《基因工程》PPT课件

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逆转录过程中cDNA的合成
依赖RNA的 DNA聚合酶
核糖核酸酶 H活力
依赖DNA的 DNA聚合酶
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Trizol试剂
Trizol的主要成分是苯酚。 苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋 白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变 性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此 Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯 基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
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※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase，与氯 仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋 白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构 消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分 离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白 质中的二硫键。
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基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体中 分离克隆目的基因。
一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：
一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生 物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型 从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；
另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接
合成目的基因，然后将之克隆表达。
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第二节 核酸的提取及检测
就基因工程而言，核酸 分子是其研究所涉及的主 要对象，所以核酸的分离 与提取是研究中很重要的 基本技术。
核酸样品的质量将直接 关系到实验的成败。
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1. 基因组DNA的分离与纯化
DNA主要存在于细胞核的染色体中。
核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA）， 叶绿体DNA（cpDNA），
利用第一链在反转录酶作用下产生的 cDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解 mRNA），而是在dNTPs存在下，利用RNA酶H 在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链 的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成 第二链。
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cDNA第二链的合成方法－置换合成法
Trizol法提取总RNA的实验原理：
Trizol试剂裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA 与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机 层。
RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后， RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以 沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在 有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
也称为分子克隆技术, 基因克隆或基因工程 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元
素。
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基因工程的操作过程
酶切
连接
重组DNA导入受体菌 转化
目的基因的获取 克隆载体的构建 外源基因与载体的连接 （体外重组）
检测
扩增
克隆基因的表达
转建化筑精子选的课筛件 选和鉴定
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目的基因的克隆：
质粒DNA。
总的原则:
保证一级结构的完整性;
排除其它分子的污染;
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一般步骤:
(1) 破碎细胞，裂解细胞壁
机械方法: 超声波处理、研磨、 匀浆
化学方法: SDS（阴离子去垢剂）
EDTA，使得DNase失活(why?)
酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶
(2) 通过蛋白质变性或分解，使 DNA游离出来
(3) 分离DNA
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2. cDNA的分离与纯化
（1）总RNA 的提取
RNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广
RNase的来源
外源：操作者，实验器皿，试剂，空气
内源：不同组织和细胞数量不同
创造无RNase的环境
—DEPC(焦碳酸二乙酯)（配成0.1%的DEPC 水）
—异硫氰酸胍
Trizol试剂
干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 白细胞介素
抗病毒感染及某些肿瘤 激活、剌激各类白细胞
超氧化物歧化酶
抗组织损伤
单克隆抗体
诊断试验、肿瘤导向治疗
乙肝疫苗(CHO, 酵母)
预防乙肝
口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 建筑预精选防课霍件 乱
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第一节 重组DNA技术的原理
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因 与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物 体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表 达出新产物或新性状的DNA体外操作过程。
G 5‘ppp’5G 5’
RNaesH
5’
S1 5’ 3’
AAAAAAAAAAAAAAOH TTT3T’ TTTTTTTTTTp DNApol dNTPs 5’
AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp
5’ TTTTTTTTTTTTTTOH AAA3A’ AAAAAAAAAAp T4-DNA ligase 5’
TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’
该方法使用较多建筑精选课件
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3. 质粒DNA的分离与纯化
质粒（plasmid）: 指细菌细胞质中独立于 细菌染色体之外能自主复制的遗传单位
共价闭合环状 质粒DNA的分离：细菌培养和质粒DNA扩
增；细菌菌体的裂解；质粒DNA的分离
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（2）第一链的合成
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（3）第二链的合成
➢ cDNA第二链的合成方法——自身引导法
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自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割
发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5’端序列
出现缺失和重排，因而该建方筑精选法课件 目前很少使用。
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➢ cDNA第二链的合成方法－置换合成法
第七章 基因工程 (gene engineering)
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重组DNA医药产品
产品
功能
组织胞浆素原激活剂
抗凝
血液因子VIII
促进凝血
颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成
促红细胞生成素
剌激白细胞生成
生长因子(bFGF, EGF) 生长素 胰岛素
刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病
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质粒DNA的提取——碱裂解法的原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA 为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生 变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复 其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合 形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解 状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。