黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
目录
第一章绪论 (1)
第二章罐体几何尺寸的确定 (2)
2.1夹套反应釜的总体结构 (2)
2.2 几何尺寸的确定 (2)
第三章罐体主要部件尺寸的设计计算 (5)
3.1 罐体 (5)
3.2 罐体壁厚 (5)
3.5人孔和视镜 (6)
3.6接口管 (6)
3.6.1 管道接口（采用法兰接口） (6)
3.6.2 仪表接口 (7)
第四章冷却装置设计 (8)
4.1 冷却方式 (8)
4.2 装液量 (8)
4.3 冷却水耗量 (9)
4.4 冷却面积 (9)
第五章搅拌器轴功率的计算 (10)
5.1不通气条件下的轴功率P0 (10)
5.2通气搅拌功率Pg的计算 (11)
5.3电机及变速装置选用 (11)
第六章结论 (13)
参考文献 (13)
第一章绪论
我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。
糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉A.S.3.4309是国内糖化酶活性最高的菌株之一。
糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。
综合温度、PH等因素选择黑曲霉A.S.3.4309菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为4.5，培养基为玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。
主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉2.5%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。
发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。
发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。
这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本視图，和各种表达方式，
有合理的选择比例，大小，和合理的安排幅面。说明书就是要写清楚设计的思路和步骤。
表1-1 发酵罐主要设计条件
项目及代号参数及结果备注
发酵菌种黑曲霉A.S.3.4309菌株根据参考文献[1]选取
工作压力0.3MPa 由工艺条件确定
设计压力0.3MPa 由工艺条件确定发酵温度（工作温度）33℃根据参考文献[1]选取冷却方式蛇管冷却由工艺条件确定
培养基玉米粉2.5%,玉米浆2%
豆饼粉2%组成
根据参考文献[1]选取
发酵液密度由工艺条件确定
发酵液黏度由工艺条件确定
第二章罐体几何尺寸的确定
2.1夹套反应釜的总体结构
夹套反应釜主要由搅拌容器，搅拌装置，传动装置，轴封装置，支座，人孔，工艺接管和一些附件组成。搅拌容器分罐体和夹套两部分，主要由封头和筒体组成，多为中、低压压力容器；搅拌装置由搅拌器和搅拌轴组成，其形式通常由工艺设计而定；传动装置是为为带动搅拌装置设置的，主要由电机，减速器，联轴器和传动轴等组成；轴封装置为动密封，一般采用机械密封或填料密封；它们与支座，人孔，工艺接管等附件一起，构成完整的夹套反应釜。
2.2 几何尺寸的确定
根据工艺参数和高径比确定各部几何尺寸；高径比H/D=2.5，则H=2.5D
初步设计：设计条件给出的是发酵罐的公称体积（30M3）
公称体积V－－罐的筒身（圆柱）体积和底封头体积之和
全体积V
0－－公称体积和上封头体积之和
1020/
kg m
ρ=
32
1.9610/
N s m
μ-
=??
封头体积 )6
1(4642221D h D h D h D V b a b +=+=
πππ ????????? ?
?
++=
D h H D V b 612420π （近似公式） 假设2/=D H o ，根据设计条件发酵罐的公称体积为30M 3
由公称体积的近似公式 ()23
040.15V D H D π=+ 可以计算出 罐体直径，D=2592.96862mm 罐体总高度
取整为6480
查阅文献[2} ，当公称直径mm DN 2600=时，标准椭圆封头的曲面高度
mm D h a 5754/1==，直边高度40b h mm =，总深度为mm H f 690=，内表面积m A f 65.72=，
容积m V f 351.2=
可得罐筒身高
mm H H H f 51006902648020=?-=-=
则此时961538462.12600/5100/0==D H ，与前面的假设2/=D H o 相近， 故可认为mm D 2600=是合适的 发酵罐的全体积
m m V H V f 332020.30097.3251.22510026004/2D π/4≈=?+??=+=π
搅拌叶直径取mm D i 800=，其中31.02600/800/≈=D D i 符合3/1~2/1/=D D i 根据文献[3]搅拌叶间距mm D S i 160080022=?== 底搅拌叶至底封头高度mm D C i 800==
mm D H 4216.64825.2.==
表2-1大中型发酵罐技术参数
表2-2 30m 3发酵罐的几何尺寸
公称容量
3m
筒体高度 H(mm) 筒体直径 mm 换热面积
转速 r/min 电机功率 kw 10 3200 1800 12 150 7.5 21 4700 2200 21 154 30 30 6600 2400
34
180 45 50 7000 2800-3000 38-60 160 55 60 8000 3000-3200 65 160 65 75 8000 3200 84 165 100 100 9400 3600 114 170 130 200
11500
4600
221
142
215
项目及代号 参数及结果
备注 公称体积3
m 30 设计条件 全体积3
m 32 计算 发酵罐总高mm 6500 计算 发酵罐筒体高度mm 5100 计算 搅拌叶直径 800 计算 椭圆封头短半轴长mm 650 计算 椭圆封头直边高度mm 40 计算 底搅拌叶至封头高度mm 800 计算 搅拌叶间距mm
1600 计算
2
m
第三章 罐体主要部件尺寸的设计计算
3.1 罐体
考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料和封头材料，封头结构、与罐体连接方式。因糖化酶是偏酸性（pH 值为4.5），对罐体不会有太大腐蚀，所以罐体和封头都使用16MnR 钢为材料，封头设计为标准椭圆封头，因D>500mm ，所以采用双面缝焊接的方式与罐体连接。
3.2 罐体壁厚
[]()()mm mm C p pD 87.533
.08.017022600
3.021≈+-???=+-=
?σδ，取mm 6
D －罐体直径（mm ） p －耐受压强 (取0.3MPa) φ － 焊缝系数，双面焊取0.8
[σ]－设计温度下的许用应力（kgf/c 2m ）（16MnR 钢焊接压力容器许用应力为150℃，170MPa ） C －腐蚀裕度，当δ －C<10mm 时，C ＝3mm
3.3 封头壁厚计算
[]()()mm mm C KPD t i d 6.938
.017023
.226003.02=+????=+=
?σ，取mm 10。 D i －罐体直径（mm ） P －耐受压强 (取0.3MPa) K －开孔系数，取2.3 φ － 焊缝系数，双面焊取0.8
[σ ] －设计温度下的许用应力（16MnR 钢焊接压力容器许用应力为150℃，170MPa ）
3.4 搅拌器
采用涡轮式搅拌器，选择搅拌器种类和搅拌器层数，根据d 确定h 和b 的值
尺寸：六平叶涡轮式搅拌器已标准化，称为标准型搅拌器；搅动液体的循环量大，搅拌功率消耗也大；查阅文献[2]可知30M 3
发酵罐采用6-6-6弯叶式搅拌叶,叶径mm d 800=，则可以计算出
盘径mm d d i 60075.0==， 叶高mm d h 2403.0==
叶长mm d b 20025.0==
3.5人孔和视镜
人孔的设置是为了安装、拆卸、清洗和检修设备内部的装置。
本次设计只设置了1个人孔，查阅文献，选取标准号为： HG21518-95、公称压力为2.5MPa 、直径为500mm 、高度为393mm 的人孔， 开在顶封头上，位于左边轴线离中心轴500mm 处
视镜用于观察发酵罐内部的情况。
本次设计只设置了1个视镜，标准号HG21505-1992，直径为DN=100mm ，高度为52mm ，开在顶封头上，位于右边轴线离中心轴500mm 处，与人孔位于同一水平线上
3.6接口管
以进料口为例计算，
设发酵醪液流速为1/v m s =，2h 排尽。
发酵罐装料液体积：3016.25328.0m V =?=?=νφ 物料体积流量()s m h V Q /00356.023600/6.252/21=?==， 则排料管截面积200356.01/00356.0/m v Q F ===，
又20.785F d =，得d=0.076m ，取无缝钢管，查阅资料[3]，平焊钢管法兰HG20593-97，取公称直径80mm ，mm 480?φ。其他管道也是如此计算。
3.6.1 管道接口 （采用法兰接口）
进料口：直径角度与水平线夹角45度，开在封头上，大约人孔与视镜中间，角度垂直；
排料口：mm 480?φ，开在罐底中间通风管旁；
进气口：mm 480?φ，开在封头上，角度与水平线夹角45度；
排气口：mm 480?φ，开在封头上进气口以封头跟人孔中心连线为对称轴的对称位置上，角度与水平线夹角45度；
冷却水进、出口：mm 480?φ，开在罐身，角度与水平线夹角45度； 补料口：mm 480?φ，开在封头上，角度与水平线夹角45度； 取样口：mm 480?φ，开在封头上，角度与水平线夹角90度；
3.6.2 仪表接口
温度计；装配式热电阻温度传感器Pt100型，D ＝100mm ，开在罐身上；
压力表；弹簧管压力表（径向型），d 1=20mm ，精度2.5，型号：250Y Z -，开在封头上； 液位计：采用标准：51368HG - 型号：61R - 直径：550(26014)mm φ?，开在罐身上； 溶氧探头：SE N DO F ---；pH 探头：2PHS -型；
表3-1 发酵罐主要部件尺寸的设计计算结果
项目及代号 参数及结果 备注
罐体材料 16MnR 钢 由工艺条件确定 焊接方式 双面缝焊接
由工艺条件确定 罐体筒壁厚 6mm 计算 搅拌器类型 六弯叶涡轮式搅拌器
根据参考文献[3]
选取 搅拌叶直径 mm 800
计算
搅拌器层数 3
由工艺条件确定 人孔 1个，标准号HG21518-95 根据参考文献[3]选取 视镜
1个，标准号HG21505-1992
根据参考文献[3]选取 进、排料口直径 mm 480? 根据参考文献选取 进、出气口直径 mm 480?φ
根据参考文献[3]选取 冷却水进、出口直径 mm 480?φ 由工艺条件确定 补料口直径 mm 480?φ
根据参考文献[3]选取 取样口直径 mm 480?φ
由工艺条件确定 温度计
装配式热电阻温度传感器Pt100 D ＝100mm
压力表 250Y Z - 液位计 61R -
溶氧探头 SE N DO F ---
pH 探头
2PHS -型
第四章 冷却装置设计
4.1 冷却方式
发酵罐容量大，罐体的比表面积小。夹套不能满足冷却要求，使用蛇管冷却，使用水作冷却介质。
4.2 装液量
设计发酵罐装料系数：取80% 发酵罐装料液体积：
316.25%8032m V =?=?=装料系数全体积 不计算下封头时的装液体积：V V =-1柱下封头体积
m 1.235.26.25-V 31=-==下封头体积柱V
装液高度：()()m 353.46.2785.0/1.234/D /221=?==π柱V h 单位时间传热量＝发酵热×装料量
即：h Q Q /kJ 4300806.2516800V 1=?=?=发
表4-1 各类发酵液的发酵热
发酵液 发酵热(kJ/3m ·h)
青霉素丝状菌 23000 青霉素球状菌
13800 链霉素 18800 四环素 25100 红霉素 26300 谷氨酸 29300 赖氨酸 33400 柠檬酸
11700
黑曲霉 16800
4.3 冷却水耗量
由实际情况选用进出口水温为20℃ 、26℃，则
()()
()h kg t t C Q W P /74582
.171232026186.4430080
12=-?=-=
Q －单位时间传热量
Cp －冷却水的平均比热，取4.186 kJ/(kg ·℃) t 2-t 1－冷却水进出口温度差
对数平均温度差 ，由工艺条件知道F t =33℃，
()()()()C t t t t t t t t t o F F F F m 69.9263320
33lg
303.226332033lg 303.22121=-----=-----=
? t1－冷却水进口温度 t2－冷却水出口温度
F t －发酵温度
4.4 冷却面积
m t K Q A m 23
36.2369
.9109.1430080
=??=?=
△tm －对数平均温度差
K －传热总系数，取1.9?310 kJ/(m 2 ·h ·℃) 冷却面积(2m ) A=πdL
冷却蛇管总长度(m)
m A L 5.37L 4m 150L ,m 79.14805.014.336.23d 0===?==
组，每组长，分为取整π d －蛇管内径，d ＝外径－壁厚 取φ57×3.5mm （径取50－80mm ，壁厚取3.5－5mm ） 每圈蛇管长度
9.42l m ===
D －蛇管圈直径，3m
hp －蛇管圈之间的距离，取0.15m 每组蛇管圈数
圈442
.95.370≈==
l L N p ，则总圈数为4×4=16圈 蛇管总高度()()m h N H p p 25.215.01161=?-=-=
表4-2 203m 发酵罐冷却装置设计计算结果
项目及代号 参数及结果 备注
装料系数 80% 由工艺条件确定 装料体积 25.6m 3
计算 装料高度 m 353.4
计算 总发酵热 430080kJ/h
计算 冷却水耗量 74582.17123kJ/h
计算 冷却面积
23.36m 3 计算 冷却蛇管总长度 150m 计算 冷却蛇管总高度
2.25m 计算
蛇管组数 4组 由工艺条件确定 每组蛇管圈数 4圈
计算
第五章 搅拌器轴功率的计算
5.1不通气条件下的轴功率P 0
取发酵醪液黏度321.9610/N s m μ-=??，密度31020/k g m ρ=，搅拌转速
200/m i n r ω= 则雷诺准数
()5
3
33108.810
96.110208.060/200Re ?=???==-μρωL i D 因为Re ≥4000，所以发酵系统充分湍流状态，此时X=0，()()y
rm x
F K Re N p =在
全挡板条件下，液面未出现漩涡，即y=0，则N p =k ，查文献[4]得P N =K=4.8
鲁士顿(Rushton J. H.)公式：
kw D N P i L p 42.598.010********.45
3
5
30=????
? ???==ρω
P 0－无通气搅拌输入的功率（W ）；
P N －功率准数，是搅拌雷诺数ReM 的函数；圆盘六弯叶涡轮 NP ≈4.7
ω－涡轮转速（r/min ）；
L ρ－液体密度（kg/m 3）因发酵液不同而不同，一般取800－1650 kg/m 3 ； i D －涡轮直径（m ）
；由于工业发酵罐一般在同一轴上安装很多层搅拌器
又由于H=64800mm ，搅拌叶间距S=1600mm ，得m ()()kw m P P m 724.13036.04.042.596.04.00=?+?=+= m-------搅拌器层数。 5.2通气搅拌功率Pg 的计算 因为是非牛顿流体，所以用以下公式计算 45 .056.032? ?? ? ??=Q D P C P i m g ω C －系数，/3i D D = 时，取0.157 m P －多层搅拌输入的功率（kW ） ω－涡轮转速（r/min ），取200 r/min i D －涡轮直径（m ），0.8m Q －通气量（3m /min ），取1－6 3m /min ，取1.423m /min 计算kW Q D P C P i m g 572.4556 .08 .0157.056 .042.120042.593 2 45 .03 2 45 .0=?==??? ? ? ????? ? ? ?ω 5.3电机及变速装置选用 根据搅拌功率选用电动机时，应考虑传动装置的机械效 率。 g P －搅拌轴功率 T P －轴封摩擦损失功率，一般为00g 1P η－传动机构效率 g T P P P η += 根据生产需要选择三角皮带电机。三角皮带的效率是 0.92，滚动轴承的效率是 0.99，滑动轴承的效率是0.98，端面轴封摩擦损失功率为搅拌轴功率的 1%，则电机的功率 ()kw P P P T g 57.51%1198 .099.092.085.49=+???=+=η 搅拌轴直径1/3(/)d A P n =?，n 为转速（单位为转/分），系数A 可以取97-149， 取100,A = 已知() mm r n kw P 64.6320057 .51100d min,/200,57.513 1=? ===则得，根据文 献选轴径为85mm 。 表4-3 发酵罐搅拌功率的设计计算结果 项目及代号 参数及结果 备注 转速 200/min r 根据参考文献选取 不通气条件下的轴功率 kW 42.59 计算 多层搅拌器轴率 kW 648.65 计算 通气量 31.42m /min 由工艺条件确定 通气搅拌功率 kw 572.45 计算 电机的功率 kw 57.51 计算 电机的选择 型号Y280S-8 功率kW 55 转速740/min r 根据参考文献[3]选取 轴径 85mm 根据参考文献[3] 选取 传动装置 三角皮带 根据参考文献[3] 选取 三角皮带型号和根数 6D ?根 根据参考文献[3]选取 小皮带轮直径 300mm Φ 根据参考文献[3]选取 大皮带轮直径 1100mm Φ 根据参考文献[3]选取 第六章结论 在此次工艺设计作业中，我设计了机械通风发酵罐，该反应器利用黑曲霉菌株菌种进行糖化酶的发酵生产，发酵温度为33℃，反应器的材料为16MnR钢；采用涡轮六弯叶式三层搅拌器，利用55kw电动机通过85mm的轴驱动；冷却方式为蛇管冷却，冷却蛇管总长为15m，分为4组。 通过这次设计，我学会怎么设计机械通风反应器，并学会一些基本的设计的步骤，以及认真的态度。这次我的设计是由最开始的计算到数据的整理在到画图，以及在后来的说明书的的拟订。虽然是困难重重，但终于完成了。总的感觉就的好累啊，可是深切体会到书到用时方恨少，真的不能临时抱佛脚。在这里要感谢的指导，同学的帮助。 参考文献 [1]齐香君. 现代生物制药工艺学[M]. 北京：化学工业出版社，2003.9 [2]潘红良赫俊文. 过程设备机械设计[M]. 杭州：华东理工大学出版社， 2006.4 [3]吴思芳. 发酵工厂工艺设计概论[M]. 北京：中国轻工业出版社， 2006.7 [4]郑裕国薛亚平金利群等.生物加工过程与设备[M]. 北京：化学工业 出版社，2004.7 黑曲霉发酵生产α-淀粉酶 前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者Y asujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。 通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。 正文： 一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理 1.蒸汽系统： 蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统： 空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统 南阳理工学院 本科生毕业设计 学院（系）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生： ******* 指导教师：李慧星 完成日期 2010 年 5 月 南阳理工学院本科生毕业设计 年产5000吨糖化酶发酵车间设计 The design of annual output of 5000 tons of glucoamylase fermentation factory workshop 总计：毕业设计（论文）28页 表格： 5 个 插图： 1 幅 南阳理工学院本科毕业设计 年产5000吨糖化酶发酵车间设计 The design of annual output of 5000 tons of glucoamylase fermentation factory workshop 学院（系）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：郭留洋 学号：***** 指导教师：****** 评阅教师： 完成日期：2010年5月 南阳理工学院 Nanyang Institute of Technology 年产5000吨糖化酶发酵车间的工艺设计 生物工程专业郭留洋 【摘要】糖化酶是工业生产的主要酶制剂之一，广泛用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面。本设计以玉米淀粉为主要原料，利用黑曲霉，采用机械搅拌通风罐进行发酵生产，完成生产5000吨糖化酶发酵车间工艺设计，通过工艺流程设计、工艺衡算、设备选型和车间布置设计，设计出生产5000吨糖化酶发酵车间采用3个75m3发酵罐和3个6m3种子罐等，并依据生物工程工厂车间布置原则，对发酵罐车间进行合理布置，绘制了工艺流程图和车间布置图，工艺设计的结果为糖化酶的生产提供一定参考。 【关键字】糖化酶工厂设计深层发酵黑曲霉 目录 第一章绪论 (1) 第二章罐体几何尺寸的确定 (2) 2.1夹套反应釜的总体结构 (2) 2.2 几何尺寸的确定 (2) 第三章罐体主要部件尺寸的设计计算 (5) 3.1 罐体 (5) 3.2 罐体壁厚 (5) 3.5人孔和视镜 (6) 3.6接口管 (6) 3.6.1 管道接口（采用法兰接口） (6) 3.6.2 仪表接口 (7) 第四章冷却装置设计 (8) 4.1 冷却方式 (8) 4.2 装液量 (8) 4.3 冷却水耗量 (9) 4.4 冷却面积 (9) 第五章搅拌器轴功率的计算 (10) 5.1不通气条件下的轴功率P0 (10) 5.2通气搅拌功率Pg的计算 (11) 5.3电机及变速装置选用 (11) 第六章结论 (13) 参考文献 (13) 第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉A.S.3.4309是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉A.S.3.4309菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为4.5，培养基为玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉2.5%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本視图，和各种表达方式， 淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化 摘要：淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一， 为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对 菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方 法对其发酵条件进行优化，实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活 性进行了测定。 关键词：淀粉酶；分离筛选；紫外线诱变；优化；提纯 1、引言 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。 我国是传统的农业大国，发展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情况直接关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。所以，改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。 显然，改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。 那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。 2、材料与方法 2. 1 实验材料 2．1．1 样品：贵师大综合楼附近的土壤 2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液 2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻 1.菌种特点： 米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵 两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液 α-淀粉酶综述 佚名2013-10-06 摘要：α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用发展史、分离纯化及结构的研究史、催化机制及其研究史、工业化生产和应用现状与发展趋势等。 关键词：α-淀粉酶发现应用分离纯化结构催化机制研究史发展趋势 α- 淀粉酶( α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中, 是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。 1 α-淀粉酶的发现和应用史 1.1 α-淀粉酶的发现 啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖。这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚，直到淀粉的发现。 在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff（1815年）做了一个巧妙的实验。他将4份的冷水加入到2份的淀粉中，并边加边搅拌。之后加入20份的沸水使其形成一层厚厚的淀粉糊。在淀粉糊还是余温的时候，加入被粉碎的麸质（或麦芽），然后在40－60°列式温度下水浴。1－2小时后发现，淀粉糊开始缓慢液化。8－10小时后，淀粉糊被转化为一种甜的溶液。之后，他将其通过过滤和蒸发浓缩得到了糖浆，品尝后发现，其和发酵液一样甜。在操作的过程中，他注明了实验过程中仅添加了非常少的麸质，并且得到的糖浆与淀粉的量成正比。此外，如果在加入麸质前加入几滴高浓度的硫磺酸，最终就没有糖生成。从这个实验中他得到结论1）麸质是一种能够使温水中的淀粉粉末转化为糖的物质。2）作为种子发芽的结果，相比种子内的物质而言，麸质能过将更多的淀粉转化为糖。至此,Kirchhoff奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。 1.米曲霉是一种好气性真菌,菌丝一般呈黄绿色,米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 米曲霉在工业上的应用：用于发酵生产豆豉、豆酱；与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产；用于饲料工业；用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料。 2.葡萄糖淀粉酶又称γ一淀粉酶, 简称糖化酶，糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得,从细菌中也分离到热稳定的糖化酶, 人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶生产方法： a.黑曲霉固体发酵法 工艺流程:试管菌种→三角瓶款曲扩大培养→帘子曲种→通风制曲→成品。 b.液体深层发酵法. 工艺流程:试管斜面种子→种子扩大培养→发酵→过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂。 糖化酶成品提取工艺 成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2 种, 而固体酶的制备方法又可 分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等, 采用一条合理的提取工艺, 可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本. 目前国外糖化酶生产一般采用液体深层培养, 发酵罐最大可达200m , 罐体都采用不锈钢制造, 冷却系统采用罐外冷却盘管关键阀门都采 用隔膜阀, 培养基可在罐内灭菌, 也可用薄板冷却器作连续灭菌, 并装有节能器, 发酵过程中的控制参数有搅拌功率、溶解氧、空气 中的二氧化碳与氧气量以及温度、P H 等。 糖化酶处理技术： 糖化酶的处理工艺过程分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的沉淀干燥四个工序。国外采用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶;采用的有机高分子絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸(或钠盐) 、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等。国内外最普遍采用的固液分离设备是板框压滤机, 除此以外, 国外还有管式、多室式、碟式及篮式离心机, 国内主要采用篮式离心机, 也有少数管式离心机的厂家。国内外糖化酶的浓缩方式已从蒸发浓缩发展到超滤浓缩。目前采用的超滤装置有搅拌室式、浅道式系统、套筒膜式和中空纤维。沉淀酶方式, 国内外仍普遍用硫酸钱或硫酸钠等中性盐类盐析糖化酶。 3.植酸提高米曲霉产糖化酶能力: 大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在 酿酒酵母中的表达和分泌 3罗进贤 李政海 李文清 (中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275) 摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精. 关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌 酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌. 1 材料和方法 111 材料 11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒. 11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目 中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月 目录 第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为，培养基为玉米粉%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本视图，和各种表达方式，有合理的选择比例，大小，和合理的安排幅面。说明书就是要写清楚设计的思路和步骤。 第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 2010 92 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03 黑曲霉生产糖化酶及酶活测定 单 海 艳 （牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000） 摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。 关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言 （一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位 黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。 2．黑曲霉形态、生理、生态特性 孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。 3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。 （二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位 糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。 2．糖化酶的性质 糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。糖化酶是一种胞外外切酶，但其专一性低，主要是从淀粉链的非还原性末端切开α-1.4-键。一般淀粉水解程度达80％。 （1）糖化酶中糖和蛋白组成 糖化酶是一种糖蛋白，通常碳水化合物占4%-18％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖，糖化酶残基的排列在其热和酸碱稳定性上有特殊意义。 （2）糖化酶组分多型性 真菌产生的糖化酶组分多型性是常见的，市售的糖化酶中可分离出葡萄糖酶?和葡萄糖酶И两种组分。而市售黑曲霉生产的糖化酶曾分离出六种活性组分，每种均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖。这六种组分的分子量，沉淀系数，化学组分，等电点，酶的动力学及其它性质各异。培养基成分和的生产条件对糖化酶组分多型性也有影响，天然糖化酶在微生物培养或酶的制备过程中可能受葡萄糖苷酶和蛋白酶的作用而成多型性的酶类。 （3）糖化酶的热稳性 工业用的糖化酶都是利用它的热稳性，α-环状糊精可提高糖化酶的热稳性，最适温度范围一般为50℃～60℃。 （4）从酶PH 稳定性上看： 糖化酶具较宽的PH 值适应范围，但最适PH 为4-5。 （5）Ca 离子与酶结合后可使结构变得松散些，更有利于催化反应。 （6）糖化酶与底物亲和性 收稿日期：2009-11-26 作者简介：单海艳（1977—），女，牡丹江大学化工系讲师，研究方向：生物教学。 DOI:10.15907/https://www.360docs.net/doc/1d6212745.html,ki.23-1450.2010.07.036 我国糖化酶的研究概况 糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。主要的内容包括：一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。 糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。 三、糖化酶的特性 1、糖化酶的热稳定性 在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生 实验四黑曲霉发酵生产柠檬酸 【目的要求】 1. 掌握实验室菌种种子生产方法。 2. 掌握柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 3. 熟悉并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况； 4. 掌握钙盐法提取柠檬酸的原理与方法。 【基本原理】 黑曲霉发酵生产柠檬酸实验中需要大量活化的孢子，其制备是采用麸皮培养基中保藏的黑曲霉孢子，在新的麸皮培养基上于适当的温度下活化并大量繁殖，从而产生大量活化孢子。 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）转变为丙酮酸；丙酮酸氧化脱羧形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环不能充分进行，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O 以薯干粉或玉米粉为原料的黑曲霉柠檬酸发酵液，除了含有大量柠檬酸外，还有大量的菌体，少量没有被黑曲霉利用的残糖、蛋白质、脂肪、胶体化合物以及无机盐类等。柠檬酸提取就是从成分复杂的发酵液中分离提纯获得柠檬酸。从柠檬酸发酵液中提取柠檬酸的方法主要有：钙盐-离子交换法、溶剂萃取法、“吸交”法、离子色谱法等。目前国外生产主要采用钙盐-离子交换法和溶剂萃取法；国内生产主要采用钙盐-离子交换法，“吸交”法和离子色谱法正在推广中。 钙盐法首先采用过滤或超滤除去发酵液中的菌丝体等不溶残渣，然后在澄清过滤液中加入碳酸钙（或氢氧化钙）发生中和反应，生成难溶的柠檬酸钙沉淀，利用在80-90℃下柠檬酸钙的溶解度极低的特性，通过过滤（或离心）将它与可溶性的糖、蛋白、氨基酸、其它有机酸、无机离子等杂质分离开，用80-90℃热水反复洗涤柠檬酸钙，除去残糖和其他可溶性杂质，经过滤（或离心）获得较净的柠檬酸钙，然后在洗净的柠檬酸钙中缓慢地加入稀硫酸进行酸解反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，经过滤（或离心）除去硫酸钙沉淀，获得粗制的柠檬酸。其主要反应式为： 2C6H8O7·H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）2·4H2O +3CO2 +H2O 米曲霉在食品中的应用 摘要：介绍了米曲霉的生物学特性，并综述了它在调味品、饲料、生产曲酸、消除乳糖不耐症、酿酒等方面的应用，提出了其发 展前景。 关键词：米曲霉；工业：应用；展望 1米曲霉的生物学特征 米曲霉CAs ) 是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，项囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形平滑，少数有刺，培养适温为37度。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤 维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸， 而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵业。 2米曲霉在工业上的应用 2．1用于发酵生产 豆豉、豆酱豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一，营养丰富，药食兼用，对我国人民的饮食文化和医疗保健发 挥着重大作用。在传统豆豉酿造工艺中，米曲霉酿造豆豉在我国应用最早、最广。《食经》等历史文献记载作豉法大都是米曲霉豆豉。当时先人们能够巧妙地控制米曲霉的最适温度，不超过37℃，“温如人腋下”，直到“后着黄衣，色均足”。由于没有显微镜，看不到微生物的个体形态，但能通过微生物的群体形态“黄农”来控制微生物的生长繁殖。成曲以米曲霉为主，兼有其它霉菌、酵母和细菌等稳定的群 体。随着科学发展，在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺，己达到相当高的水平，在生产实践中产生了良好的效果。 随着人们对食品的营养结构及保健性要求的提高，虽然酱具特有的色、香、味，然而已满足不了人民生活水平不断提高的需求。最近，日本研制了保健酱一荞麦豆酱，其除了含有17种氨基酸外，还含有 其它酱品没有的芦丁(2．4rag／lOOg)，在保持原有豆酱生理机能的同时，又增加了荞麦的保健性，是一种多功能的保健调味品。鞠洪荣等[3]研究表明，在传统工艺和日本工艺的基础上进行改进，即按一定比例如入米曲霉酿造的荞麦豆酱，酱香较浓，与传统豆酱相比具有独特的醇香味，且提高了营养价值和保健效果，有潜在的市场前景。 2．2与黑曲霉、绿色木霉复合发酵 用于酱油生产酱油酿造主要靠米曲霉的作用。在米曲霉生过程中能分泌多种酶系，其中最重要的是蛋白酶、淀粉酶和酯酶等。天然发酵酱油是利用蛋白酶的水解作用，将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性含氮物，且口味好，营养丰富，是营养性风味调料的发展方向[4]。而淀粉酶的作用是将制曲后原料中的淀粉或经糖化后糖浆中残留的淀粉进一步彻底糖化降解，糖化后生成的单糖类如葡萄糖、果糖、多缩戊糖等，对酱油的色、香、味、体有重要影响。因此，米曲霉所产淀粉酶的性质与酱油质量好坏密切相关。吕嘉枥等[5]对分离纯化的米曲霉(今野菌株)所产．淀粉酶进行了研究，探索出了该菌株产淀粉酶的培养温度和最佳培养时间。米曲霉酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率及产品的产率，影响酱油中可溶性含氮物的含量，从而也会影响酱油的品质；而米曲霉产孢子能力的强弱则会影 实验二柠檬酸发酵 【课前预习】 复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物分离工程所学到的微生物培养及生物物质分离的分离方法，了解影响微生物生长及生物物质提取过程中的各种影响因素。 【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。 2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况； 3. 通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验 得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。 【实验要求】 1. 10-15 人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。 2. 总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。 【实验原理】 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O 【实验用品】 1. 实验主要仪器设备 摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；析天平；蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫 米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提 高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病提供了线索。曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业1.1影响米曲霉系的因素 影响米曲霉酶系形成、作用的因素主要有： 1．曲料：曲料米曲霉的菌丝由多细胞组成，具有产酶功能，菌丝体在曲料上生长好坏直接关系到其酶系的形成和酶活性的强弱。酱油制曲过程的实质就是要创造米曲霉生长的最适宜条件，保证米曲霉充分发育繁殖，分泌出酿造酱油所需的各种酶类。所以制曲原料的选择、处理和配比要严格把关。曲料要以蛋白质含量较高、碳水化合物适量为原则进行选择配比。曲料的处理要注意以下几点：1。粉碎要适度。颗粒太粗，会减少米曲霉生长繁殖的总面积，降低酶活力；颗粒太细，润水后容易结块，蒸料时会产生夹心，导致制曲通风不畅，不利于米曲霉的生长。 2.蒸煮要适度。控制蛋白质的适度变性，蛋白质的变性过程对米曲霉生长极其重要。 3．温度酱油发酵的过程就是各种酶促反应的过程，温度越高，酶 目录 前言 (2) 设计方案的拟定 (3) （1）、机械搅拌生物反应器的型式 (3) （2）、反应器用途 (3) （3）、冷却水及冷却装置 (3) （4）、设计压力罐内0.4MPa；夹套0.25 Mpa (4) 表-发酵罐主要设计 (4) 工艺设计及计算 (5) （1）生产能力、数量和容积的确定 (5) （2）主要尺寸计算 (5) （3）冷却面积的计算 (6) （4）搅拌器设计 (6) （5）搅拌轴功率的计算 (7) （6）i求最高热负荷下的耗水量W (8) ii 冷却管组数和管径 (9) iii冷却管总长度L计算 (10) l和管组高度 (10) iv 每组管长 n (10) V 每组管子圈数 Vi 校核布置后冷却管的实际传热面积 (10) （7）设备材料的选择 (10) （8）发酵罐壁厚的计算 (11) （9）接管设计 (12) （10）支座选择 (13) 设计结果汇总 (14) 参考资料 (14) 发酵罐设计心得体会 (15) 附录及设计图 前言 生化工程设备课程设计是生物工程专业一个重要的、综合性的实践教学环节，要求我们综合运用所学知识如生化反应工程与生物工程设备课程来解决生化工程实际问题，对培养我们全面的理论知识与工程素养，健全合理的知识结构具有重要作用。在本课程设计中，通过生化过程中应用最 为广泛的设备，如机械搅拌发酵罐、气升式发酵罐、动植物细胞培养反应器，蒸发结晶设备、蒸馏设备等的设计实践，对我们进行一次生化过程发酵设备设计的基本训练，使我们初步掌握发酵设备设计的基本步骤和主要方法，树立正确的设计思想和实事求是，严肃负责的工作作风，为今后从事实际设计工作打下基础。 设计方案的拟定 我们设计的是一台25M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产味精。 设计基本依据 （1）、机械搅拌生物反应器的型式 通用式机械搅拌生物反应器，其主要结构标准如下： ①高径比：H/D=1.7-4.0 ②搅拌器：六弯叶涡轮搅拌器,D i :d i :L:B=20:15:5:4 ③搅拌器直径：D i =D/3 ④搅拌器间距：S=（0.95-1.05）D ⑤最下一组搅拌器与罐底的距离：C=（0.8-1.0）D ⑥挡板宽度：B=0.1D，当采用列管式冷却时，可用列管冷却代替挡板（2）、反应器用途 用于味精生产的各级种子罐或发酵罐，有关设计参数如下： ①装料系数：种子罐0.50-0.65 发酵罐0.65-0.8 ②发酵液物性参数：密度1080kg/m3 粘度2.0×10-3N.s/m2 导热系数0.621W/m.℃ 比热4.174kJ/kg.℃ ③高峰期发酵热3-3.5×104kJ/h.m3 ④溶氧系数：种子罐5-7×10-6molO 2 发酵罐6-9×10-6molO 2 ⑤标准空气通风量：种子罐0.4-0.6vvm 黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: O H O H C O O H C 27862612625.1+→+ 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料 ① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。 ③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 ④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2） 试剂黑曲霉发酵生产α-淀粉酶微生物实验报告
(完整版)年产5000吨糖化酶发酵车间设计
黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究及酶的纯化
米曲霉
两种曲霉糖化性质的比较
(整理)α-淀粉酶综述
米曲霉生产糖化酶工艺
大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
黑曲霉菌株发酵生产糖化酶发酵罐设计
黑曲霉生产糖化酶及酶活测定_单海艳
糖化酶
教案实验四 黑曲霉发酵生产柠檬酸
米曲霉在食品中的应用
实验三 柠檬酸发酵
米曲霉
发酵罐设计
实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸