溶解。因此, 临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时, 由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白,使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞, 从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以,尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂,而且它是无抗原性问题,可长时间使用。

一、产品性质

尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶,是一种碱性蛋白,等电点在PH8.7左右。为白色非结晶状粉末,易溶于水。稀溶液性状不稳定,必须新鲜配用,且不得用酸性溶液稀释。冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似,也有酯酶的活力。无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。

尿激酶主要有高分子尿激酶(H-UK),分子量为54000和低分子尿激酶(L- UK),分子量为34000两种,前者为天然存在形式,后者为H-UK的降解产物。这两种UK 均有生物活性,但从体外进行的酶动力学试验和临床表明,H-UK比L-UK更有效,因此临床使用上均要求以它为主的产品。

二、尿激酶制法

自20世纪70年代以来,尿激酶的制取方兴未艾,精制方法多有报道,但回收率偏低。我国人口众多,尿源十分丰富,因此以尿为提取尿激酶的原料,比较适合我国国情。由于尿激酶在尿中含量很低,从尿中提取尿激酶的关键是选择恰当的吸附剂。目前我国主要从男性尿液中提取尿激酶有三种方法:浸泡法、沉淀法、吸附法。生产上多采用吸附法,根据选用吸附剂的类型又分为树脂吸附和硅藻土吸附两种工艺。

2.1主要仪器及试剂:

752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产);Sephadex G-50,CM- Sephadex C-50,Bio-GelP-30(Pharmacia);人纤维蛋白原(上海生物制品研究所生产)；尿激酶标准品,凝血酶,纤维酶原(中国药品生物制品检定所生产)；其他

试剂均为国产分析纯或化学纯。

2.2 UK粗品制备:

吸附:用搪瓷缸收集新鲜男性尿,在搅拌下加尿量0.12%(W/V)HD-2树脂,搅拌吸附50min。用尼龙布过滤,弃去尿液,收集树脂装柱；

洗脱:将树脂用少量水洗涤后用0.1%氨水(电导率为22.5mΩ)洗脱,收集洗脱液，回收树脂；

盐析:将洗脱液移入搪瓷桶中,在搅拌下加入固体硫酸铵粉末至0.65饱和度,待全部溶解后,在0℃放置6~8h,然后过滤,收集盐析物,即得到粗品。

Sephadex G-50凝胶过滤除盐:将UK粗品用预冷至0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK含量为(2~3)×104IU/mL的UK水溶液,立即用冷冻离心机分离,收集上清液,用2mol/L盐酸或2mol/L氢氧化钠溶液调pH6.5。将此溶液上Sphadex G-50凝胶柱(此柱预先用pH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),上样体积控制在柱床体积的15%~25%,收集流出液中含UK部分。

GM-Sephadex C- 50离子交换层析:将上述收集到的UK溶上GM-Sephadex C- 50离子交换层析柱(此柱预先用PH6.5,0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡),加一个床体积的柱平衡液洗涤后,用0.6mol/L的氯化钠溶液洗脱,收集UK活力部分。

硫酸铵沉淀:在上一工序收集的UK溶液中缓缓加入固体硫酸铵(每升溶液加430克),边加边搅拌,直至加入的硫酸铵溶解,随即用冷冻离心机分离,收集UK沉淀物。

Bio-Gel P-30凝胶过滤:将UK沉淀物用0~5℃的无热原蒸馏水溶解,制成UK 含量为(5~10)×10-4IU/mL的溶液,上Bio-Gel P-30凝胶柱(此柱预先用0.3mol/L的氯化钠溶液平衡),上样量控制在柱床体积的8%~12%,随时监测流出液的UK活力,收集第一个流出峰部分,即H-UK部分。

产品的除菌及冷冻干燥:将上工序收集的H-UK溶液添加1%~5%的甘露醇做赋形剂(加量多少依产品效价要求和冷冻干燥情况而定),用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后,立即进行冷冻干燥,冷冻干燥后的UK为粉状产品,密封于容器内置0~5℃下保存。

三、尿激酶检验

3．1生物学活性测定

采用溶圈法。称取125mg琼脂糖,加入23ml生理盐水,煮沸溶解,60℃水浴平衡,加凝血酶14μl(100IU/ml),纤溶酶原280μl(0.5mg/ml),边加边摇匀,加入人纤维蛋白原2.2ml(6mg/ml),摇匀,混浊后马上倒平板(直径9cm),水平放置,充分凝固后,4℃冰箱放置至少0.5h待用(应在2d内使用)。将尿激酶标准品用生理盐水稀释至200、100、50、25和12.5IU/ml待测样品用生理盐水稀释至约

50IU/ml(成品)或5μg/ml(原液)。在制备好的纤维蛋白平板内打孔(直径2mm),每孔点样6μl每个样品2孔,放置37℃湿盒中16h后,纵横两次量取点样板溶圈直径,以标准品各个稀释度活性的对数为横坐标(x),溶圈直径的平均数(4次量取的数值)的对数为纵坐标(y),采用生物统计软件分析结果。利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线,并求得y=a+bx中的a和b及线性回归系数r值,根据样品的溶圈直径,计算样品活性。

3．2单链比例测定

采用发色底物法。将Thermolysin用pH7.5、0.1mol/L NaCl，0.01% Tween-20，0.01mol/L氯化钙，0.05mol/L Tris缓冲液稀释成3.0mg/L；S-2444用pH7.5、0.1mol/L NaCl，0.01% Tween-20,0.05 mol/L，Tris缓冲液稀释成1.5mg/ml；尿激酶标准品用pH 7.5、0.1mol/L NaCl；0.01% Tween-20,0.05 mol/L，Tris 缓冲液稀释成100、80、60、40和20IU/ml；u-PA样品用pH7.5、0.1mol/LNaCl，0.01% Tween-20,0.01mol/L氯化钙,0.05mol/L Tris缓冲液稀释成40 IU/ml。

3.3样品总活性的测定:

在96孔酶标板上,分别加入稀释样品100μl Thermolysin 20μl，37℃孵育 1 h,在激活的样品中加入Aprotinin(5×105IU/ml)20μl和S-2444(1.5mg/ml)60μl 37℃孵育,1.5h内每间隔20min,在405 nm处测定A值。以反应时间为横坐标,A值为纵坐标,分别作各浓度UK标准品溶液和待检品的生色速率曲线,线性回归得出线性方程,得到不同浓度标准品和待检品直线方程的斜率。以各浓度UK标准品溶液的斜率为纵坐标,UK活性的浓度为横坐标作图,得到用显色底物测定UK浓度的标准曲线,线性回归得到标准方程。将待检品的生色速率直线的斜率代入标准方程中,可计算出待检品的活性,再乘以稀释倍数,即可得到待测样品的总活性。

3.4样品双链活性的测定:

在96孔酶标板中加入含tcu-PA (40 IU/ml)的稀释样品100μl，pH 7.5 Tris 缓冲液20μl，Aprotinin(5×105IU/ml)20μl和S-2444(1.5mg/ml)60μl 37℃孵育,在1.5 h内每间隔20min,于405nm处测定A值。同4.1法计算出待测样品中双链活性。

3.5单链比例的计算:

总活性与双链活性之差即为单链的活性。单链的活性与样品的总活性之比即为单链在样品中的比例。

3.6纯度分析

采用SECOHPLC法,参照《中国药典》三部(2005版)进行。洗脱液: pH 7.0,0.1mol/L PB,400 mmol/L NaCl,色谱条件:流速0.9 ml/min;上样量10μl(2.0mg/ml),柱温25℃,检测波长280 nm,样品池温度8℃。用WATERS 2690HPLC 系统对实验结果进行数据处理,用面积归一化法算出其纯度。

3.7相对分子质量测定

采用还原型SDSOPAGE法。

3.8其他指标的检测

等电点、肽图、蛋白质含量、残留DNA、鉴别试验等按文献及《中国药典》三部(2005版)进行。