黑胶虫作业

在细胞培养中常可见到一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在细胞及培养液中做不规则运动。镜下检查颗粒数目（100×），每视野计数在10个以上者就有可能使细胞生长受到影响。若培养过程中，其数量继续增多则可能导致细胞停止增殖继而死亡。人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。

近年来，黑胶虫在现代细胞培养中被广泛讨论，但大多数文献未对其进行描述或仅一带而过。从各个实验中发现，黑胶虫在不同条件或不同种类细胞的培养时对细胞培养的影响大小不一，但存在以下几个特点：（1）黑胶虫与细胞竞争生长，使细胞状态恶化甚至死亡，但不引起培养液浑浊；（2）多数情况下，抗生素对黑胶虫无效；（3）一般单用培养液及血清培养不会得到黑胶虫；（4）黑胶虫在培养体系中多做典型的布朗运动。

科学家们至今尚未对黑胶虫进行分类学上的归类，但对其身份有多种猜测。

一．非生物

有部分科学家认为，任何一种外来生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单的运动。如果黑胶虫的运动状况已达到用显微镜可观察到的程度，其营养代谢和能量需求也可想而知，那么，培养液中营养的消耗将加大、酸碱含量都将发生明显变化。比如出现迅速、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡，引发其他微生物侵染等。但这些状况在黑胶虫感染中很难观察到。因此，有科学家提出黑胶虫为非生物。

（1）细胞碎片说

在从37℃环境中取出细胞进行观察时，由于液体培养基比热大，液内环境高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，即出现观察到的“虫体”游动。同时随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂。破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和更多的残渣，即表现为“虫体”增多，同时细胞状态恶化甚至死亡。（2）无机物说

在1990年发表于细胞生物学杂志上的《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》中，青岛医学院肿瘤研究室指出，细胞培养中的黑色运动颗粒为硅复合物。该研究小组收集和实验了不同产地的小牛血清，以组织培养方式，通过能谱扫描电镜和电感耦合等离子发射光谱分析仪观察，用紫外分光及电泳透析进行生化分析。他们发现用各种杀灭微生物的方法都杀不死黑色颗粒。在光镜、透射和扫描电镜视野下，只能看到大小不等的颗粒，未见到细胞核、核膜、细胞器及绒毛等生物体结构。将牛血清中收集的运动颗粒分别洗涤后匀浆，进行紫外分光光度计测定，未见蛋白质吸收峰。能谱扫描电镜观察分析黑色颗粒是一种硅化合物，成分主要为硅，其次为钙和钾。电感耦合等离子发射光谱分析结果表明黑色颗粒可能来自于培养液对玻璃器皿的侵蚀，部分来源于培养细胞本身。

（3）血清聚合物产物

有人对Gibco公司的血清进行研究后认为，黑色颗粒为血清聚合产物，是血清灭活之后出现的类似絮状沉淀。

二．生物

黑胶虫一般出现在血清培养中，有时在一夜之间暴长，加入了各种抗生素也无济于事，即便冲洗后减少，但几天后依旧出现。这样反复的出现和活力让一些科学家认为黑胶虫是一种生物。但血清是经过0.1μm滤膜过滤的，一般不存在细菌、霉菌或支原体。基于这些考虑，科学家们对黑胶虫的身份有以下几个猜测。

（1）寄生性原虫

有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到黑胶虫有两种不同的形态，一种很大，运动较慢，泛红光，另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。在本研究中，也有人对无细胞的血清进行培养，并发现4周后视野内均为黑煤

渣般的黑胶虫。而中国病毒所和军科院均鉴定黑胶虫是一种寄生与牛血清内的原虫，与草履虫有一定的相似，但研究课题经费不足，而未继续。

（2）纳米细菌

纳米细菌是一种细胞内存在的原核生物，能通过100nm滤菌器，属于革兰阴性菌，在高温、高酸等极端条件下仍能存活，不能用普通微生物培养液或支原体培养基培养，但能用细胞培养基培养，通常细菌染色方法难以着色。但从另一方面看，纳米细菌在适宜的条件下可以在固体培养基中生长，并形成直径1mm大小的细菌集落，而黑胶虫无法单独培养之集落。黑胶虫是否为纳米细菌还有待证实。

黑胶虫到底是否为生物？到底是何种生物？这些问题一种困扰着细胞培养者，但是科学家们依旧坚持不懈的寻找去除黑胶虫的方法，期望得到清洁、生长良好的细胞。在去除黑胶虫方面，科学家们提出了下面几种解决措施：

（1）新洁尔灭（苯扎溴铵）处理

实验人员取有黑胶虫污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向污染孔内分别加入不同浓度的新洁尔灭原液，并在倒置显微镜下观察。他们发现，加入新洁尔灭时，培养液内逐渐浑浊，并有絮状物质形成，此时可观察到黑胶虫逐渐停止运动。但考虑到新洁尔灭有可能影响细胞的生长，该实验组认为，在对待并不十分珍贵的细胞时，可以尝试用新洁尔灭进行处理。（2）选择优质血清

最好选择进口血清，但也有外国血清会出现黑胶虫。当使用外国血清，特别是Hyclone 或Gibco的血清可不必灭活。因为Invitrogen公司在其血清说明书上解析道：经过正确处理的热灭活血清，对大多数细胞而言是不需要的，却会形成很多的沉淀物。在对血清的处理方面，应逐级冻融，按照-20℃~4℃完全融化后，再置入水浴中，与室温一起升高到56℃，以防温度骤变，导致血清中营养物质丧失活性。同时将血清分装保存，减少冻融次数。（3）换用进口一次性塑料培养瓶

（4）洗涤细胞

对于贴壁细胞，用无菌PBS洗涤几次，可在一定程度上缓解黑胶虫。对于悬浮细胞，可向其中加入少量滋养细胞，如小鼠腹腔巨噬细胞以吞噬黑胶虫。对于特别珍贵的细胞，可以将污染的细胞接种到免疫缺陷小鼠体内，一段时间后再取出重新克隆化。如要换液，最好在换液前先加入生理盐水轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗涤，并在传代时加生理盐水再离心，加大接种密度。

（5）使用抗生素

根据药敏试验结果选择对细胞状态影响较小的抗生素。有人推荐两种抗生素联用，但并未验证此方法有效性。

（6）注意操作

有时黑胶虫可能只是细胞培养过程中出现的细菌、真菌或支原体等的污染或是细胞状态不好时的细胞碎片，但实验者并未加以区分和确认，只是归咎于黑胶虫这一“不可抗力”。也许只是担忧过甚，但依旧有人认为黑胶虫快成了科研中的迷信，是某些科学家轻易用一个不知道是什么的东西试图解释实验现象的一个借口。真正该做好的是实验过程中对各个操作和材料的污染的控制。

就我们自己而言，在实验过程中，要加强自己的责任心，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。操作时要常更换吸管，切勿一根吸